L’analisi della viremia e del pro virus dell’HIV-1 rivelano una nuova fonte di viremia residua nei pazienti in trattamento antiretrovirale

L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1
RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA
1
NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE

INTRODUZIONE
Il successo nel trattamento antiretrovirale ad alta attività (HAART) dell’HIV riduce il virus libero nel sangue a
livelli non determinabili dai più sensibili test clinici. Nondimeno, l’HIV persiste come pro virus latente,
all’interno dei CD4 memoria quiescenti2 e forse in altri tipi di cellule.

I reservoir latenti nelle cellule CD4 rappresentano una barriera all'eradicazione a causa della loro lunga emivita e
perché colpire e liberare questi reservoir è intrinsecamente difficile.

In aggiunta ai reservoir latenti nei CD4 quiescenti, i pazienti in HAART hanno anche una ridotta quantità di
virus libero nel plasma, a livelli al di sotto del limite di sensibilità degli esami clinici attuali. Poiché il virus
libero ha un’emivita breve, la viremia residua è indicativa di una produzione virale attiva. La continuata presenza
di virus libero nel plasma dei pazienti in HAART può indicare sia una replicazione in corso, sia il rilascio del
virus da CD4 infetti latenti riattivati, sia il rilascio da altri reservoir cellulari o combinazioni di questi
meccanismi.

Scoprire la sorgente cellulare della viremia residua è importante perché ciò identificherà le cellule che sono
ancora in grado di produrre il virus nei pazienti trattati con la HAART, cellule che devono diventare l'obiettivo
di ogni sforzo di eradicazione.

L’analisi dettagliata della viremia residua è stata resa difficile da sfide tecniche collegate al dover lavorare con
concentrazioni molto basse di virus, ma recentemente nuovi risultati sono stati ottenuti attraverso il
campionamento intensivo di pazienti e metodi di sequenziamento ultrasensibili. In un sottogruppo di pazienti la
maggior parte della viremia residua consisteva di un piccolo numero di cloni virali prodotti da un tipo di cellule
fortemente sottorappresentate nella circolazione periferica. Questi cloni virali - definiti PPC, cloni plasmatici
predominanti – persistono immutati per estesi periodi di tempo3.

La persistenza di questi PPC indica che in alcuni pazienti potrebbe esserci un'altra fonte cellulare di viremia
residua. In ogni modo, i PPC sono stati osservati in un piccolo gruppo di pazienti che avevano iniziato la terapia
partendo con una conta dei CD4 molto bassa, e non è perciò chiaro se questo fenomeno sia presente anche al di
fuori di questo tipo di pazienti. Molto più importante, è che non era chiaro se davvero la viremia residua
generalmente consistesse di distinte popolazioni virali prodotte da diversi tipi cellulari.

1 Articolo originale: Analysis of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Viremia and Provirus in Resting CD4+ T Cells Reveals a Novel Source
of Residual Viremia in Patients on Antiretroviral Therapy, Timothy P. Brennan, John O. Woods, Ahmad R. Sedaghat, Janet D. Siliciano, Robert F.
Siliciano, and Claus O. Wilke. JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2009, p. 8470–8481 Vol. 83, No. 17. Per acquistare la versione integrale su
internet: http://jvi.asm.org/cgi/content/abstract/83/17/8470 Traduzione e adattamento ai sensi del comma 1 dell’Art. 70 Legge 633/1941: Il
riassunto, la citazione o la riproduzione di brani o di parti di opera e la loro comunicazione al pubblico sono liberi se effettuati per uso di critica o di
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dove non indicata la fonte (Wikipedia o altre risorse internet), le note sono di GexGex. Scarica questo PDF da http://www.slideshare.net/hivforum
2 Sono i CD4 che possono vivere fino a 40 anni e che si riproducono molto poco
3 Quindi potrebbero provenire da CD4 di lunga memoria oppure da altre fonti ancora non identificate di viremia residua

L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA

Poiché l'infezione da HIV nella maggior parte dei pazienti deriva da un singolo clone virale4, con susseguente
diversificazione, la presenza di popolazioni geneticamente distinte del virus in un singolo individuo può riflettere
l'ingresso del virus in compartimenti5 dove la replicazione si verifica con mescolamenti intercompartimentali
limitati. Test genetici sofisticati possono determinare la struttura di questa popolazione6 in un campione di
sequenze virali. Usando due test complementari di struttura della popolazione, abbiamo analizzato le sequenze
virali da sorgenti multiple in pazienti singoli in modo da determinare se ci fosse una sorgente diversa dai CD4
quiescenti circolanti a contribuire alla viremia e alla persistenza virale. I nostri risultati hanno importanti
implicazioni cliniche per la comprensione della persistenza dell'HIV e del fallimento del trattamento e per il
miglioramento delle strategie di eradicazione che attualmente si concentrano solo su reservoir latenti dei CD4.

MATERIALI E METODI
*** omissis ***

RISULTATI
I pro virus presenti nelle cellule CD4 circolanti attivate e quiescenti appartengono a una popolazione
mista. Abbiamo per prima cosa condotto un test per la presenza di strutture di popolazione in set di sequenze pro
virali derivate dalle cellule CD4 circolanti attivate e quiescenti. Poiché queste cellule rappresentano una singola
popolazione di cellule nei suoi differenti stadi di attivazione, non è atteso che vi siano popolazioni geneticamente
distinte di pro virus a meno che i CD4 attivati non siano stati infettati de novo da un virus di altra origine.

Per valutare la struttura di popolazione abbiamo usato due test complementari7, il test SM8 e il test AMOVA9,su
set di dati pubblicati e di nuovo acquisto.

Il test SM valuta se le sequenze10 appartenenti a due o più gruppi sono distribuite casualmente lungo i rami di un
albero filogenetico11,12 che comprenda tutte le sequenze. Abbiamo usato due metodi di ricostruzione
filogenetica, quella ML13 classica e quella Bayesiana14 Nella maggior parte dei casi entrambi i metodi
restituivano alberi d’identica topologia, con differenze minori nella lunghezza dei rami. La figura 1 mostra
alberi ML consistenti di sequenze pro virali derivate da CD4 attivati e quiescenti provenienti da un paziente con

4 il primo virus quando si ha il contagio
5 La compartimentalizzazione cellulare è un sistema per ottimizzare le risorse cellulari, La compartimentalizzazione è uno degli ingredienti fondamentali
della vita. Essa rappresenta il processo mediante il quale una serie di segnali biologici viene isolata dal contesto formando un aggregato di segnali;
tale aggregato assumerà una propria identità. La compartimentalizzazione è alla base dell’origine della vita. Secondo Shuster ed Eigen (Eigen 1979)
essa può essere stata la sola causa della formazione di ipercicli di RNA all’interno di brodi primordiali. Secondo questi due Autori, coppie di RNA
possono essersi complementarizzate per via della grande possibilità combinatoriale offerta dal brodo primordiale. Ma se due filamenti di RNA, che
casualmente si ritrovano nel brodo, riescono a catalizzare la replicazione di un terzo filamento, allora è possibile che si venga a generare un grosso
ciclo di relazioni fra coppie di RNA (http://www.functional-genomics.it/center/Downloads/ModelliDellaMente27Marzo2008.pdf) Sulla
compartimentalizzazione dell’HIV vedi anche: www.unicef.it/flex/cm/pages/ServeAttachment.php/L/IT/D/D.ff4b4ff3d012fbf1fbd2/P/BLOB:ID%3D4328.
6 La “struttura” mostra come è composta una “popolazione”, facendo un paragone con una popolazione animale: rapporto tra sessi, rapporto tra le classi

di età, numero piccoli per femmina…, quindi per un virus indica come la “popolazione” complessiva del virus è composta.
7 questi due test consistono nell’analizzare la sequenza di un gene e confrontarlo con una scala di valori per vedere se le variazioni corrispondono alla

stessa popolazione virale o a popolazioni virali diverse.
8 Slatkin-Maddison test, determina il numero minimo di eventi di migrazioni tra le popolazioni separate coerenti con la struttura di un albero filogenetico.

Il supporto statistico è basato sul numero di eventi di migrazioni che potrebbero essere attesi in una popolazione strutturata casualmente, derivato
permutando le sequenze tra i compartimenti. (Internet)
9 Analysis of molecular variance (AMOVA), un modello statistico per le variazioni molecolari in una singola specie, tipicamente biologica. Il metodo è

stato sviluppato da Laurent Excoffier presso la Rutgers University nel 1992.
10
Del gene, ossia del pezzetto di RNA virale.
11 In questo caso: sono quei diagrammi che permettono di risalire al progenitore comune a tutte le popolazioni virali.
12 Definizione generale: un Albero filogenetico è un diagramma che mostra le relazioni di discendenza comune di gruppi tassonomici di organismi. La

rappresentazione delle relazioni in questa forma è tipica della visione evoluzionistica, secondo la quale lo sviluppo delle forme di vita è avvenuto a
partire da un progenitore comune (il tronco o la base dell'albero, altrimenti detta radice), il quale ha dato origine per speciazione a diverse linee di
discendenza, fino ad arrivare alle specie attualmente esistenti (le cime dell'albero, altrimenti dette ramificazioni terminali). In un albero filogenetico,
ciascun nodo (o biforcazione) rappresenta l'antenato comune più recente dei soggetti che si trovano ai nodi successivi e la lunghezza delle
ramificazioni può -o meno- essere correlata al tempo o ai cambiamenti genetici che intercorrono tra di essi. (Wikipedia)
13 Massima Verosimiglianza, cerca il modello evolutivo, albero compreso, che ha la massima verosimiglianza rispetto alla produzione delle sequenze

osservate, http://biochimica.unipr.it/biocomp/alberi_filogenetici.pdf, http://www.bio.disco.unimib.it/~mauri/download/Lez11Filog.ppt,
14 Sono semplici osservazioni delle due sequenze: quelle più simili sono considerate attendibili

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un PPC definito [figura 1/a] e da un paziente senza un PPC [figura 1/b]. Entrambi gli alberi mostrano l’evidenza
di un mescolamento tra sequenze pro virali derivate da CD4 attivati e quiescenti, al di fuori di ogni ovvia
struttura a livello di popolazione15

Risultati simili sono stati ottenuti per altri pazienti, come si può vedere nelle figure supplementari S1 a→e e S1 g
(http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1).

figura 1/a

I risultati dal test SM erano coerenti con la natura mescolata delle sequenze illustrate nelle filogenie ricostruite.
In tutti i pazienti tranne uno non abbiamo potuto respingere l’ipotesi nulla16 che non esistesse struttura di
popolazione tra i due gruppi di sequenze (tabelle 1 e 2)17

15 Cioè sono popolazioni diverse.

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L’albero filogenetico per il paziente J2, il solo paziente per il quale potessimo respingere l’ipotesi nulla,
conteneva un clade18 di sequenze di virus libero nel plasma prive di ogni sequenza pro virale, così come clade di
sequenze pro virali prive di sequenze di virus libero nel plasma19 (figura S1f nel materiale supplementare20)

Nondimeno, questa struttura era atipica. Per tutti gli altri pazienti, l’analisi filogenetica mostrava una mancanza
di struttura compartimentalizzata. Simili risultati erano ottenuti quando il test SM era condotto usando
filogenesi21 costruite con il metodo di inferenza Bayesiano (tabelle 1 e 2).

Poiché il test SM si basa sulle filogenie, che sono difficili da stimare in situazioni di bassa diversità e possibile
ricombinazione22 abbiamo anche incluso un test di struttura di popolazione indipendente dalla filogenia, un
AMOVA basato sulla distanza genetica. Questo test analizza la variazione molecolare all’interno e tra i gruppi,
in una struttura di analisi nidificata di varianza23. I risultati del test AMOVA corrispondevano a quelli dei test
SM. Per tutti i pazienti, tranne il paziente J2, l’ipotesi nulla di nessuna struttura di popolazione non poteva essere
respinta (tabelle 1 e 2). In altre parole, le sequenze pro virali derivate dai CD4 circolanti attivati e a risposo in un
paziente tipo comprendono una popolazione geneticamente mescolata, senza una struttura significativa. Questo
risultato è coerente con la biologia conosciuta di queste cellule24.

I pro virus derivanti dalle cellule CD4 circolanti quiescenti e il virus plasmatico rappresentano distinte
popolazioni genetiche nella maggior parte dei pazienti. Per valutare la presenza di strutture di popolazione tra il
virus libero nel sangue e il pro virus derivato dalle cellule CD4 quiescenti, abbiamo condotto gli stessi test sopra
descritti. La figura 3 mostra gli alberi ML di sequenze pro virali derivate da CD4 quiescenti e da virus nel
plasma da un paziente con PPC definito (fig. 3/a) e da un paziente senza un PPC (figura 3/b).

Un PPC era stato precedentemente definito come sequenza clonale derivata dal virus plasmatico che
rappresentasse >50% del totale delle sequenze di virus plasmatico, rappresentando allo stesso tempo <1% del
totale delle sequenze pro virali ottenute dai CD4 circolanti. In entrambi i casi, alcune delle sequenze
plasmatiche erano identiche a sequenze trovate nei reservoir dei CD4. Per questo motivo, almeno parte del virus
plasmatico potrebbe essere stato prodotto dai CD4 infetti latenti una volta attivati. Nondimeno, entrambi gli
alberi rivelano una tendenza di parte del plasma e dei reservoir a separarsi fra loro, in contrasto col modello
completamente mescolato osservato per il pro virus nei CD4 attivati e quiescenti25.

L’analisi SM ha rivelato una significativa struttura di popolazione tra le due sorgenti di virus in tutti i pazienti
tranne due: il paziente 134 e il paziente 202 (tabella 2 e figura 2).

16 Un'ipotesi nulla (letteralmente dall'inglese "ipotesi zero") è un'affermazione sulla distribuzione di probabilità di una o più variabili casuali. Nel test
statistico viene verificata in termini probabilistici la validità di un'ipotesi statistica, detta appunto ipotesi nulla, di solito indicata con H0. Attraverso una
funzione dei dati campionari si decide se accettare l'ipotesi nulla o meno. Nel caso l'ipotesi nulla venga rifiutata si accetterà l'ipotesi alternativa,
indicata con H1. Se si rifiuta un'ipotesi nulla che nella realtà è vera allora si dice che si è commesso un errore di prima specie. Accettando invece
un'ipotesi alternativa falsa si commette un errore di seconda specie. (Wikipedia)
17 Qui gli Autori intendono che si tratta di due popolazioni virali diverse e che quindi vi sono nel paziente due popolazioni virali geneticamente diverse;

questo può essere spiegato in vari modi: o quello dei CD4 a lunga memoria (non essendo questi molto attivi nel riprodursi, il virus potrebbe essere
rimasto praticamente intatto e uguale al primo clone che ha contagiato), oppure esiste un’altra zona di accumulo virale diversa dai CD4 di memoria e
CD4 normali.
18 Un clade è definito come un gruppo tassonomico di organismi costituito da un antenato singolo comune e tutti i discendenti comuni a quell'antenato.

Qualsiasi gruppo che corrisponde alla definizione viene considerato monofiletico e può essere rappresentato sia da un'analisi filogenetica, o da
un cladogramma. (Wikipedia)
19 Cioè aveva due virus completamente differenti che non venivano da un genitore comune, questo potrebbe essere stato causato anche da una

reinfezione con rapporti a rischio...
20 http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1
21 La Filogenesi o filogenetica o filogenia, (dal greco φυλή (classe", "specie) e Γένεσις ("nascita", "creazione", "origine"), è lo studio dell'evoluzione della

vita. È uno strumento fondamentale della sistematica che si occupa di ricostruire le relazioni di parentela evolutiva, di
gruppi tassonomici di organismi a qualunque livello sistematico. (Wikipedia)
22 Vuol dire che essendo piccolissimi pezzetti di virus non tanto diversi fra loro allora ci possono essere dei mescolamenti di pezzetti per cui per

escludere questo hanno fatto un altro test genetico detto di distanza (cioè hanno valutato quanta possibilità ci sia che i due pezzetti appartengano allo
stesso virus o no).
23 Media degli scarti al quadrato, è un indice statistico per vedere quanto due cose sono simili fra loro.
24 Cioè col fatto che esistono due CD4 che si comportano in maniera completamente diversa: uno dormiente e uno attivo.
25 Nelle provette invece i virus si mescolano: se si mescolano vuol dire che sono molto simili fra loro.

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Per i pazienti 134 e 202 gli alberi filogenetici mostrano un modello di mescolamento tra sequenze pro virali e
sequenze di virus plasmatico non dissimili dal modello che abbiamo trovato per le sequenze pro virali derivate
dai CD4 attivati e quiescenti26 (cfr. fig. S1k e S1L nel materiale supplementare27)

In ogni modo, per tutti i restanti pazienti, gli alberi filogenetici mostrano sequenze pro virali e plasmatiche
segreganti. (cfr. fig. 3 e fig. S1h J e S1m s nel materiale supplementare28). I risultati non sono stati
influenzati dal metodo di ricostruzione filogenica (tabella 2).

I risultati del test AMOVA erano anch’essi coerenti con quelli del test SM (tabella 2 e figura 2). Presi insieme,
questi dati suggeriscono che la viremia residua sia compartimentalizzata e includa una o più popolazioni
virali che sono geneticamente distinte dai pro virus nelle cellule CD4 quiescenti.

In un sottogruppo di pazienti in HAART, la viremia residua è dominata da un PPC. I PPC sono stati individuati
in 6 dei 13 pazienti studiati (tabella 2). Ci si potrebbe attendere che la presenza di un PPC influenzi l’analisi di
una struttura di popolazione. Infatti, per il gene RT nei pazienti con PPC, il test AMOVA ha rilevato che tra il
10% e il 40% di tutte le variazioni molecolari erano tra i gruppi (cioè distinte tra sequenze pro virali e
plasmatiche), mentre tra il 60% e il 90% di tutte le variazioni molecolari era divisa tra i due gruppi di sequenze
(tabella 2). Per il gene RT in pazienti senza PPC, dall’altro lato, la variazione tra gruppi era solo del 2-3%. (nel
paziente 134, la variazione percentuale tra popolazioni è negativa. Percentuali negative possono registrarsi in
AMOVA, ma di solito coincidono con valori di P non significativi29). In contrasto, per il gene Env, l’assenza di
un PPC sembra aumentare piuttosto che diminuire la variazione percentuale tra le popolazioni30 (tabella 2)

Per determinare fino a quale estensione i PPC influenzassero l’analisi e determinare se sequenze plasmatiche
diverse da PPC fossero geneticamente distinte dalle sequenze nei CD4 quiescenti abbiamo applicato le nostre
analisi a dataset privati di tutti i PPC31 (tabella 4). Abbiamo scoperto che anche se i PPC influenzano la nostra
analisi, nella maggior parte dei pazienti restano significative strutture di popolazione anche dopo la rimozione di
tutte le sequenze di PPC. Per il test SM, in tutti i pazienti tranne il paziente 113, possiamo respingere l’ipotesi
nulla che non ci sia una struttura di popolazione dopo la rimozione dei PPC (tabella 4).

26 Cioè in questi pazienti i virus si mescolano.

29 Valore p (o P-Value) è detto il minimo livello di significatività. In statistica inferenziale quando si fa un test di verifica d'ipotesi si fissa un livello di
significatività, generalmente indicato con α, che determina la regione di rifiuto per l'ipotesi nulla. Generalmente si fissa α = 0,05 (5%), o α = 0,01 (1%).
Con i dati campionari si esegue il test e si valuta se il suo valore cade nella regione di rifiuto e nella regione di accettazione. Se, ad esempio, cade
nella regione di rifiuto si dice che il test è significativo al 5% (o 1% a seconda del valore di α). Alle volte è bene non limitarsi a fornire una indicazione
sintetica dell'esito dell'esperimento (del tipo significatività o non significativo), ma dare un'indicazione più analitica così da mettere in condizione altre
persone, che non hanno eseguito il test, di valutare come/per quanto abbiamo ritenuto di rifiutare o accettare il test. Il valore p è appunto un indicatore
della plausibilità dell'ipotesi nulla, e si definisce come: il minimo livello di significatività α del test per il quale si rifiuterebbe l'ipotesi nulla. Ecco che si
capisce il perché il valore-p venga anche chiamato: “livello di significatività osservato” (Wikipedia).
30 Vuol dire che alcuni geni virali sono gli stessi fra tutte le popolazione cellulari tipo RT mentre altri tipo ENV (quelli dell’involucro) sono diversi fra le

diverse popolazioni.
31 Hanno confrontato con altri PPC.

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Il set di dati del paziente 113 aveva il minor numero di sequenze, e il cambiamento di risultato per questo
paziente, poteva semplicemente riflettere la mancanza di potenza statistica32,33

Nelle analisi col test AMOVA, tutti i pazienti tranne due (il 113 e il 209) mostravano ancora una significativa
differenza dopo avere rimosso il PPC. La rimozione dei PPC portava a una riduzione nella variazione intra
popolazione tra il 10 e il 30% per il gene RT e tra il 5 e il 6% per il gene Env. Sorprendentemente, per il gene
RT, la variazione tra popolazione per i pazienti 139, 148, 154 dopo la rimozione del PPC eccedeva ancora la
variazione tra popolazione di ciascuno dei pazienti senza PPC. Prendendo i risultati tutti insieme, abbiamo
trovato un coerente pattern di virus plasmatico e di pro virus dai CD4 quiescenti, mostrando una struttura di
popolazione significativa nella maggioranza dei pazienti, senza riguardo della presenza o meno di PPC né del
gene sequenziato34.

Precedenti studi hanno dimostrato che l’insieme dei CD4 quiescenti che danno rifugio al DNA dell’HIV consiste
di un misto di pro virus competenti per la replicazione e di pro virus difettosi, con i precedenti (cioè quelli
difettosi) che rappresentano solo una piccola frazione del totale. Perciò potrebbe essere possibile che la
popolazione di virus plasmatico appaia geneticamente differente dalla popolazione totale di pro virus integrati,
mentre possa apparire allo stesso tempo simile alla piccola frazione di virus capaci di replicarsi35.

Siamo stati in grado di esaminare questa possibilità usando sequenze di virus competenti per la replicazione36
ottenute da un paziente estensivamente caratterizzato, il 154. Abbiamo scoperto che due popolazioni
potenzialmente distinte (pro virus totalmente integrato e pro virus integrato competente per la replicazione)
sembrano appartenere a una popolazione mescolata di pro virus (cfr. tabella S1 nel materiale supplementare37).
Inoltre, i nostri risultati, quando confrontavamo il virus plasmatico con la popolazione totale dei pro virus
integrati (tabella 2) erano quasi identici ai nostri risultati quando confrontavamo il virus plasmatico con il solo
sottogruppo del virus capace di replicarsi38 (cfr. tabella S1 nel materiale supplementare39).

Nella nostra analisi della struttura di popolazione tra virus plasmatico e pro virus derivato dai CD4 quiescenti
circolanti, abbiamo combinato campioni ottenuti in momenti diversi. Perciò la nostra analisi di questa relazione
riflette un campionamento di medie temporali da questi compartimenti. Per determinare se potessimo
considerare il nostro data set come temporalmente omogeneo, lo abbiamo testato per verificare la presenza o
assenza di strutture temporali di popolazione nei diversi pazienti. Non abbiamo trovato evidenza di strutture di
popolazione quando abbiamo confrontato le popolazioni pro virali da differenti posizioni temporali (dati non
mostrati); nondimeno, abbiamo trovato evidenze di strutture di popolazione quando abbiamo confrontato le
popolazioni del virus plasmatico da differenti posizioni temporali40 (dati non mostrati).

In aggiunta al confrontare virus plasmatici e pro virus derivati da CD4 quiescenti, per un paziente (154) siamo
stati anche in grado di confrontare virus plasmatici e pro virus derivati da CD4 attivati, monociti e cellule
mononucleari del sangue periferico (PBMC). Le nostre analisi hanno rivelato che il virus plasmatico residuo

32 In poche parole per questo paziente non c’è significatività statistica.
33 La misura della potenza fornisce un criterio di discriminazione tra test diversi per saggiare la stessa ipotesi: è opportuno preferire il test con la
maggiore potenza statistica. Il calcolo della potenza è inoltre alla base della procedura per definire la dimensione campionaria necessaria ad uno
studio. La potenza statistica dipende dal numero di eventi che si verificano in uno studio e dal numero di soggetti inclusi nel campione. Quanto più
uno studio è dotato di potenza, tanto meno probabile è il rischio di commettere un errore di secondo tipo, giudicando non significativa una differenza
invece esistente.
34 Gli Autori continuano a dire la stessa cosa cioè che esistono due popolazioni virali diverse in tutti i pazienti tranne il 113 e il 209, ma forse solo perché

i dati non hanno significatività statistica.
35 Vuol dire che non tutti i pezzetti di DNA virale che ci sono nei CD4 sono buoni, una parte di questi contengono molti errori che non gli permettono di

formare un virus completo e adatto a riprodursi, perciò sono stati trovati pezzetti nel sangue che non sono molto simili al virus che riesce a replicarsi, e
questi potrebbero essere i virus difettosi. E’ chiaro che un virus che si replica moltissime volte genera anche tanti errori che poi muoiono naturalmente
ma e’ il prezzo da pagare per sopravvivere agli attacchi del sistema immunitario, infatti nelle tante mutazioni ve ne sono alcune che riescono a
ingannare il sistema immunitario e riprodursi.
36 Cioè un virus che si replica e che non ha molti errori.
38 Cioè il paziente 154 conferma in pieno lo studio infatti i due virus sono completamente diversi: il pro virus e il virus buono che si replica.
40 Ossia hanno preso campioni in periodi di tempo diversi per vedere se venivano confermati i dati, e sono stati confermati.

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forma una popolazione significativamente distinta da tutte queste altre sorgenti cellulari in questo paziente41
(tabella 3).

Ancora, per determinare l’estensione con la quale i PPC stavano influenzando i risultati di queste analisi,
abbiamo ripetuto tutte le analisi con tutti i PPC rimossi (tabella 4). La tabella 4 mostra che, in tutti gli scenari
tranne uno (test SM che confronta il virus plasmatico al pro virus da CD4 attivati). I risultati restavano
significativi. Le analisi col test AMOVA trovavano una significativa struttura di popolazione per tutti gli scenari
(tabella 442). Presi insieme, questi risultati sono anche largamente coerenti, indipendentemente dalla presenza o
assenza di un PPC.

DISCUSSIONE
C'è un grande interesse sulla natura dei virus dell'HIV che persistono nei pazienti in trattamento con la HAART
e che causano la moltiplicazione della viremia dopo l'interruzione del trattamento. Precedenti studi hanno
confrontato questo rimbalzo della viremia nei pazienti dopo l'interruzione della HAART rispetto ai pro virus nei
reservoir delle cellule CD4 quiescenti. Purtroppo gli studi sulla moltiplicazione della viremia soffrono del fatto
che il virus che inizialmente si moltiplica quando il trattamento è interrotto in un certo momento può essere
differente dal virus che si sarebbe moltiplicato se il trattamento fosse stato interrotto in un momento successivo.
In altre parole la moltiplicazione della viremia potrebbe riflettere l'attivazione stocastica43 di alcuni reservoir
stabili44.

In aggiunta, la moltiplicazione della viremia non può essere attribuito a una particolare fonte cellulare senza un
campionamento estensivo di entrambi i compartimenti e rigorose comparazioni genetiche, caratteri questi che
sono assenti dagli studi precedenti45.

Un più esauriente approccio alla comprensione della persistenza virale tende a esaminare la natura dei virus
liberi che continuano ad essere prodotti nei pazienti in trattamento antiretrovirale e a confrontare le
caratteristiche di questa viremia residua con i reservoir cellulari conosciuti46.

Abbiamo inserito la genetica delle popolazioni [virali] in una struttura statistica per analizzare sistematicamente
la relazione tra virus plasmatico e pro virus nei CD4 quiescenti nei pazienti in HAART.

Abbiamo scoperto che in tutti i pazienti tranne due il virus residuo libero nel plasma era, in generale,
geneticamente diverso dalle sequenze pro virali delle cellule CD4 quiescenti. In contrasto le sequenze pro virali
derivate dalle cellule CD4 quiescenti e attivate comprendevano una popolazione geneticamente mista.

Uno studio recentemente pubblicato ha trovato risultati simili, usando il test SM per mostrare una significativa
compartimentalizzazione tra le sequenze virali plasmatiche e quelle derivate dai CD4. Nel nostro lavoro
abbiamo preso di mira un certo numero di questioni non risolte in quello studio.

In primo luogo, ogni volta che si amplifichi un virus da un paziente con una bassa viremia, si dovrebbe essere
consapevoli del possibile ricampionamento47 della Reazione a catena della polimerasi48,

41 Cioè CD4 attivati monociti e PBMC hanno stessa popolazione virale diversa dal virus plasmatici residuo (cioè quello dei reservoir)
42 La Tabella 4 illustra altri esami per confermare la stessa cosa (l’esistenza di due diverse popolazioni virali).
43 Casuale.
44 Cioè quando si sospende la HAART si potrebbe avere un virus diverso nel sangue che è quello dei reservoir.
45 Cioè quando la viremia si alza, ciò non dipende solo da una popolazione virale ma da più popolazioni.
46 Ossia: bisogna continuare a studiare questi virus residui e capire da dove vengono.
47 Cioè questa tecnica fa degli errori e potrebbero essere scambiati per altri virus perciò gli Autori hanno usato anche i test statistici per non sbagliare

48 La reazione a catena della polimerasi (in inglese: Polymerase Chain Reaction), comunemente nota con l'acronimo PCR, è una tecnica di biologia
molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e

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in modo da assicurarsi che questo fenomeno non domini i risultati. Il nostro studio ha utilizzato sia pazienti
derivati dallo studio di Baley et al, sia pazienti di nuovo arruolamento, per i quali tutti i campioni sono stati
preparati in maniera da evitare questo fenomeno.

In secondo luogo, differenti test di struttura della popolazione possono condurre a risultati contraddittori, e
un’analisi prudente dovrebbe perciò usare almeno due test complementari di compartimentalizzazione. Per
questa ragione, abbiamo usato un test aggiuntivo di struttura della popolazione, il test AMOVA49.

In terzo luogo, abbiamo affrontato il problema dei PPC, che erano stati descritti da Bailey et al., e abbiamo
indagato la loro relazione col più generale fenomeno della compartimentalizzazione.

Il nostro studio inoltre affronta la relazione tra le sequenze pro virali derivate dai CD4 attivati e quiescenti,
assumendo implicitamente la compartimentalizzazione tra questi due tipi di cellule. Poiché nella maggioranza
dei pazienti non abbiamo potuto respingere l’ipotesi nulla della mancanza di compartimentalizzazione, ne
concludiamo che gli indici di migrazione calcolati in lavori precedenti non hanno interpretazione sensata50.

Per quanto la HAART possa fermare la replicazione in corso, le cellule CD4 memoria offrono rifugio al pro
virus dell'HIV che può ancora produrre virus dopo la riattivazione. Perciò i reservoir latenti contribuiscono
probabilmente alla viremia residua nei pazienti con la HAART. Nondimeno, abbiamo dimostrato in questo
studio che, a livello della popolazione, i pro virus derivati dalle cellule CD4 quiescenti e il virus libero nel
sangue esistono come due diverse popolazioni genetiche. Ci sono diverse possibili spiegazioni. Poiché noi
abbiamo campionato soltanto le cellule CD4 quiescenti circolanti, una spiegazione è che le cellule CD4
quiescenti sequestrate nei vari tessuti possano essere la sorgente del virus libero osservato nel plasma di questi
pazienti51.

L'assunto che il campionamento dalla periferia possa offrire una buona rappresentazione delle quasi-specie
presenti nei CD4 reservoir, mentre è una potenziale limitazione di questo studio, non è raro in questa area di
ricerca. Un'altra possibile spiegazione è che altri tipi cellulari o compartimenti anatomici possano svolgere anche
essi la funzione di reservoir di lungo termine. Recenti studi che identificano i PPC suggeriscono che un reservoir
alternativo per l'HIV possa essere responsabile di parte della viremia residua osservata52.

Suggeriamo che la presenza dei PPC possa essere una manifestazione di un più generale fenomeno nel quale una
sorgente di virus libero nel plasma è figlia d'un qualche comparto cellulare fortemente sottorappresentato nel
sangue periferico53.

Abbiamo trovato che la struttura di popolazione tra virus plasmatico e pro virus dai CD4 quiescenti non
dipendeva dalla presenza di un PPC. Cionondimeno, la percentuale di variazione molecolare tra (cioè non
condivisa da) questi due gruppi di sequenze era fortemente influenzata dai PPC. Abbiamo studiato l’impatto dei
PPC analizzando nuovamente tutti gli insiemi di dati54 dopo avere rimosso tutti i PPC. Abbiamo trovato che la
rimozione dei PPC riduceva la variazione percentuale tra i gruppi, ma nella maggior parte dei casi rimanevano
significative strutture di popolazione anche dopo la rimozione dei PPC.

La nostra analisi comprende due geni: RT ed Env. La nostra scoperta di una struttura di popolazione tra il virus
plasmatico e il pro virus derivato dai CD4 quiescenti non sembrava dipendere dai geni in studio. Comunque, la
percentuale di variazione molecolare tra i gruppi, come calcolata col test AMOVA, era differente per i due geni,
così come l’effetto della presenza di sequenze PPC o la rimozione di questo. La differenza osservata nella
variazione percentuale tra i gruppi per i geni RT ed Env potrebbe essere spiegata dalla differenza nella diversità
globale trovata in questi due geni. Il test AMOVA è basato sulla diversità molecolare, che è molto inferiore nel

terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le
successive applicazioni.
49 Gli Autori ripetono qui che a volte le tecniche di amplificazione genica (PCR) fanno degli errori e quindi bisogna eseguire più test di controllo.
50 In alcuni pazienti però sembra che ci sia lo stessa popolazione virale o forse solo perche il dato non e statisticamente significativo.
51 Quindi i reservoir potrebbero essere solo i CD4 quiescenti e basta.
52 Cioè ci potrebbe essere anche un altro reservoir, come dice un altro studio, ma non si è certi.
53 Cioè se la viremia residua è cosi bassa vuol dire che il virus è nascosto in una popolazione cellulare formata da pochissimi elementi.
54 Nell’articolo: dataset

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gene RT che in quello Env. Poiché l’infezione iniziale da HIV è probabilmente determinata da un singolo clone,
due distinte sotto popolazioni potrebbero mostrare scarse differenze tra popolazioni se il tempo per accumulare
queste diversità è stato breve, e questo effetto potrebbe essere più forte nel gene RT che in quello Env. In
questo scenario, possiamo concludere che c’è una fonte maggiore di viremia residua diversa dai CD4 riattivati,
ma che questa fonte diviene chiaramente visibile nel gene RT solo quando questo produce un PPC55.

Alternativamente, se rigettiamo la nozione che il gene Env sia significativamente molto diverso dal gene RT,
possiamo spiegare la correlazione tra la presenza o assenza di un PPC e la variazione percentuale tra popolazioni
con un modello in cui la maggioranza del virus plasmatico si origina dai CD4 quiescenti, mentre un sottogruppo
(esemplificato nel PPC) si origina da una fonte ancora non identificata. Basandoci sulle nostre analisi di pazienti
concernenti sequenze Env, sentiamo [di poter sostenere che] il primo modello (una fonte di viremia residua
diversa dai CD4 riattivati) si adatti meglio ai dati. Non avevamo i dati per analizzare i geni RT ed Env per
ciascun paziente, ma abbiamo dati sufficienti per un paziente, il 154. Per questo paziente, abbiamo trovato che i
nostri risultati erano comparabili per i due geni56.

Nella nostra analisi di struttura della popolazione tra virus plasmatico e pro virus derivato dai CD4 quiescenti
abbiamo usato campioni derivati in momenti diversi. Perciò la nostra analisi riflette un campionamento in un
tempo medio dei compartimenti sotto analisi. Il campionamento temporale è una necessità logistica quando si
conducono analisi di virus plasmatico in pazienti in HAART soppressiva, a causa del numero molto ridotto di
sequenze ottenibili con ogni prelievo di sangue. Non abbiamo trovato evidenze di variazioni temporali nelle
popolazioni pro virali rispetto ai differenti momenti. Abbiamo, comunque, osservato che i virus plasmatici
isolati in momenti differenti sembravano essere campionati da differenti sottopopolazioni. Questa osservazione
presta ulteriore supporto alla nostra conclusione complessiva che il virus plasmatico non derivi esclusivamente
dai CD4 circolanti. La nostra analisi di sequenze di plasma virale campionato longitudinalmente è in accordo
con il lavoro precedentemente pubblicato da Joos et al., che ha trovato variazioni temporali ma non l’evidenza di
una evoluzione continuata nel virus plasmatico prelevato in diversi momenti57.

È risaputo che l’insieme del pro virus dell’HIV derivato dalle cellule T quiescenti contiene un insieme di specie
competenti e non competenti per la replicazione, con le prime rappresentanti solo una piccola frazione del totale.
Perciò è possibile che il virus plasmatico prelevato possa essere geneticamente simile a un sottogruppo
dell’insieme del totale pro virale, rappresentato dalla popolazione competente per la replicazione, pur
apparendo geneticamente distinto rispetto alla popolazione totale. I metodi sviluppati per isolare il pro virus
competente per la replicazione nei pazienti sono tecnicamente impegnativi e spesso conducono a troppe poche
sequenze per essere utili a un’analisi filogenetica dettagliata. Perciò noi avevamo dati sufficienti per
condurre un’analisi dai pro virus competenti per la replicazione solo in un paziente estensivamente
caratterizzato: il paziente 154.

I nostri risultati hanno mostrato che il pro virus competente per la replicazione e totalmente integrato comprende
un compartimento genetico misto. Inoltre, quando confrontiamo il virus plasmatico con il pro virus competente
per la replicazione, troviamo che queste due popolazioni formano distinti compartimenti genetici. Per quanto
limitati a un paziente, i nostri dati supportano l’ipotesi che le cellule T infette isolate dalla circolazione
periferica rappresentino un singolo compartimento. Perciò, le mutazioni o altri eventi che conducono
all’incompetenza per la replicazione occorrono nel contesto di una popolazione genetica mescolata, e perciò, a
livello di popolazione, ci dovrebbe essere una piccola differenza genetica globale58.

55 In altre parole, vuol dire che analizzando i due geni RT ed Env sembra che vi potrebbe essere anche un’altra viremia residua, ossia non solo dovuta
ai CD4 memoria.
56 Cioè dall’analisi dei due geni esiste una viremia residua che gli Autori sostengono potrebbe essere diversa dai CD4 quiescenti.
57 Parla del problema tempo di campionamento: il tempo deve essere sempre uguale sennò di una popolazione virale ne abbiamo di più di un'altra e i

risultati sono falsati.
58 In breve: solo il paziente 154 aveva una buona quantità di virus attivo (cioè senza errori) per poterlo confrontare con il virus della viremia

residua. E l’analisi di questo ha confermato lo studio cioè che ci sono due popolazioni distinte di virus.

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Abbiamo altresì dimostrato che i pro virus derivati dai CD4 attivati e quiescenti formano una popolazione
genetica mescolata. Possiamo spiegare questa osservazione nel contesto della biologia di base delle cellule T. I
CD4 attivati e quiescenti rappresentano la stessa popolazione di cellule, ma fissata a differenti stadi di
attivazione. Perciò, i pro virus derivati dai CD4 attivati o quiescenti provengono dallo stesso compartimento
cellulare e dovrebbero formare una popolazione geneticamente mista. Questo sarebbe vero, tuttavia, se i CD4
attivati non fossero di nuova infezione a opera del virus plasmatico. Se ci fosse replicazione in corso, ci si
potrebbe attendere discordanza tra i pro virus derivati dai CD4 attivati e quiescenti, e ci si potrebbe aspettare una
piccola evidenza di struttura di popolazione tra il virus plasmatico e quello derivato dai CD4 attivati. Noi
abbiamo i dati per testare l’ultima ipotesi solo per il paziente 154. In questo paziente, il virus plasmatico era
significativamente differente dal pro virus derivato dai CD4 sia attivati sia quiescenti. In contrasto, il pro virus
derivato dai CD4 attivati e quiescenti non mostrava evidenza di struttura di popolazione, un risultato coerente
con la struttura globale che emerge da questo studio59.

Il nostro studio non si occupa della relazione filogenetica tra il virus plasmatico e quello nei CD4 quiescenti dei
pazienti con replicazione virale attiva. Nei pazienti con replicazione virale attiva, la maggior parte del virus
plasmatico è derivata da cellule recentemente infettate dal rapido turnover60. Le varianti virali dominanti nel
plasma sono tipicamente quelle che più si adattano alle condizioni esistenti. In contrasto, i reservoir latenti nei
CD4 quiescenti danno rifugio a un archivio stabile di varianti virali preesistenti. Per esempio, abbiamo mostrato
precedentemente che nei pazienti che vanno incontro a fallimento terapeutico, il plasma contiene varianti
resistenti al farmaco, mentre i reservoir ospitano il virus originale “selvaggio”61 e le varianti farmaco resistenti
precedenti62.

Perciò, nei pazienti viremici, è atteso che ci saranno differenze nelle quasi specie virali individuate in plasma e
reservoir latenti. Nondimeno, questo riflette le differenze tra replicazione attiva e rilascio dai reservoir stabili
piuttosto che differenze tra i reservoir stabili. Sfortunatamente, le attualmente persistenti difficoltà tecniche
precludono un’analisi dettagliata di questo problema. Stevenson et coll. hanno mostrato che la maggior parte del
DNA dell’HIV nei CD4 quiescenti dei pazienti viremici è una forma labile, non integrata, in cellule di recente
infezione. Questo DNA non integrato complica grandemente la ricerca delle più rare forme integrate. Noi
abbiamo sviluppato un approccio sperimentale per isolare il DNA dell’HIV integrato, ma il numero di sequenze
che può essere ottenuto con questo approccio è generalmente troppo limitato per un’analisi filogenetica
dettagliata. Questo numero è, comunque, sufficiente per confermare l’impressione generale che nei pazienti
viremici ci siano sostanziali differenze tra l’insieme di virus attivamente replicante osservato nel plasma e
l’insieme stabile archiviato di pro virus integrati nei CD4 quiescenti63.

Che la maggior parte del virus plasmatico possa essere derivato da alcune fonti cellulari ancora non identificate
ha diverse importanti implicazioni cliniche rispetto alla gestione della HAART, al fallimento terapeutico, alla
moltiplicazione della viremia associata all’interruzione del trattamento ed alle strategie tese all’eradicazione.

Numerosi laboratori stanno attivamente seguendo diverse strategie di eradicazione, la maggior parte delle quali
comprende alcune attività di bersaglio e ripulitura dei reservoir latenti nei CD4 memoria quiescenti. Se la
maggior parte della viremia residua nei pazienti trattati con la HAART provenisse da altri reservoir o
compartimenti, come qui suggerito, allora, per essere efficaci, le strategie di eradicazione dovrebbero includere
vie per bersagliare e ripulire anche questi altri reservoir.

59 Ribadisce di nuovo che grazie al paziente 154 si e’ riusciti a capire che esistono due popolazioni virali distinte.
60 Il termine turnover di un determinato elemento chimico è sinonimo di "ciclo" di quell'elemento, cioè di quella serie di passaggi che comprendono il suo
assorbimento da parte dei viventi, la sua metabolizzazione, il suo trasporto e la sua restituzione all'ambiente (Wikipedia)
61 Wild-type.
62 Nei reservoir vengono conservate varie mutazioni del virus selvaggio ma anche qualche mutazione più recente, dovuta a nuove reinfezioni di altri CD4

di memoria. Per cui, quando si sospende la HAART, le varianti più aggressive e toste hanno la meglio.
63 Le tecniche attuali non permettono di valutare con esattezza tutte le mutazioni del virus, ma permettono di creare un archivio da cui attingere per studi

futuri, quando le tecniche si saranno evolute.

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L’analisi della viremia e del pro virus dell’HIV-1 rivelano una nuova fonte di viremia residua nei pazienti in trattamento antiretrovirale

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