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![Si prega di citare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e
vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037
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aumento dell'affinità (ad esempio, 2 volte) batterebbe quasi tutti
gli anticorpi ((Dejnirattisai et al., 2021); Supasa et al., 2021).
L'influenza delle mutazioni RBD sull'affinità dei mAb
Per capire l'ordine di grandezza dell'abrogazione nella
neutralizzazione di più di due terzi dei 19 mAbs potenti che
legano la RBD, abbiamo misurato il KD per il legame alla RBD
recombi- nante da BLI (Figure 6C e 6D; Tabella S3). I risultati
sono netti: mentre per i frammenti leganti l'antigene (Fabs)
testati contro Victoria, 17 avevano KD inferiori a 4 nM (l'affinità
di ACE2 per B.1.351) contro B.1.351, questo si riduce a 4 (o 2
se le versioni a catena leggera [LC] di 253 vengono rimosse
[(Dejniratti- sai et al., 2021)]), con 7 Fabs che non riescono a
raggiungere un'affinità quasi micromolare. Questi risultati
seguono ampiamente i risultati di neutralizzazione (confrontare
i pannelli C e D della Figura 6; vedi Tabella S3), suggerendo
che il modello osservato di effetti sulla neutralizzazione è in
gran parte dovuto alle sostituzioni di aminoacidi nel RBD, cioè,
K417N, E484K, e N501Y.
La base strutturale per la perdita del legame mAb
Cerchiamo di capire la base di questi effetti nel contesto di una
descrizione anatomica della RBD. In termini di torso umano,
abbiamo definito quattro epitopi strutturali quasi contigui: spalla
sinistra, collo, spalla destra e fianco destro, con un epitopo
separato sul fianco sinistro (Dejnirattisai et al., 2021) (Figura
6E). In questo contesto, il sito di legame di ACE2 si estende
attraverso il collo ed entrambe le spalle. N501Y è sulla spalla
destra, K417N sul retro del collo, e E484R sulla spalla sinistra.
Anche se le tre mutazioni sono nominalmente in epitopi diversi,
la natura sovrapposta di questi epitopi significa che i residui
sono sufficientemente vicini in modo che più di uno potrebbe
influenzare direttamente il legame di qualsiasi anticorpo.
Inoltre, ci possono essere effetti allosterici (l'equivalente
strutturale dell'epistasi in genetica) per cui gli effetti possono
estendersi su una certa distanza. Nonostante questi caveat, la
maggior parte degli effetti osservati sono direttamente spiegati
dal riferimento alla conoscenza strutturale precedente.
L'effetto di N501Y e K417N sul legame mAb
Molti dei complessi Fab/SARS-CoV-2 RBD riportati sono per gli
anticorpi che utilizzano la regione pubblica
dell'immunoglobulina HC variabile (IGHV) IGHV3-53
((Dejnirattisai et al., 2021); Yuan et al., 2020), e questi sono
ben rappresentati nel nostro set da cinque anticorpi che sono
potenti contro il virus Victoria. Quattro di questi, 150, 158, 175 e
269, hanno le loro capacità di neutralizzazione e di legame
gravemente compromesse o abolite, mentre 222 è
un'eccezione, poiché il suo legame non è influenzato dalla
variante B.1.351 (figure 6F e 6G). La famiglia di anticorpi
IGHV3-53 si lega allo stesso epitopo nella parte posteriore del
collo della RBD, con orientamenti di approccio molto simili
condivisi anche dai Fabs IGHV3-66. La maggior parte di questi
stabilisce contatti diretti con K417 e
N501, ma nessuno di loro contatta E484. Le regioni
determinanti la complementarità-3 (CDR3s) piuttosto corte di
queste Fabs sono solitamente posizionate direttamente sopra
K417 (Dejnirattisai et al., 2021), formando legami a idrogeno o
ponti salini così come interazioni idrofobiche, mentre N501
interagisce con il loop CDR1 LC (Figura 5) (Supasa et al.,
2021). Tuttavia, il mAb 150 è un po' diverso, formando sia un
ponte salino tra K417 e il LC CDR3 D92 che un legame
idrogeno tra N501 e S30 nel LC CDR1 (Figura 5B), mentre 158
è più tipico, formando un legame idrogeno dall'ossigeno
carbonilico di G100 del HC CDR3 e K417 e contatti idrofobici
da S30 del LC CDR1 a N501. Ci aspetteremmo quindi che gli
effetti combinati delle mutazioni K417N e N501Y
compromettessero gravemente il legame della maggior parte
dei mAbs della classe IGHV3-53 e IGHV3-66. Tuttavia, un
membro di questa classe, 222, non è influenzato né dalla
variante B.1.1.7 (Supasa et al., 2021) né da quella B.1.351.
Fortunatamente, fino ad oggi non siamo stati in grado di
ottenere una struttura del 222 Fab con RBD o spike. Tuttavia,
abbiamo precedentemente notato che il p2c-2f11 Fab (PDB:
7CDI [Wajnberg et al., 2020]) il cui LC è più simile in sequenza,
e ha le stesse lunghezze CDR- L1, L2, e L3, al mAb 222 non fa
alcun contatto con N501 (Supasa et al., 2021).
Esaminando da vicino le strutture dei complessi Fab e RBD
IGHV3-53 e IGHV3-66, abbiamo scoperto che Fab CB6 (PDB:
7C01 [Shi et al., 2020]) ha le stesse lunghezze CDR-H1-3 e fa
solo contatti idrofobici a K417 da Y33, Y52, e D104 del HC.
Cambiando il K in N a 417 in questa struttura complessa e
selezionando uno dei rotamers favorevoli della catena laterale
si vede che N417 potrebbe fare legami idrogeno sia a Y33 che
a Y52, compensando la perdita di contatto con D104 (Figure 5F
e 5G). In 222, Y33 e Y52 sono conservati e D104 è ri-posto da
un N. Noi ipotizziamo che l'interazione di 222 con K417
potrebbe essere simile a CB6, spiegando la sua resistenza al
B.1.351 variante.
Gli effetti della mutazione E484K Fab 88 lega RBD nella parte
posteriore della spalla sinistra, i residui G104 e K108 del HC
CDR3 contattano E484, e il LC CDR2 fa ampie interazioni
idrofobiche e un legame idrogeno catena principale da Y51 e
un ponte salino da D53 a K417 (Figura 5A). Il cambiamento di
carica a E484 da negativo a positivo e l'accorciamento della
catena laterale del residuo 417 da K a N dovrebbero abolire
tutte queste interazioni, spiegando la perdita di diverse
centinaia di volte in KD. Il mAb 384 è uno dei più potenti mAb
neutralizzanti che abbiamo trovato contro il virus Victo- ria.
Questo mAb si avvicina al sito di legame dalla parte anteriore
della spalla sinistra, seppellendo l'82% dell'area accessibile al
solvente di E484 attraverso il legame a idrogeno con Y50, T57
e Y59 e facendo un ponte salino con R52 del LC CDR2 (Figura
5D),
Figura 3. Neutralizzazione di B.1.351 da parte del siero del vaccino
(A e B) Curve di neutralizzazione FRNT per i ceppi Victoria e B.1.351 da (A) 25 sieri prelevati 7-17 giorni dopo la seconda dose del vaccino Pfizer-BioNTech e
(B) 25 sieri prelevati 14 o 28 giorni dopo la seconda dose del vaccino Oxford-AstraZeneca.
(C e D) Confronto dei titoli FRNT50 tra i ceppi B.1.351 e Victoria per i vaccini Pfizer-BioNTech e Oxford-AstraZeneca, rispettivamente. Il test Wilcoxon](https://image.slidesharecdn.com/variantistudio-convertitoitetradotto-210325100845/85/Covid-19-Varianti-e-vaccini-15-320.jpg)
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Figura 5. Interazioni di siti di mutazione resi
con una selezione di RBD-binding mAbs (A-D)
Interazioni di (A) Fab 88 con K417 e E484 della
RBD (PDB: 7BEL), (B) 150 con N501 e K417
(PDB: 7BEI), (C) 253 non ha contatto con
nessuno dei tre siti di mutazione (PDB: 7BEN), e
(D) Fab 384 con solo E484 (PDB: 7BEP).
(E) Strutture dei Fabs IGHV3-51 e IGHV3-66
sovrapponendo le dorsali Ca della RBD.
(F) Interazioni di K417 con CB6 Fab (PDB: 7C01
[Wajnberg et al., 2020]).
(G) La mutazione K417N è modellata nel
complesso RBD/ CB6. In (A) a (G), la catena
leggera Fab, la catena pesante e RBD sono in
blu, salmone e grigio, rispettivamente. Le dorsali
Ca sono disegnate in
e le catene laterali in quelle più spesse. I contatti
(%4 Å
) sono mostrati come linee tratteggiate gialle
e i legami idrogeno e i ponti salini come linee
tratteggiate blu.
(H e I) Posizioni delle mutazioni e la delezione nel
NTD spike della variante B.1.351 rispetto agli
anticorpi legati (H) 159 (PDB: 7NDC) e (I) 4A8
(PDB: 7C2L); la delezione 242-244 sarebbe pre-
previsto per interrompere l'interazione di 159 e
4A4. I domini variabili della catena pesante e della
catena leggera (Vh e Vl) dei Fabs sono mostrati
come superfici salmone e blu, rispettivamente, e
l'NTD come bastoncini grigi. I siti di mutazione
sono disegnati come sfere verdi e le delezioni
come sfere magenta.
I titoli di neutralizzazione sono ridotti di 13,3 volte per B.1.351
rispetto al ceppo Victoria, con 14 su 34 che non riescono a
raggiungere un NT50 a una diluizione 1:20 e un certo numero
che mostra quasi un completo abbattimento dell'attività. Resta
da determinare se questo riflette una focalizzazione della
risposta immunitaria in questi individui, come è stato visto, per
esempio, per il picor- navirus enterovirus-71 (Huang et al.,
2020). I titoli di neutralizzazione per i vaccini Oxford-
AstraZeneca e Pfizer sono stati ridotti in modo simile con
B.1.351 da 9 volte e 7.6 volte, rispettivamente. Per](https://image.slidesharecdn.com/variantistudio-convertitoitetradotto-210325100845/85/Covid-19-Varianti-e-vaccini-21-320.jpg)
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Figura 6. Interazione RBD dell'anticorpo e
modellazione strutturale
(A e B) grafici BLI che mostrano una serie di
titolazione del legame ad ACE2 (vedi metodi
STAR) per (A) Wu- han RBD e (B) K417N,
E484K, e N501Y
B.1.351 RBD. Si noti il tasso di spegnimento
molto più lento per B.1.351.
(C e D) KD di interazione RBD/mAb misurata da
BLI per WT Wuhan RBD (punti di sinistra) e
K417N, E484K, e N501Y B.1.351 RBD (punti di
destra).
(E) Epitopi definiti dal clustering dei mAbs sulla
RBD (grigio).
(F) BLI dati mappati sulla RBD utilizzando il
metodo descritto in (Dejnirattisai et al., 2021). Le
viste anteriore e posteriore della RBD sono
rappresentate con le sfere che rappresentano i siti
di legame degli anticorpi colorati secondo il
rapporto (KDB.1.351/ KDWuhan). Per il bianco, il
rapporto è 1; per il rosso, è <0.1 (cioè, almeno 10
volte riduzione). I punti neri si riferiscono agli
anticorpi mappati non inclusi in questa analisi;
verde scuro alla superficie di legame RBD ACE2;
e giallo ai mutati K417N, E484K, e N501Y.
(G) Come per la coppia di sinistra, ma colorati
secondo il rapporto dei titoli di neutralizzazione
(concentrazione inibitoria semimassima
[IC50]B.1.351/[IC50]Victoria). Per il bianco, il
rapporto è 1; per il rosso, è <0,01 (cioè, almeno
100 volte la riduzione). Si noti la forte
concordanza tra i due effetti, con il 269 che è il
più fortemente colpito. Gli anticorpi rosa vicini
sono principalmente gli anticorpi IGHV3-53 e
IGHV3-66.
nessuna differenza nel tasso di infezione nei volontari
sieronegativi rispetto a quelli sieropositivi (3,9 contro 3,9%), il
che implica una mancanza di protezione della precedente
esposizione alla SARS-CoV-2 rispetto all'infezione con
B.1.351. Il vaccino monodose COVID-19 della Janssen ha
mostrato un'efficacia del 72% nel prevenire la malattia
moderata e grave, che è stata ridotta al 57% in Sudafrica.
Infine, un recente rapporto dal Sudafrica su un campione di
piccole dimensioni suggerisce una sostanziale perdita di
efficacia per il vaccino Oxford-AstraZeneca contro l'infezione
da B.1.351 (10,6% di efficacia contro la malattia lieve-moderata
[Madhi et al., 2021]). Non ci sono ancora rapporti sull'efficacia
del vaccino Pfizer-Bio- NTech contro B.1.351; tuttavia, i titoli di
neutralizzazione qui riportati suggeriscono che un certo grado
di efficacia sarà mantenuto. Nel complesso, questi risultati
suggeriscono che una precedente infezione o vaccinazione con
ceppi ancestrali di SARS-CoV-2 potrebbe non fornire una
protezione adeguata contro B.1.351.
Ciò che sta guidando l'evoluzione di B.1.351 è difficile da
disen- trarre. Da un lato, qui mostriamo un aumento di circa 20
volte dell'affinità per ACE2 rispetto a Wuhan RBD, che può
influenzare la trasmissibilità. D'altra parte, la sostanziale fuga
immunitaria anticorpale da B.1.351 sta probabilmente giocando
un ruolo in paesi come il Sud Africa, dove i tassi di infezione
precedente sono relativamente alti (stima >30%). Il compromesso
tra l'aumento dell'affinità e della trasmissibilità di ACE2 e la fuga
immunitaria è probabilmente complesso; come l'immunità della
popolazione aumenta a causa della vaccinazione](https://image.slidesharecdn.com/variantistudio-convertitoitetradotto-210325100845/85/Covid-19-Varianti-e-vaccini-23-320.jpg)
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REAGENTE o IDENTIFICATORE DI RISORSE
Biosensori amminici reattivi di seconda
generazione (AR2G)
FortebioCat#18-5092
DISPONIBILITÀ DI RISORSE
Contatto principale Le risorse, i reagenti e le ulteriori informazioni richieste devono essere inoltrate al contatto principale, David I
Stuart (dave@strubi.ox.ac.uk).
Disponibilità dei materiali
I reagenti generati in questo studio sono disponibili presso il contatto principale con un accordo di trasferimento dei materiali
completato.
Disponibilità dei dati e del codice Mabscape è disponibile presso https://github.com/helenginn/mabscape,
https://snapcraft.io/mabscape. I dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili su richiesta presso gli autori
corrispondenti.
MODELLO SPERIMENTALE E DETTAGLI DEL SOGGETTO
Azioni virali
SARS-CoV-2/human/AUS/VIC01/2020 (Caly et al., 2020) e SARS-CoV-2/B.1.351, forniti dal Public Health England, sono stati
entrambi coltivati in cellule Vero (ATCC CCL-81). Le cellule sono state infettate con il virus SARS-CoV-2 usando un MOI di
0,0001. Il virus contenente il super-natante è stato raccolto all'80% di CPE e centrifugato a 2000 rpm a 4○C prima della
conservazione a -80○C. I titoli virali sono stati determinati da un saggio di focalizzazione su cellule Vero. Sia Victoria passaggio 5
e B.1.351 passaggio 4 stock sono stati sequenziati per verificare che conteneva la sequenza prevista proteina spike e senza
modifiche ai siti di furina scissione. Il virus B1.351 utilizzato in questi studi conteneva le seguenti mutazioni: D80A, D215G, L242-
244 cancellato, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V.
Ceppi batterici e coltura cellulare
Le cellule Vero (ATCC CCL-81) sono state coltivate a 37○C in Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) ad alto contenuto di
glucosio (Sigma-Aldrich) sup- pletato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM GlutaMAX (GIBCO, 35050061) e 100 U/ml di
penicillina-streptomicina. I mAbs umani sono stati espressi in cellule HEK293T coltivate in UltraDOMA PF Protein-free Medium
(Cat# 12-727F, LONZA) a 37○C con 5% CO2. I batteri E.coli DH5a sono stati utilizzati per la trasformazione del plasmide pNEO-
RBD K417N, E484K, N501Y. Una singola colonia è stata raccolta e coltivata in brodo LB con 50 mg mL-1 Kanamicina a 37○C a
200 rpm in un agitatore per una notte. Le cellule HEK293T (ATCC CRL-11268) sono state coltivate in DMEM alto glucosio
(Sigma-Aldrich) integrato con 10% FBS, 1% 100X Mem Neaa (GIBCO) e 1% 100X L-Gluta- mine (GIBCO) a 37○C con 5% CO2.
Per esprimere RBD, RBD K417N, E484K, N501Y e ACE2, le cellule HEK293T sono state coltivate in DMEM ad alto contenuto di
glucosio (Sigma) integrato con 2% FBS, 1% 100X Mem Neaa e 1% 100X L-Glutamina a 37○C per la trasfezione.
Partecipanti
I partecipanti sono stati reclutati attraverso tre studi: Sepsis Immunomics [Oxford REC C, riferimento:19/SC/0296]), ISARIC/WHO
Clin- ical Characterization Protocol for Severe Emerging Infections [Oxford REC C, riferimento 13/SC/0149] e il Gastro-intestinal
illness in Oxford: COVID sub studio [Sheffield REC, riferimento: 16/YH/0247]. La diagnosi è stata confermata attraverso la
segnalazione di sintomi coerenti con COVID-19 e un test positivo per SARS-CoV-2 utilizzando la reazione a catena della
polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) da un tampone del tratto respiratorio superiore (naso/gola) testato in laboratori
accreditati. Un campione di sangue è stato prelevato, previo consenso, almeno 14 giorni dopo la comparsa dei sintomi. Le
informazioni cliniche tra cui la gravità della malattia (infezione lieve, grave o critica secondo le raccomandazioni
dell'Organizzazione Mondiale della Sanità) e i tempi tra l'insorgenza dei sintomi e il campionamento e l'età del partecipante sono
stati raccolti per tutti gli individui al momento del campionamento.
Siero dei vaccinati Pfizer
Il siero del vaccino Pfizer è stato ottenuto 7-17 giorni dopo la seconda dose di vaccino che è stata somministrata 3 settimane dopo
Ottetto
RED96e
Fortebio
Sistema di scambio tampone
''QuixStand
Sonics vibra-cell vcx500 sonicator
GE Healthcare
VWR
https://www.sartorius.com/en/products/
proteina-analisi/sistemi di
rilevamento senza etichetta a
ottetto
Cat#56-4107-78
Cat#432-0137](https://image.slidesharecdn.com/variantistudio-convertitoitetradotto-210325100845/85/Covid-19-Varianti-e-vaccini-35-320.jpg)
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Lo studio è stato approvato dall'Oxford Translational Gastrointestinal Unit GI Biobank Study 16/YH/0247 [comitato etico di
ricerca (REC) dello Yorkshire & The Humber - Sheffield]. Lo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di
Helsinki (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-
subjects/) e le linee guida della International Conference on Harmonization (ICH) Good Clinical Practice (GCP). Il consenso
informato scritto è stato ottenuto per tutti i pazienti arruolati nello studio. I vaccinati erano operatori sanitari, con sede presso
l'Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, non noti per avere una precedente infezione da SARS-CoV-2. Ognuno ha
ricevuto due dosi di vaccino COVID-19 mRNA BNT162b2, 30 mg, somministrato per via intramuscolare dopo diluizione in una
serie di due dosi (0,3 mL ciascuna) a distanza di 18-28 giorni. L'età media dei vaccini era di 43 anni (range 25-63), 11 maschi e 14
femmine.
Procedure di studio del vaccino AstraZeneca-Oxford e trattamento dei campioni
Tutti i dettagli dello studio controllato randomizzato di ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222), sono stati precedentemente pubblicati
(PMID: 33220855/PMID: 32702298). Questi studi sono stati registrati presso ISRCTN (15281137 e 89951424) e ClinicalTrials.gov
(NCT04324606 e NCT04400838). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e lo studio è stato fatto in
conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki (2008) e la buona pratica clinica. Gli studi sono stati sponsorizzati
dall'Università di Oxford (Ox- ford, UK) e l'approvazione è stata ottenuta da un comitato etico nazionale (South Central Berkshire
Research Ethics Committee, riferimento 20/SC/0145 e 20/SC/0179) e da un'agenzia di regolamentazione nel Regno Unito
(Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency). Un DSMB indipendente ha esaminato tutte le relazioni intermedie sulla
sicurezza. Una copia dei protocolli è stata inclusa nelle pubblicazioni precedenti (PMID: 33220855/PMID: 32702298).
I dati dei volontari vaccinati che hanno ricevuto due vaccinazioni sono inclusi in questo documento. Le dosi del vaccino erano 5
3 1010
particelle virali (dose standard; coorte SD/SD n = 21) o metà dose come prima dose (dose bassa) e una dose standard
come seconda dose (coorte LD/SD n = 4). L'intervallo tra la prima e la seconda dose era nell'intervallo di 8-14 settimane. I
campioni di sangue sono stati raccolti e il siero separato il giorno della vaccinazione e in giorni prestabiliti dopo la vaccinazione,
ad esempio, 14 e 28 giorni dopo la spinta.
DETTAGLI DEL METODO
Analisi delle sequenze COG-UK
Le sequenze COG-UK del 2 febbraio 2021 (Tatusov et al., 2000), e le sequenze GISAID (https://www.gisaid.org/) del Sud Africa
del 30 gennaio 2021 sono state scaricate e la sequenza della proteina Spike è stata ottenuta dopo il nucleotide 21000, seguita
dall'allineamento di sequenza e dal riconoscimento delle mutazioni. La variante B.1.351 è stata filtrata utilizzando i criteri di
selezione 501Y e D242. La variante B.1.1.7 è stata filtrata usando i criteri di selezione 501Y e D69. Le posizioni strutturali delle
mutazioni sono state modellate in rosso (mutazioni a punto singolo), nero (delezioni) o blu (aggiunte) sulla struttura Spike con la
dimensione proporzionale al logaritmo dell'incidenza, e le mutazioni con incidenza superiore al 5% nella popolazione sono state
esplicitamente etichettate.
Focus Reduction Neutralization Assay (FRNT) Il potenziale di neutralizzazione dell'Ab è stato misurato usando il Focus Reduction
Neutralization Test (FRNT), dove la riduzione del numero di focolai infetti viene confrontata con un pozzo di controllo negativo
senza anticorpo. In breve, l'Ab o il plasma diluito in serie è stato mescolato con il ceppo SARS-CoV-2 Victoria o B.1.351 e
incubato per 1 ora a 37○C. Le miscele sono state poi trasferite in micropiastre a fondo piatto a 96 pozzetti, trattate per la coltura
cellulare, contenenti monostrati di cellule Vero confluenti in duplicato e incubate per altre 2 ore, seguite dall'aggiunta di un mezzo
di copertura semisolido all'1,5% di carbossimetilcellulosa (CMC) ad ogni pozzetto per limitare la diffusione del virus. Un focus
form-ing test è stato poi eseguito colorando le cellule Vero con umano anti-NP mAb (mAb206) seguita da perossidasi coniugata
capra anti-human IgG (A0170; Sigma). Infine, i foci (cellule infettate) circa 100 per pozzetto in assenza di anticorpi, sono stati
visualizzati aggiungendo il substrato TrueBlue Peroxidase. I foci delle cellule infettate dal virus sono stati contati sul classico
lettore AID EliSpot utilizzando il software AID ELISpot. La percentuale di riduzione dei focolai è stata calcolata e l'IC50 è stata
determinata utilizzando il programma probit del pacchetto SPSS.
Clonazione di RBD nativo, ACE2 e RBD K417N, E484K, N501Y
I costrutti di RBD nativo e ACE2 sono gli stessi di (Zhou et al., 2020). Per clonare RBD K417N, E484K, N501Y, un costrutto di
RBD con la mutazione N501Y (Supasa et al., 2021) è stato usato come modello e quattro primer di RBD (K417N primer Forward 50-
CAGGGCAGACCGGCAATCGCCGACTACAATTAC-30, K417N primer reverse 50-GTAATTGTAGTCGGCGATGCCGGTCT
GCCCTG-30, E484K Forward primer 50-CACCGTGTAATGGCGTGAAGGGCTTCAATTGCTAC-30
e E484K reverse primer 50-
GTAGCAATTGAAGCCCTTCACGCCATTACGGTG-30) e due primer del vettore pNEO (Forward primer 50-
CAGCTCCTGGG-
CAACGTGCT-30 e reverse primer 50-CGTAAAAGGAGCAACATAG-30
) sono stati usati per fare la PCR. I frammenti di DNA amplificati sono stati digeriti
con gli enzimi di restrizione AgeI e KpnI e poi legati al vettore pNEO digerito. Questo costrutto codifica esattamente la stessa
proteina come RBD nativo tranne le mutazioni K417N, E484K e N501Y, come confermato dal sequenziamento.](https://image.slidesharecdn.com/variantistudio-convertitoitetradotto-210325100845/85/Covid-19-Varianti-e-vaccini-37-320.jpg)
Uploaded byRosanna de Paola
Covid -19 Varianti e vaccini
Elsevier ha creato un centro risorse COVID-19 fornendo accesso gratuito a ricerche sul coronavirus e ha concesso permessi di utilizzo dei dati a repository pubblici. Uno studio analizza la variante B.1.351 di Sars-CoV-2, evidenziando mutazioni che aumentano la fuga immunitaria dagli anticorpi nei sieri di convalescenti e vaccinati. Le mutazioni osservate possono ridurre l'efficacia della protezione offerta da precedenti infezioni o vaccinazioni contro questa variante.
Covid -19 Varianti e vaccini
- 1. Da gennaio 2020Elsevier ha creato un centro risorse COVID-19 con informazioni gratuite in inglese e mandarino sul nuovo coronavirus COVID- 19. Il centro risorse COVID-19 è ospitato su Elsevier Connect, il sito web pubblico di notizie e informazioni della società. Con la presente Elsevier concede il permesso di rendere tutte le sue ricerche relative a COVID-19 che sono disponibili sul centro risorse COVID-19 - compreso questo contenuto di ricerca - immediatamente disponibili in PubMed Central e in altri repository finanziati pubblicamente, come il database COVID dell'OMS con i diritti per il riutilizzo e le analisi senza restrizioni della ricerca in qualsiasi forma o con qualsiasi mezzo con il riconoscimento della fonte originale. Questi permessi sono concessi gratuitamente da Elsevier finché il centro risorse COVID-19 rimane attivo. Abbonati a DeepL Pro per poter modificare questa presentazione. Visita www.DeepL.com/pro per scoprirne di più.
- 2. Articolo Prove di fugadella variante B.1.351 di SARS- CoV-2 dai sieri naturali e vaccinali Astratto grafico In evidenza d Ridotta neutralizzazione di B.1.351 da parte di mAbs e sieri indotti dai primi isolati di SARS-CoV-2 d B.1.351 titolo di neutralizzazione ridotto da 8 a 9 volte per i vaccinati Pfizer e AstraZeneca d E484K, K417N e N501Y causano una diffusa fuga dai mAbs d La delezione NTD in B.1.351 abroga la neutralizzazione da parte di un potente mAb umano neutralizzante Autori Daming Zhou, Wanwisa Dejnirattisai, Piyada Supasa, ..., Jingshan Ren, David I. Stuart, Gavin R. Screaton Corrispondenza jmongkol@well.ox.ac.uk (J.M.), ren@strubi.ox.ac.uk (J.R.), dave.stuart@diamond.ac.uk (D.I.S.), gavin.screaton@medsci.ox.ac.uk (G.R.S.) In breve L'analisi struttura-funzione della variante B.1.351 del CoV-2 della SARS utilizzando campioni di siero di individui convalescenti e vaccinati rivela come le mutazioni nella proteina spike virale risultino in un legame più stretto con il recettore ACE2 e consentano di sfuggire alla neutralizzazione dell'anticorpo monoclonale. Zhou et al., 2021, Cell 189, 1-14 29 aprile 2021ª2021 L'autore/i. Pubblicato da Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll
- 3. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articolo Prove di fuga della variante B.1.351 di SARS-CoV-2 dai sieri naturali e vaccinali Daming Zhou,1,21 Wanwisa Dejnirattisai,2,21 Piyada Supasa,2,21 Chang Liu,2,3,21 Alexander J. Mentzer,2,4,21 Helen M. Ginn,20 Yuguang Zhao,1 Helen M.E. Duyvesteyn,1 Aekkachai Tuekprakhon,2 Rungtiwa Nutalai,2 Beibei Wang,2 Guido C. Paesen,1 Cesar Lopez-Camacho,2 Jose Slon-Campos,2 Bassam Hallis,5 Naomi Coombes,5 Kevin Bewley,5 Sue Charlton,5 Thomas S. Walter,2 Donal Skelly,4,6,7 Sheila F. Lumley,4,8 Christina Dold,9,10 Robert Levin,11 Tao Dong,3,8,12 Andrew J. Pollard,9,10 Julian C. Knight,2,3,4,9 Derrick Crook,8 Teresa Lambe,13 Elizabeth Clutterbuck,9,10 Sagida Bibi,9,10 Amy Flaxman,13 Mustapha Bittaye,13 Sandra Belij-Rammerstorfer,13 Sarah Gilbert,13 William James,14 Miles W. Carroll,2,5 Paul Klenerman,4,6,9,15 Eleanor Barnes,4,6,9,15 Susanna J. Dunachie,4,6,8,16,17 Elizabeth E. Fry,1 Juthathip Mongkolsapaya,2,3,18,* Jingshan Ren,1,* David I. Stuart,1,3,19,20,22,* e Gavin R. Screaton2,3,* 1Divisione di Biologia Strutturale, Dipartimento Nuffield di Medicina, Università di Oxford, The Wellcome Centre for Human Genetics, Oxford, UK 2Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, Università di Oxford, Oxford, UK 3Accademia cinese delle scienze mediche (CAMS), Istituto di Oxford (COI), Università di Oxford, Oxford, Regno Unito 4Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, Regno Unito 5National Infection Service, Public Health England (PHE), Porton Down, Salisbury, UK 6Peter Medawar Building for Pathogen Research, Oxford, Regno Unito 7Dipartimento Nuffield di Neuroscienze Cliniche, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito 8Dipartimento di Medicina di Nuffield, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito 9NIHR Oxford Biomedical Research Centre, Oxford, Regno Unito 10Oxford Vaccine Group, Dipartimento di Pediatria, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito 11Worthing Hospital, Worthing, Regno Unito 12MRC Human Immunology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK 13Jenner Institute, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK 14Sir William Dunn School of Pathology University of Oxford, Oxford, UK 15Translational Gastroenterology Unit, University of Oxford, Oxford, UK 16Centro di Medicina Tropicale e Salute Globale, Dipartimento di Medicina Nuffield, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito 17Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Bangkok, Thailandia 18Siriraj Center of Research Excellence in Dengue & Emerging Pathogens, Dean Office for Research, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Thailandia 19Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, Didcot, UK 20Instruct-ERIC, Oxford House, Parkway Court, John Smith Drive, Oxford, UK 21Questi autori hanno contribuito in egual misura 22Contatto principale *Corrispondenza: jmongkol@well.ox.ac.uk (J.M.), ren@strubi.ox.ac.uk (J.R.), dave.stuart@diamond.ac.uk (D.I.S.), gavin.screaton@medsci. ox.ac.uk (G.R.S.) https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 SOMMARIO La corsa alla produzione di vaccini contro il coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS - CoV-2) è iniziata quando è stata pubblicata la prima sequenza, e questa costituisce la base dei vaccini attualmente impiegati a livello globale. Di recente sono stati segnalati lignaggi dipendenti della SARS- CoV-2: Regno Unito, B.1.1.7; Sudafrica, B.1.351; e Brasile, P.1. Queste varianti hanno cambiamenti multipli nella proteina spike immunodominante che facilita l'ingresso delle cellule virali attraverso il recettore dell'enzima di conversione dell'angiotensina-2 (ACE2). Le mutazioni nel sito di riconoscimento del recettore sullo spike sono di grande preoccupazione per il loro potenziale di fuga immunitaria. Qui, descriviamo un'analisi struttura-funzione di B.1.351 usando una grande coorte di campioni di siero di convalescenti e vaccinati. Le mutazioni del dominio recettore-legante forniscono un legame più stretto all'ACE2 e una diffusa fuga dalla neutralizzazione degli anticorpi monoclonali in gran parte guidata da E484K, anche se K417N e N501Y agiscono insieme contro alcune importanti classi di anticorpi. In un certo numero di casi, sembrerebbe che il siero convalescente e alcuni vaccini offrano una protezione limitata contro questa variante. INTRODUZIONE I rapporti di una sindrome respiratoria acuta grave (SARS) sono emersi nel dicembre 2019, con casi e morti in rapido aumento in Wuhan, Cina. Il virus, SARS-coronavirus 2 (CoV-2) è stato rapidamente identificato, con la sequenza pubblicata nel gennaio 2020 (Lu et al., 2020), e la malattia che ha causato successivamente denominata malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). Il SARS-CoV-2 è stato
- 4. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 ª 2021 Gli autori. Pubblicato da Elsevier Inc. 1 Questo è un articolo ad accesso aperto sotto la licenza CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
- 5. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o si stima che abbia infettato almeno 118 milioni di persone, con 2,6 milioni di morti in tutto il mondo (https://www.worldometers.info/ coronavirus). Uno sforzo scientifico globale senza precedenti è stato condotto da più aziende farmaceutiche e laboratori accademici per produrre vaccini contro la SARS-CoV-2 (https://www.who.int/ publications/m/item/draft-landscape-of- covid-19-candidate-va ccines), visto da molti come l'unico modo realistico per liberare le popolazioni dalle dure misure di isolamento sociale attuate in molti paesi e dal conseguente grave dissesto economico (Keogh-Brown et al., 2020). Sono stati sviluppati molti candidati vaccinali, tutti volti a generare risposte anticorpali (e delle cellule T) contro la proteina spike del SARS-CoV-2. Questi sono stati sviluppati utilizzando sequenze di spike derivate dal primo ceppo di Wuhan e comprendono proteine ricombinanti, virus inattivati, RNA e piattaforme vettoriali virali (Krammer, 2020). Con prove accelerate, i primi risultati di efficacia sono stati forniti circa 10 mesi dopo la prima pubblicazione della sequenza di SARS- CoV-2 (Polack et al., 2020; Voysey et al., 2021a; Baden et al., 2021). Risultati impressionanti sono stati ora riportati da una varietà di produttori: Novavax-recombinant spike e Janssen- adenoviral-vectored vaccini hanno recentemente riportato buona effi- cacia (https://www.novavax.com/sites/default/files/2021-02/ 20210202-NYAS-Novavax-Final.pdf; https://www.medscape. com/viewarticle/944933), mentre i vaccini Moderna-RNA, Pfizer/Bio- NTech-RNA, e Oxford-AstraZeneca-chimp adenoviral- vectored hanno già ricevuto l'autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) in un certo numero di paesi e saranno distribuiti su larga scala nel 2021. Nelle ultime settimane, ci sono state segnalazioni di ceppi variegati di SARS-CoV-2 che emergono in diverse parti del mondo. B.1.1.7 è stato identificato per la prima volta nel Regno Unito da un campione ottenuto nell'ottobre 2020, B.1.351 è stato identificato nell'ottobre 2020 in Sud Africa, e P.1 è stato identificato in Brasile nel dicembre 2020 (https://www.cogconsortium.uk/wp-content/uploads/2021/01/ Report-2_COG-UK_SARS-CoV-2-Mutations.pdf). Questi ceppi varianti hanno raccolto cambiamenti multipli (delezioni e sostituzioni) nella proteina spike, 9 in B.1.1.7, 10 in B.1.351, e 12 in P.1, rispetto alla sequenza di Wuhan. Le più preoccupanti sono le mutazioni nel dominio di legame al recettore (RBD) della proteina spike. L'RBD è contenuto nella subunità S1 di spike ed è responsabile dell'interazione con il recettore cellulare SARS-CoV-2 dell'enzima di conversione dell'angiotensina-2 (ACE2) (Hoffmann et al., 2020). La superficie di interazione di ACE2 della RBD è una zona relativamente piccola di 25 amminoacidi sulla punta della RBD (Shang et al., 2020), e a causa del suo ruolo cruciale nell'attacco virale, è anche il sito di legame di molti potenti anticorpi neutralizzanti (Cerutti et al., 2021). Si pensa che il blocco dell'interazione RBD-ACE2 svolga un ruolo importante nella protezione naturale e indotta dai vaccini dall'infezione da SARS-CoV-2. Un certo numero di tali anticorpi monoclonali (mAbs) sono stati combinati in cocktail che sono in sperimentazione avanzata per il trattamento e la profilassi della SARS-CoV-2 (Yang et al., 2020). La superficie legante ACE2 è in qualche misura il tallone d'Achille del virus, poiché può essere bloccata da alcuni anticorpi neutralizzanti; tuttavia, poiché è così piccola, minaccia anche la fuga immunitaria, poiché piccoli cambiamenti possono far saltare gli anticorpi neutralizzanti, quindi
- 6. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 riducendo la capacità dell'immunità naturale o acquisita tramite vaccino di contenere la replicazione virale. La pressione selettiva per i cambiamenti nella superficie di interazione dell'ACE2 può quindi avere due motori completamente separati. In primo luogo, poiché la SARS-CoV- 2 ha recentemente attraversato una barriera zoonotica, ci si può aspettare che l'evoluzione della superficie di interazione di ACE2 possa avvenire per aumentare l'affinità con ACE2 e quindi aumentare la trasmissibilità virale. In secondo luogo, al contrario, i cambiamenti della superficie di interazione di ACE2 possono anche ridurre la protezione offerta da precedenti infezioni o vaccinazioni, portando potenzialmente alla fuga dall'immunità preesistente indotta dall'infezione naturale o dai vaccini. Tutti e tre i ceppi di SARS-CoV-2 recentemente identificati hanno acquisito mutazioni nella superficie di interazione ACE2 della RBD: N501Y in B.1.1.7; K417N, E484K, e N501Y in B.1.351; e K417T, E484K e N501Y in P.1. Tutte e tre le varianti possono portare ad un aumento della trasmissibilità, con buone prove per questo con B.1.1.7 nel Regno Unito. Questi si sono rapidamente espansi fino a diventare i ceppi dominanti nelle regioni in cui sono stati identificati per la prima volta e la diffusione globale, in particolare per B.1.1.7 e B.1.351, sta causando notevole preoccupazione. Qui esaminiamo la neutralizzazione di un isolato virale B.1.351 e la confrontiamo con la neutralizzazione di Victoria (SARS-CoV-2/human/ AUS/VIC01/2020), un primo isolato legato a Wuhan. I test di neutralizzazione vengono eseguiti su un ampio pannello di mAbs (Dejnirattisai et al., 2021), sieri di convalescenti dei primi tempi della pandemia, sieri di pazienti affetti da B.1.1.7, e infine sieri di destinatari dei vaccini Oxford- AstraZenca e Pfizer-BioNTech. C'è l'evidenza di una diffusa fuga dai mAbs, di cui forniamo una descrizione strutturale e biofisica. La neutralizzazione di B.1.351 da parte dei sieri di individui infettati naturalmente o vaccinati è significativamente ridotta, portando in alcuni casi a una completa incapacità di neutralizzare il virus B.1.351. RISULTATI Cambiamenti mutazionali in B.1.351 Sono stati descritti diversi isolati di B.1.351, tutti con le mutazioni chiave K417N, E484K e N501Y nella RBD. Tegally et al. (2021) hanno riportato un isolato che contiene 10 cambiamenti rispetto alla sequenza di Wuhan: L18F, D80A, D215G, L242- 244 eliminate, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G, e A701V. Il sequenziamento del ceppo usato in questo rapporto, da un caso nel Regno Unito, mostra solo 8 cambiamenti e manca L18F e R246I rispetto all'isolato di Tegally et al. (2021). Le sequenze del genoma di Coronavi- rus sono state analizzate sia nel Regno Unito, acquisite dal database COVID- 19 Genomics UK (COG-UK) (Tatusov et al., 2000), che in Sud Africa, acquisite dalla Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data (GISAID) (https://www.gisaid. org). Sembra che B.1.1.7 e B.1.351 siano diventati rapidamente dominanti nel Regno Unito e in Sud Africa, rispettivamente. Nell'evoluzione sia della variante B.1.1.7 nel Regno Unito che della La variante B.1.351 in Sudafrica, una popolazione sostanziale di mutanti di sola delezione del dominio N-terminale (NTD) (D69-70 in B.1.1.7 e D242-244 in B.1.153), e mutanti di sola N501Y sono stati osservati in entrambi i paesi prima della crescente dominanza di ceppi che ospitano sia delezioni che 501Y (Figure 1A e 1B). I conteggi di entrambe le varianti ''single-mutant'' sono poi diminuiti. Le mutazioni caratteristiche per B.1.351 come trovate in Sud Africa 2 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021
- 7. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO Figura 1. Evoluzione della variante B.1.351 (A e B) Finestra scorrevole di 7 giorni che mostra la proporzione di sequenze con wild-type (grigio), solo mu- tazione 501Y (verde), solo delezione NTD (viola), e variante a doppia mutazione (nero) per (A) sequenze selezionate contenenti UK, delezione NTD 69-70 e (B) Sudafrica, cancellazione NTD 241-243. (C) Grafico della struttura che mostra la distribuzione delle mutazioni delle sequenze di varianti sudafricane definite da N501Y e dalla delezione 241-243; le mutazioni puntuali sono segnate in giallo e le delezioni in grigio scuro. I grafici della struttura usano la struttura della proteina spike (struttura originale dal PDB: 6ZWV) dove è stata modellata, e i modelli sono stati estesi in Coot per i loop mancanti. (D) Le posizioni dei principali cambiamenti nella proteina spike sono evidenziate nella NTD e nella RBD. (E) Posizioni delle mutazioni K417N, E484K, e N501Y (giallo-basso) all'interno della superficie di interazione con ACE2 (verde scuro) di RBD. La vista è scelta per chiarezza ed è correlata a quella mostrata in (C) da una rotazione di 45○ intorno all'asse che esce dalla pagina (per rendere la RBD verticale rispetto a C) e una rotazione di quasi 180○ intorno all'asse lungo del dominio RBD. (F) Una rappresentazione lineare del picco B.1.351 con i cambiamenti segnati. Si noti che il ceppo utilizzato in questo rapporto non ha mutazioni L18F e R246I. sono mostrati nelle figure 1C-1E. Inoltre, al 2 febbraio 2021, nel database COG-UK, 21 delle sequenze B.1.1.7 sono state osservate per aver acquisito indipendentemente la mutazione 484K (ma non la 417N) trovata nella variante B.1.351, e 90 sequenze mostrano queste mutazioni nel background di B.1.351 (come definito dal portare la caratteristica delezione D242-244 NTD). Neutralizzazione di B.1.351 da parte del plasma convalescente Abbiamo raccolto plasma da una coorte di pazienti infetti durante la prima ondata di infezione da SARS-CoV-2 nel Regno Unito. I campioni sono stati raccolti da casi convalescenti 4-9 settimane dopo l'infezione nel giugno 2020, prima della comparsa di B.1.1.7 (Dejnir- attisai et al., 2021). Abbiamo anche incluso una recente raccolta di plasma da pazienti infettati da B.1.1.7 (Supasa et al., 2021). I titoli di neutralizzazione contro Victoria, un primo ceppo di SARS-CoV-2 correlato a Wuhan (Caly et al., 2020; Seemann et al., 2020), sono stati confrontati con B.1.351 usando un test di neutralizzazione con riduzione del focus (FRNT). Per i campioni di convalescenza precoce (n = 34), i titoli di neutralizzazione contro B.1.351 erano, in media, ridotti di 13,3 volte
- 8. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 rispetto a Victoria (p < 0,0001) (Fig. 2A; Tabella S1A). Alcuni campioni convalescenti, ad esempio 4, 6 e 15 hanno mantenuto una buona neutralizzazione di B.1.351, ma per la maggior parte, i livelli sono stati notevolmente ridotti. Significativamente, 18 dei 34 campioni non sono riusciti a raggiungere il 50% di neutralizzazione ad una diluizione plasmatica di 1:20, con un certo numero che mostra una riduzione quasi totale dell'attività di neutralizzazione. Complessivamente, nei 34 campioni di plasma convalescente c'era un 13,3 volte (media geometrica) riduzione del titolo di neutralizzazione tra Victoria e B.1.351 (p <0,0001) (Figura 2C). La neutralizzazione è stata eseguita anche utilizzando il plasma recentemente raccolto, in diversi punti temporali, da pazienti affetti da B.1.1.7 (n = 13). Tutti questi casi avevano S-gene knockout sulla PCR diagnostica (Thermo Fisher Scientific TaqPath, caratteristica di B.1.1.7), e 11 avevano sequenziamento virale che confermava B.1.1.7 (Fig. 2B; Tabella S1B). I titoli di neutralizzazione erano bassi nei primi tempi sia per Victoria che per B.1.351, ma un caso (B.1.1.7 P4), un campione preso 1 giorno dopo l'ammissione in ospedale, ha mostrato un titolo molto alto contro Victoria (1:136,884) e B.1.351 (1:81,493). Noi ipotizziamo che questo possa rappresentare una reinfezione con B.1.1.7. Nel complesso, c'era una riduzione di 3,1 volte (media geometrica) dei titoli tra Victoria e B.1.351 nei sieri dei pazienti infettati da B.1.1.7 (Figura 2D). Neutralizzazione di B.1.351 da parte del siero del vaccino Abbiamo poi misurato la neutralizzazione di Victoria e B.1.351 utilizzando il siero vaccinale ottenuto da individui vaccinati con il vaccino Pfizer-BioNTech BNT162b2 o il vaccino Oxford- AstraZe- neca AZD1222. Per Pfizer-BioNTech, il siero vaccinato Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 3
- 9. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o (legenda alla pagina seguente)
- 10. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 4 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021
- 11. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO è stato ottenuto da operatori sanitari (n = 25) 4-17 giorni dopo la seconda dose di vaccino, somministrata 3 settimane dopo la prima dose (Figura 3A; Tabella S2). Per il vaccino AstraZeneca, i campioni (n = 25) sono stati ottenuti 14 o 28 giorni dopo la seconda dose di vaccino, con un intervallo di dosaggio di 8-14 settimane (Figura 3B; Tabella S2). Per il siero del vaccino Pfizer-BioNTech, i titoli medi geo- metrici per B.1.351 erano 7.6-fold inferiori a quelli per Victo- ria (p < 0.0001) (Figura 3C). Per il siero del vaccino Oxford- AstraZeneca, i titoli medi geometrici di B.1.351 erano 9 volte inferiori a quelli di Victoria (p < 0.0001) (Figura 3D;Tabella S2). Il plasma prelevato prima della prima dose del vaccino Oxford- AstraZeneca ha mostrato, come previsto, una neutralizzazione minima o assente dei virus Victoria o B.1.351 (Figura S1). Il siero del vaccino Pfizer-BioNTech ha indotto titoli di neutralizzazione 3,6 volte superiori contro il ceppo Victoria rispetto al vaccino Oxford-As- traZeneca (p < 0,0001). Anche se la riduzione complessiva dei titoli era abbastanza simile, 7,6 volte contro 9 volte, rispettivamente, perché i titoli AstraZeneca iniziavano da una base più bassa, più campioni non sono riusciti a raggiungere il 50% di titoli FRNT contro B.1.351 (9/25) che per il vaccino Pfizer (2/25), anche se uno di questi (Pfizer 2) ha anche mostrato bassi titoli di neutralizzazione contro il virus Victoria. Neutralizzazione di B.1.351 da parte di un ampio pannello di mAbs Abbiamo prodotto e caratterizzato un pool di 377 mAbs umani diretti alla proteina spike, cresciuti da campioni convalescenti ottenuti da pazienti infettati durante la prima ondata di SARS- CoV-2 nel Regno Unito prima di giugno 2020; pertanto, non sono stati indotti in risposta all'infezione con ceppi recenti di SARS-CoV-2 (Dejnirattisai et al., 2021). Abbiamo selezionato i 20 mAbs più potenti (titoli FRNT50 < 100 ng/mL, 19 anti-RBD e 1 anti-NTD) e abbiamo eseguito test di neutralizzazione contro i ceppi Victoria e B.1.351 (Figura 4; Tabella S3A). Gli effetti sulla neutralizzazione mAb sono stati gravi, 14 di 20 anticorpi avevano >10 volte caduta in titoli di neutralizzazione, con la maggior parte di questi mostrando un knockout completo di attività. Questo è in linea con i ruoli chiave di K417, E484, e N501, in particolare E484, nel riconoscimento anticorpale della superficie di interazione ACE2 del RBD descritto di seguito e nelle figure 5A-5G. È interessante notare che il singolo potente anticorpo legante NTD incluso in queste analisi, mAb 159, ha anche mostrato un knockout completo dell'attività contro B.1.351, che include la delezione degli aminoacidi 242-244 nella NTD, parte dell'epitopo per mAb 159. Come si può vedere dalle figure 5H e 5I, l'anello RBD 246-253 interagisce con la catena pesante (HC) di mAb 159 e anche quella di 4A8, un altro potente legante neutralizzante NTD con una struttura riportata (Chi et al., 2020). La delezione 242-244 altera senza dubbio la presentazione di questo ciclo, compromettendo il legame con questi mAb. Il legame a questo cosiddetto ''supersito'' è stato segnalato come di potenziale rilevanza terapeutica (McCallum et al., 2021). Il I lignaggi B.1.1.7, B.1.351, e P.1 sono tutti convergenti con delezioni o cambiamenti sistematici nella NTD. Anche se P.1 non ospita delezioni NTD, ci si aspetta che i cambiamenti L18F, T20N e P26S (Faria et al., 2021) abbiano un impatto marcato sul legame all'epitopo NTD. Poiché queste caratteristiche convergenti possono essere sorte prima di una forte pressione selettiva da parte delle risposte anticorpali, sembra probabile che ci sia un driver biologico sottostante ancora da scoprire, come l'aumento del legame del recettore e la potenziale maggiore trasmissibilità impartita dalle mutazioni RBD, che può causare questo epitopo per essere estremamente suscettibile alla mu- tazione e alla fuga dal legame anticorpale. Neutralizzazione di B.1.351 da parte di mAbs in studi clinici in fase avanzata Un certo numero di mAbs sono in fase avanzata di sperimentazione clinica come terapia o profilassi contro la SARS-CoV-2 (Ku et al., 2021; Baum et al., 2020). Regeneron e AstraZeneca usano cocktail di 2 mAbs per dare resistenza alla fuga mutazionale dei virus (Kemp et al., 2021). Abbiamo eseguito saggi di neutralizzazione con la coppia Regeneron REGN10933 e REGN10987 e la coppia AstraZeneca AZD106 e AZD8895 (Figura 4B; Tabella S3B). La neutralizzazione di REGN10987 non è stata influenzata da B.1.351, mentre REGN10933 è stata gravemente compromessa (773 volte) (Figura 4B; Tabella S2). La neutralizzazione da parte della coppia di anticorpi AZ era poco influenzata da B.1.351 rispetto a Victoria. Comprendere l'abrogazione della neutralizzazione: ACE2 che si lega a B.1.351 RBD La tripla mutazione K417N, E484R e N501Y è caratteristica del B.1.351 RBD. Questi residui sono situati all'interno dell'impronta di ACE2 (Figura 1E), e l'evoluzione in vitro per ottimizzare l'affinità per ACE2 ha suggerito che conferiscono una maggiore affinità per il recettore (Starr et al., 2020; Zahradnı´k et al., 2021). Per indagare questo effetto, abbiamo misurato la cinetica del legame di ACE2 solubile a RBD ricombinante mediante interferometria a biolayer (BLI) (Figure 6A e 6B). Come previsto, l'affinità per B.1.351 RBD è alta; infatti, è 19 volte superiore a quella della Victoria RBD e 2,7 volte superiore a quella di B.1.1.7 ((Dejnirattisai et al., 2021); Supasa et al., 2021). Il KD è 4,0 nM, Kon è 4,78E4/ Ms, e Koff è 1,93E-4/s; quindi, il tasso di spegnimento è circa Questo esacerberà ulteriormente il declino della potenza osservato nei saggi di neutralizzazione, dal momento che gli anticorpi di minore af- finità lotterà per competere con ACE2 a meno che non hanno un molto lento off-rate o mostrare un effetto avidità per bloccare l'attaccamento. Così, mentre tutta la nostra serie di potenti leganti RBD hanno un'affinità superiore a quella tra ACE2 e Victoria o B.1.1.7 RBD (KDs di 75,1 e 10,7 nM, rispettivamente), cinque dei 19 hanno affinità inferiore o uguale a quella per ACE2 e B.1.351 RBD. Un piccolo ulteriore Figura 2. Neutralizzazione dei virus Victoria e B.1.351 da parte del plasma convalescente Il plasma è stato raccolto nel Regno Unito prima di giugno 2020, durante la prima ondata di SARS-CoV-2, nella prima fase di convalescenza, 4-9 settimane
- 12. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 dopo il ricovero in ospedale. (A) Saggi FRNT che confrontano la neutralizzazione di Victoria (arancione) e B.1.351 (verde) (n = 34). (B) Test di neutralizzazione di Victoria e B.1.351 con plasma ottenuto da pazienti affetti da infezione da B.1.1.7 nei tempi indicati dopo l'infezione. (C e D) Confronto dei titoli FRNT50 tra i ceppi B.1.351 e Victoria per il plasma convalescente e B.1.1.7, rispettivamente. Il test Wilcoxon matched-pairs signed rank sum è stato utilizzato per l'analisi e sono stati calcolati i valori p a due code; i valori medi geometrici sono indicati sopra ogni colonna. I dati alla base delle curve di neutralizzazione di Victoria sono stati precedentemente riportati (Supasa et al., 2021). I singoli valori FRNT50 sono riportati nella tabella S1. Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 5
- 13. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o (legenda alla pagina seguente)
- 14. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 6 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021
- 15. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO aumento dell'affinità (ad esempio, 2 volte) batterebbe quasi tutti gli anticorpi ((Dejnirattisai et al., 2021); Supasa et al., 2021). L'influenza delle mutazioni RBD sull'affinità dei mAb Per capire l'ordine di grandezza dell'abrogazione nella neutralizzazione di più di due terzi dei 19 mAbs potenti che legano la RBD, abbiamo misurato il KD per il legame alla RBD recombi- nante da BLI (Figure 6C e 6D; Tabella S3). I risultati sono netti: mentre per i frammenti leganti l'antigene (Fabs) testati contro Victoria, 17 avevano KD inferiori a 4 nM (l'affinità di ACE2 per B.1.351) contro B.1.351, questo si riduce a 4 (o 2 se le versioni a catena leggera [LC] di 253 vengono rimosse [(Dejniratti- sai et al., 2021)]), con 7 Fabs che non riescono a raggiungere un'affinità quasi micromolare. Questi risultati seguono ampiamente i risultati di neutralizzazione (confrontare i pannelli C e D della Figura 6; vedi Tabella S3), suggerendo che il modello osservato di effetti sulla neutralizzazione è in gran parte dovuto alle sostituzioni di aminoacidi nel RBD, cioè, K417N, E484K, e N501Y. La base strutturale per la perdita del legame mAb Cerchiamo di capire la base di questi effetti nel contesto di una descrizione anatomica della RBD. In termini di torso umano, abbiamo definito quattro epitopi strutturali quasi contigui: spalla sinistra, collo, spalla destra e fianco destro, con un epitopo separato sul fianco sinistro (Dejnirattisai et al., 2021) (Figura 6E). In questo contesto, il sito di legame di ACE2 si estende attraverso il collo ed entrambe le spalle. N501Y è sulla spalla destra, K417N sul retro del collo, e E484R sulla spalla sinistra. Anche se le tre mutazioni sono nominalmente in epitopi diversi, la natura sovrapposta di questi epitopi significa che i residui sono sufficientemente vicini in modo che più di uno potrebbe influenzare direttamente il legame di qualsiasi anticorpo. Inoltre, ci possono essere effetti allosterici (l'equivalente strutturale dell'epistasi in genetica) per cui gli effetti possono estendersi su una certa distanza. Nonostante questi caveat, la maggior parte degli effetti osservati sono direttamente spiegati dal riferimento alla conoscenza strutturale precedente. L'effetto di N501Y e K417N sul legame mAb Molti dei complessi Fab/SARS-CoV-2 RBD riportati sono per gli anticorpi che utilizzano la regione pubblica dell'immunoglobulina HC variabile (IGHV) IGHV3-53 ((Dejnirattisai et al., 2021); Yuan et al., 2020), e questi sono ben rappresentati nel nostro set da cinque anticorpi che sono potenti contro il virus Victoria. Quattro di questi, 150, 158, 175 e 269, hanno le loro capacità di neutralizzazione e di legame gravemente compromesse o abolite, mentre 222 è un'eccezione, poiché il suo legame non è influenzato dalla variante B.1.351 (figure 6F e 6G). La famiglia di anticorpi IGHV3-53 si lega allo stesso epitopo nella parte posteriore del collo della RBD, con orientamenti di approccio molto simili condivisi anche dai Fabs IGHV3-66. La maggior parte di questi stabilisce contatti diretti con K417 e N501, ma nessuno di loro contatta E484. Le regioni determinanti la complementarità-3 (CDR3s) piuttosto corte di queste Fabs sono solitamente posizionate direttamente sopra K417 (Dejnirattisai et al., 2021), formando legami a idrogeno o ponti salini così come interazioni idrofobiche, mentre N501 interagisce con il loop CDR1 LC (Figura 5) (Supasa et al., 2021). Tuttavia, il mAb 150 è un po' diverso, formando sia un ponte salino tra K417 e il LC CDR3 D92 che un legame idrogeno tra N501 e S30 nel LC CDR1 (Figura 5B), mentre 158 è più tipico, formando un legame idrogeno dall'ossigeno carbonilico di G100 del HC CDR3 e K417 e contatti idrofobici da S30 del LC CDR1 a N501. Ci aspetteremmo quindi che gli effetti combinati delle mutazioni K417N e N501Y compromettessero gravemente il legame della maggior parte dei mAbs della classe IGHV3-53 e IGHV3-66. Tuttavia, un membro di questa classe, 222, non è influenzato né dalla variante B.1.1.7 (Supasa et al., 2021) né da quella B.1.351. Fortunatamente, fino ad oggi non siamo stati in grado di ottenere una struttura del 222 Fab con RBD o spike. Tuttavia, abbiamo precedentemente notato che il p2c-2f11 Fab (PDB: 7CDI [Wajnberg et al., 2020]) il cui LC è più simile in sequenza, e ha le stesse lunghezze CDR- L1, L2, e L3, al mAb 222 non fa alcun contatto con N501 (Supasa et al., 2021). Esaminando da vicino le strutture dei complessi Fab e RBD IGHV3-53 e IGHV3-66, abbiamo scoperto che Fab CB6 (PDB: 7C01 [Shi et al., 2020]) ha le stesse lunghezze CDR-H1-3 e fa solo contatti idrofobici a K417 da Y33, Y52, e D104 del HC. Cambiando il K in N a 417 in questa struttura complessa e selezionando uno dei rotamers favorevoli della catena laterale si vede che N417 potrebbe fare legami idrogeno sia a Y33 che a Y52, compensando la perdita di contatto con D104 (Figure 5F e 5G). In 222, Y33 e Y52 sono conservati e D104 è ri-posto da un N. Noi ipotizziamo che l'interazione di 222 con K417 potrebbe essere simile a CB6, spiegando la sua resistenza al B.1.351 variante. Gli effetti della mutazione E484K Fab 88 lega RBD nella parte posteriore della spalla sinistra, i residui G104 e K108 del HC CDR3 contattano E484, e il LC CDR2 fa ampie interazioni idrofobiche e un legame idrogeno catena principale da Y51 e un ponte salino da D53 a K417 (Figura 5A). Il cambiamento di carica a E484 da negativo a positivo e l'accorciamento della catena laterale del residuo 417 da K a N dovrebbero abolire tutte queste interazioni, spiegando la perdita di diverse centinaia di volte in KD. Il mAb 384 è uno dei più potenti mAb neutralizzanti che abbiamo trovato contro il virus Victo- ria. Questo mAb si avvicina al sito di legame dalla parte anteriore della spalla sinistra, seppellendo l'82% dell'area accessibile al solvente di E484 attraverso il legame a idrogeno con Y50, T57 e Y59 e facendo un ponte salino con R52 del LC CDR2 (Figura 5D), Figura 3. Neutralizzazione di B.1.351 da parte del siero del vaccino (A e B) Curve di neutralizzazione FRNT per i ceppi Victoria e B.1.351 da (A) 25 sieri prelevati 7-17 giorni dopo la seconda dose del vaccino Pfizer-BioNTech e (B) 25 sieri prelevati 14 o 28 giorni dopo la seconda dose del vaccino Oxford-AstraZeneca. (C e D) Confronto dei titoli FRNT50 tra i ceppi B.1.351 e Victoria per i vaccini Pfizer-BioNTech e Oxford-AstraZeneca, rispettivamente. Il test Wilcoxon
- 16. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 matched-pairs signed rank sum è stato utilizzato per l'analisi e sono stati calcolati i valori p a due code; i valori medi geometrici sono indicati sopra ogni colonna. I dati alla base delle curve di neutralizzazione di Victoria sono stati precedentemente riportati (Supasa et al., 2021). I singoli valori FRNT50 sono riportati nella tabella S2. Vedi anche la Figura S1. Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 7
- 17. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o (legenda alla pagina seguente)
- 18. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 8 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021
- 19. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO spiegando così l'impatto catastrofico della mutazione E484K sul legame (Tabella S3). Anticorpi resistenti a K417N, E484K e N501Y Il mAb 222 non era l'unico anticorpo a mostrare resistenza a B.1.351. Anche i titoli FRNT50 per i mAb 55, 165, 253 e 318 erano relativamente uguali tra Victoria e B.1.351, indicando che i loro epitopi non sono perturbati dalle mutazioni K417N, E484K e N501Y. Gli anticorpi 55, 165 e 253 sono imparentati tra loro, e abbiamo precedentemente dimostrato che la combinazione delle LC di 55 o 165 con l'HC di 253 porta a un aumento >1 logdei titoli di neutralizzazione (Dejnirattisai et al., 2021). Le chimere 253H/55L e 253H/165L possono entrambe neutralizzare B.1.351, con titoli FRNT50 di 9 e 13 ng/mL, rispettivamente. Strutture di 253 e queste chimere Fabs con RBD o spike mostrano che si legano quasi iden- ticamente allo stesso epitopo e non contattare nessuno dei tre residui del sito di mutazione, correlando bene con la neutralizzazione e BLI dati vincolanti (Figura 5C). DISCUSSIONE I coronavirus sono virus RNA a filamento positivo e, sebbene la RNA polimerasi possieda una limitata capacità di proofreading, sono intrinsecamente inclini al cambiamento mutazionale. L'evoluzione della SARS-CoV-2 da una probabile introduzione zoonotica in un singolo punto a Wuhan nel novembre o dicembre 2019 è stata ampiamente contrastata e ha portato all'istituzione di una sorveglianza delle sequenze virali come il COG-UK nel Regno Unito. Simili sforzi di sorveglianza sono stati avviati in un certo numero di paesi, ma globalmente la copertura è insufficiente, con grandi popolazioni a rischio con poca o nessuna capacità. La recente comparsa di tre ceppi di SARS-CoV-2, B.1.1.7, B1.351, e P.1, che possono conferire una maggiore transmissibilità, è avvenuta indipendentemente nel Regno Unito, in Sud Africa e in Brasile, dove sono diventati rapidamente ceppi dominanti e si stanno ora diffondendo a livello globale. Mentre le sequenze sono marcatamente diverse, ciascuna contenente 9-12 cambiamenti, ci sono due temi comuni. Il primo tema coinvolge la superficie di interazione ACE2 della RBD: tutti condividono la mutazione N501Y, mentre B.1.351 e P.1 condividono E484K e N501Y ed entrambi B.1.351 e P.1 hanno cambiamenti a 417, 417T in P.1 e 417N in B.1.351. Il secondo tema è quello delle cancellazioni nella NTD: 69-70 e 144 in B.1.1.7 e 242-244 in B.1.351, entrambi i quali interromperanno i siti di legame degli anticorpi neutralizzanti anti-NTD, come dimostrato qui dal fallimento della neutralizzazione del mAb 159 anti-NTD. Anche se P.1 non possiede delezioni NTD, è costellato di mutazioni puntiformi in questa regione che possono conferire proprietà funzionali simili. Nonostante i cambiamenti in B.1.351, la capacità neutralizzante residua è presente in molti sieri convalescenti e vacini, con alcuni individui che mostrano una riduzione minima dei titoli rispetto al ceppo Victoria. Anche se la maggior parte dei potenti mAbs ha subito una sostanziale riduzione o eliminazione dell'attività, un certo numero è stato in grado di neutralizzare B.1.351, tra cui 222, 318, 253/55, e 353/165, la coppia AstraZeneca AZD1061 e AZD889, e Regeneron REGN10987, che non contatta nessuno dei siti di mutazione, mentre REGN10933 contatti sia 417 e 484 e legame è abrogato. Analizzando le strutture note dei comlessi Fab/RBD, siamo in grado di razionalizzare gli effetti su tutti i potenti leganti del virus Victoria in termini di interazioni con i tre residui mutati nel RBD. Quanta ulteriore mutazione nella RBD questi anticorpi saranno in grado di sopportare non è noto, ma l'uso di cocktail di anticorpi per proteggersi dalle varianti virali che si verificano sia durante una singola infezione, sia a livello di popolazione, sembra essere una strategia valida. Tuttavia, si deve riconoscere che l'uso della terapia o della profilassi con mAb, in particolare per periodi prolungati in individui immunocompromessi con infezione cronica, è probabile che guidi l'emergere di mutazioni di resistenza. L'emergere diffuso di ceppi varianti, in particolare con la mutazione E484K, può rendere prudente lo sviluppo di mAb per colpire il cambiamento 484K. Potrebbe anche essere possibile ri-ingegnerizzare gli anticorpi terapeutici candidati esistenti; un esempio di come sottili cambiamenti possano conferire resilienza è mostrato dal mAb 222, che possiede la regione V di IGHV3-53. Mentre tutti gli altri anticorpi IGHV3-53 sono gravemente compromessi nel legare B.1.351, un leggero cambiamento nella lunghezza dell'HC CDR3 e una scelta adeguata di LC permettono al mAb 222 di mantenere la potenza contro B.1.1.7 e B.1.351. Recentemente sono stati riportati esperimenti di evoluzione in vitro (Starr et al., 2020) in cui il virus vivo è stato indotto a evolversi di fronte alla pressione immunitaria di mAbs o siero policlonale. È interessante notare che l'uso ripetuto della terapia con plasma in un individuo immu- nocompromesso ha portato all'emergere transitorio della mutazione N501Y così come la delezione 69-70 nell'NTD, che è caratteristica di B.1.1.7 (Kemp et al., 2021). Inoltre, il passaggio se- riale del virus in concentrazioni sub-neutralizzanti di plasma im- mune ha portato alla comparsa della delezione di F140 e alla creazione di una nuova sequenza di glicosilazione N-linked nell'NTD insieme alla mutazione E484K RBD (Andreano et al., 2020). In alternativa, la visualizzazione su lievito di librerie di mutanti RBD è stata utilizzata per selezionare varianti per la fuga dal legame al siero immunitario o in alternativa per una maggiore affinità di legame al recettore ACE2 (Zahradn'ık et al., 2021). Di grande interesse è il fatto che tutti questi approcci hanno portato all'identificazione di un insieme comune di mutazioni trovate nei virus varianti che sono ora in circolazione. Le principali sono N501Y trovate in tutte le linee B.1.1.7, B.1.351 e P.1 e E484K trovate in B.1.351 e P.1. Queste mutazioni aumentano l'affinità della RBD per ACE2 di 2,7 volte per B.1.1.7 (Su-Pasa et al., 2021) e di 19 volte per B.1.351, il che è compatibile con l'osservazione che i virus che portano le mutazioni E484K e N501Y le mutazioni hanno probabilmente una maggiore trasmissibilità. Qui, dimostriamo che il ceppo B.1.351 CoV-2 è molto più difficile da neutralizzare rispetto ai ceppi parentali; 14 su 20 di un pannello di mAbs sono seriamente compromessi o la neutralizzazione è completamente eliminata. Su siero
- 20. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 convalescente, il Figura 4. Neutralizzazione da parte di potenti mAbs (A) Curve di neutralizzazione per Victoria e B.1.351 usando 22 anticorpi monoclonali umani (mAbs). (B) Curve di neutralizzazione dei ceppi Victoria e B.1.351 utilizzando coppie di mAb di Regeneron e AstraZeneca. I dati alla base delle curve di neutralizzazione Victoria sono stati precedentemente riportati (Supasa et al., 2021). I singoli valori FRNT50 sono riportati nella tabella S3. Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 9
- 21. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o Figura 5. Interazioni di siti di mutazione resi con una selezione di RBD-binding mAbs (A-D) Interazioni di (A) Fab 88 con K417 e E484 della RBD (PDB: 7BEL), (B) 150 con N501 e K417 (PDB: 7BEI), (C) 253 non ha contatto con nessuno dei tre siti di mutazione (PDB: 7BEN), e (D) Fab 384 con solo E484 (PDB: 7BEP). (E) Strutture dei Fabs IGHV3-51 e IGHV3-66 sovrapponendo le dorsali Ca della RBD. (F) Interazioni di K417 con CB6 Fab (PDB: 7C01 [Wajnberg et al., 2020]). (G) La mutazione K417N è modellata nel complesso RBD/ CB6. In (A) a (G), la catena leggera Fab, la catena pesante e RBD sono in blu, salmone e grigio, rispettivamente. Le dorsali Ca sono disegnate in e le catene laterali in quelle più spesse. I contatti (%4 Å ) sono mostrati come linee tratteggiate gialle e i legami idrogeno e i ponti salini come linee tratteggiate blu. (H e I) Posizioni delle mutazioni e la delezione nel NTD spike della variante B.1.351 rispetto agli anticorpi legati (H) 159 (PDB: 7NDC) e (I) 4A8 (PDB: 7C2L); la delezione 242-244 sarebbe pre- previsto per interrompere l'interazione di 159 e 4A4. I domini variabili della catena pesante e della catena leggera (Vh e Vl) dei Fabs sono mostrati come superfici salmone e blu, rispettivamente, e l'NTD come bastoncini grigi. I siti di mutazione sono disegnati come sfere verdi e le delezioni come sfere magenta. I titoli di neutralizzazione sono ridotti di 13,3 volte per B.1.351 rispetto al ceppo Victoria, con 14 su 34 che non riescono a raggiungere un NT50 a una diluizione 1:20 e un certo numero che mostra quasi un completo abbattimento dell'attività. Resta da determinare se questo riflette una focalizzazione della risposta immunitaria in questi individui, come è stato visto, per esempio, per il picor- navirus enterovirus-71 (Huang et al., 2020). I titoli di neutralizzazione per i vaccini Oxford- AstraZeneca e Pfizer sono stati ridotti in modo simile con B.1.351 da 9 volte e 7.6 volte, rispettivamente. Per
- 22. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 il vaccino Oxford-AstraZeneca rispetto al vaccino Pfizer, più sieri non sono riusciti a raggiungere FRNT50 alla diluizione 1:20, e poiché la riduzione dei titoli FRNT50 tra i due vaccini era abbastanza simile, questo effetto era dovuto ai titoli di partenza 3,6 volte inferiori per il vaccino Ox- ford- AstraZenca rispetto al vaccino Pfizer- BioNTech . Tuttavia, entrambi i vaccini Oxford- AstraZeneca e Pfizer danno una sostanziale efficacia iniziale dopo una singola dose di vaccino contro i ceppi parentali (~76 e 89%, rispettivamente) (https://assets.publishing.service.gov. uk/government/uploads/system/uploads/ attachment_data/file/961287/Greenbook_ chapter_14a_v7_12Feb2021.pdf; Baden et al, 2021; Polack et al., 2020, (Voysey et al., 2021b)), il che implica che i titoli anticorpali neutralizzanti richiesti per questo livello di protezione sono modesti. Dati molto recenti suggeriscono che il vaccino Novavax, che ha raggiunto il 95,6% di efficacia contro i precedenti ceppi di SARS-CoV-2 e l'85,6% contro B.1.1.7 nel Regno Unito, ha avuto un'efficacia ridotta del 60% in Sud Africa, dove si stima che il 92,6% delle infezioni sia stato B.1.351 (https://www.novavax.com/sites/default/ files/2021- 02/20210202-NYAS-Novavax-Final.pdf). Inoltre, i dati dello studio Novavax in Sudafrica indicano che circa un terzo dei partecipanti allo studio erano sieropositivi al momento dell'arruolamento; tuttavia, nel braccio placebo dello studio, c'era 10 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021
- 23. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO Figura 6. Interazione RBD dell'anticorpo e modellazione strutturale (A e B) grafici BLI che mostrano una serie di titolazione del legame ad ACE2 (vedi metodi STAR) per (A) Wu- han RBD e (B) K417N, E484K, e N501Y B.1.351 RBD. Si noti il tasso di spegnimento molto più lento per B.1.351. (C e D) KD di interazione RBD/mAb misurata da BLI per WT Wuhan RBD (punti di sinistra) e K417N, E484K, e N501Y B.1.351 RBD (punti di destra). (E) Epitopi definiti dal clustering dei mAbs sulla RBD (grigio). (F) BLI dati mappati sulla RBD utilizzando il metodo descritto in (Dejnirattisai et al., 2021). Le viste anteriore e posteriore della RBD sono rappresentate con le sfere che rappresentano i siti di legame degli anticorpi colorati secondo il rapporto (KDB.1.351/ KDWuhan). Per il bianco, il rapporto è 1; per il rosso, è <0.1 (cioè, almeno 10 volte riduzione). I punti neri si riferiscono agli anticorpi mappati non inclusi in questa analisi; verde scuro alla superficie di legame RBD ACE2; e giallo ai mutati K417N, E484K, e N501Y. (G) Come per la coppia di sinistra, ma colorati secondo il rapporto dei titoli di neutralizzazione (concentrazione inibitoria semimassima [IC50]B.1.351/[IC50]Victoria). Per il bianco, il rapporto è 1; per il rosso, è <0,01 (cioè, almeno 100 volte la riduzione). Si noti la forte concordanza tra i due effetti, con il 269 che è il più fortemente colpito. Gli anticorpi rosa vicini sono principalmente gli anticorpi IGHV3-53 e IGHV3-66. nessuna differenza nel tasso di infezione nei volontari sieronegativi rispetto a quelli sieropositivi (3,9 contro 3,9%), il che implica una mancanza di protezione della precedente esposizione alla SARS-CoV-2 rispetto all'infezione con B.1.351. Il vaccino monodose COVID-19 della Janssen ha mostrato un'efficacia del 72% nel prevenire la malattia moderata e grave, che è stata ridotta al 57% in Sudafrica. Infine, un recente rapporto dal Sudafrica su un campione di piccole dimensioni suggerisce una sostanziale perdita di efficacia per il vaccino Oxford-AstraZeneca contro l'infezione da B.1.351 (10,6% di efficacia contro la malattia lieve-moderata [Madhi et al., 2021]). Non ci sono ancora rapporti sull'efficacia del vaccino Pfizer-Bio- NTech contro B.1.351; tuttavia, i titoli di neutralizzazione qui riportati suggeriscono che un certo grado di efficacia sarà mantenuto. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che una precedente infezione o vaccinazione con ceppi ancestrali di SARS-CoV-2 potrebbe non fornire una protezione adeguata contro B.1.351. Ciò che sta guidando l'evoluzione di B.1.351 è difficile da disen- trarre. Da un lato, qui mostriamo un aumento di circa 20 volte dell'affinità per ACE2 rispetto a Wuhan RBD, che può influenzare la trasmissibilità. D'altra parte, la sostanziale fuga immunitaria anticorpale da B.1.351 sta probabilmente giocando un ruolo in paesi come il Sud Africa, dove i tassi di infezione precedente sono relativamente alti (stima >30%). Il compromesso tra l'aumento dell'affinità e della trasmissibilità di ACE2 e la fuga immunitaria è probabilmente complesso; come l'immunità della popolazione aumenta a causa della vaccinazione
- 24. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 e l'infezione naturale, la pressione evolutiva per le varianti virali da selezionare aumenta. La capacità di generare varianti RBD ad altissima affinità per ACE2 nell'intervallo sub- picomolare mediante evoluzione in vitro (Zahradnı´k et al., 2021), un'affinità più alta di quasi tutti i mAbs descritti finora, è motivo di preoccupazione. Se tali virus con estrema affinità ACE2/RBD siano vitali è chiaramente sconosciuto, e l'estrema cautela dovrebbe essere esercitata se questo sce- nario dovrebbe mai essere testato usando virus vivi. In sintesi, la recente comparsa di molteplici ceppi di varianti della SARS-CoV-2 ha sconvolto la fiducia sulla possibilità che l'attuale generazione di vaccini fornisca una protezione a lungo termine contro l'infezione. La possibilità di sfuggire all'immunità naturale e indotta dal vaccino ha spinto a capire le conseguenze di questi cambiamenti e a sviluppare nuovi costrutti di vaccino su misura per le varianti, in particolare incorporando la mutazione E484K. Come gli individui precedentemente infettati o vaccinati rispondono a questi nuovi vaccini varianti sarà oggetto di un intenso studio nei prossimi mesi, poiché c'è la consapevolezza generale che il problema attuale non è finito. Tuttavia, anche se le risposte anticorpali alle nuove varianti non sono in grado di prevenire l'infezione, possono moderarne la gravità. Inoltre, le risposte delle cellule T allo spike potrebbero non essere interrotte dai cambiamenti mutazionali ed essere in grado di limitare la diffusione al tratto respiratorio inferiore e prevenire la malattia grave. Devono essere implementati sistemi di sorveglianza intensiva per monitorare l'emergere di nuove varianti e, in particolare, essere mirati alla ricerca di infezioni rivoluzionarie in Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 11
- 25. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o vaccinati. Il lavoro sui vaccini di seconda e anche terza generazione per colpire i virus varianti e più in generale per sviluppare immunogeni per obiettivi meno dipendenti dalla superficie di interazione ACE2-RBD meritano ulteriori studi. Limiti dello studio I campioni di vaccino e di convalescenza usati negli studi di neutralizzazione in questo rapporto sono stati prelevati presto e i titoli potrebbero aumentare ulteriormente; al contrario, è anche probabile che i titoli diminuiscano con il tempo e che la protezione da B.1.351 offerta dalle risposte anticorpali ai primi ceppi di SARS-CoV-2 possa ridursi. Sarà anche importante sapere come il siero degli individui infettati da B.1.351 sia in grado di neutralizzare i primi ceppi legati a Wuhan e le varianti B.1.1.7 e P.1 recentemente ri-portate. Inoltre, dato che E484K sembra essere una mutazione così importante per quanto riguarda il legame anticorpale e la neutralizzazione, gli studi futuri possono cercare di definire i mAbs da individui infettati da virus E484K per fornire protezione da questi ceppi di virus che sono sotto pressione per emergere, crediamo principalmente attraverso una maggiore fitness impartita dalla maggiore affinità di RBD per ACE2. Infine, sarà importante determinare se la vaccinazione o l'infezione naturale con i primi ceppi di SARS- CoV-2 offrono ancora protezione dalla malattia grave e dall'ospedalizzazione, i parametri più importanti del successo del vaccino. STELLA+METODI I metodi dettagliati sono forniti nella versione online di questo documento e comprendono quanto segue: d TABELLA DELLE RISORSE CHIAVE d DISPONIBILITÀ DELLE RISORSE B Contatto principale B Disponibilità dei materiali B Disponibilità di dati e codici d MODELLO SPERIMENTALE E DETTAGLI DEL SOGGETTO B Scorte virali B Ceppi batterici e coltura cellulare B Partecipanti B Siero dei vaccini Pfizer B Procedure di studio del vaccino AstraZeneca- Oxford e trattamento dei campioni d DETTAGLI DEL METODO B COG-UK Analisi delle sequenze B Test di neutralizzazione della riduzione del fuoco (FRNT) B Clonazione di RBD nativo, ACE2 e RBD K417N, E484K, N501Y B Produzione di proteine B Interferometria a bio-strato d QUANTIFICAZIONE E ANALISI STATISTICA INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI Informazioni supplementari possono essere trovate online su https://doi.org/10.1016/j.cell. 2021.02.037. RICONOSCIMENTI Questo lavoro è stato supportato dal Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Science (CIFMS), Cina (grant 2018-I2M- 2-002) a
- 26. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 D.I.S. e G.R.S. H.M.E.D. e J.R. sono sostenuti dal Wellcome Trust (101122/Z/13/Z), Y.Z. dal Cancer Research UK (C375/A17721), e D.I.S. e E.E.F. dal Medical Research Council del Regno Unito (MR/N00065X/1). D.I.S. è un investigatore Jenner. Siamo grati per una sovvenzione Fast Grants, Mercatus Center, per sostenere l'isolamento di mAbs umani contro SARS-CoV-2 e Schmidt Futures per il supporto di questo lavoro. G.R.S. è anche sostenuto come Wellcome Trust Senior Inves- tigator grant 095541/A/11/Z. Questo è un contributo del centro UK Instruct-ERIC. Il Wellcome Centre for Human Genetics è sostenuto dal Wellcome Trust (grant 090532/Z/09/Z). Il virus usato per i test di neutralizzazione è stato un dono di Julian Druce, Doherty Centre, Melbourne, Australia. Chanice Knight, Emily Chiplin, Ross Fothergill e Liz Penn hanno contribuito ai saggi. Riconosciamo il Diamond Light Source per il tempo sulla Beamline I03 sotto la proposta lb27009 per COVID-19 Rapid Access. Un enorme ringraziamento ai team, specialmente al Diamond Light Source e al Dipartimento di biologia strutturale dell'Università di Oxford, che hanno permesso di continuare il lavoro durante la pandemia. Gli aspetti computazionali di questa ricerca sono stati supportati dal Wellcome Trust Core Award Grant 203141/Z/16/Z e dal NIHR Oxford BRC. Il lavoro di Oxford Vaccine è stato sostenuto da UK Research and Innovation, Coalition for Epidemic Preparedness In- novations, National Institute for Health Research (NIHR), NIHR Oxford Biomedical Research Centre, e Thames Valley and South Midland's NIHR Clinical Research Network. Ringraziamo il team clinico Oxford Protective T-cell Immunology for COVID-19 (OPTIC) per la raccolta dei campioni dei partecipanti e l'Oxford Immunology Network COVID-19 Response T cell Consortium per il supporto di laboratorio. Riconosciamo la rapida condivisione della variante B.1.351, che è stata iso- lata dagli scienziati del National Infection Service di PHE Porton Down. Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Salute e dell'Assistenza Sociale del Regno Unito come parte del Consorzio PITCH (Protective Immunity from T cells to COVID-19 in Health Workers), il Consorzio di Immunologia dei Coronavirus del Regno Unito (UK-CIC) e la Huo Family Foundation. E.B. e P.K. sono NIHR Senior Investigators, e P.K. è finanziato da WT109965MA e NIH (U19 I082360). J.C.K. è un Wellcome Investigator (WT204969/Z/16/Z) ed è sostenuto dal NIHR Oxford Biomedical Research Centre e dal CIFMS. D.S. è un NIHR Academic Clinical Fellow, e S.F.L. è finanziato come ricercatore clinico del Wellcome Trust. Le opinioni ex- premuto in questo articolo sono quelli degli autori e non necessariamente quelli del Servizio Sanitario Nazionale (NHS), il Dipartimento della Salute e dell'Assistenza Sociale (DHSC), il NIHR, il Medical Research Council (MRC), o la Salute Pubblica, Inghilterra. CONTRIBUTI DELL'AUTORE D.Z. ha eseguito le analisi di interazione BLI. J.R., E.E.F., H.M.E.D. e D.I.S. hanno analizzato i risultati strutturali. G.R.S., J.M., P.S., Y.Z., D.Z., G.C.P. e C.L. ha preparato i costrutti spike, RBD, ACE2 e gli anticorpi. W.D. ha formato saggi di neutralizzazione con B.W., R.N., A.T., J.S.-C. e C.L.-C. B.H., N.C., K.B., S.C., N.B., I.S., H.H., K.G., N.G., e A.S. hanno fornito il virus B.1.351 e hanno contribuito al disegno sperimentale. D.C. e W.J. hanno fornito i materiali. H.M.G. ha scritto mabscape e ha eseguito la mappatura e l'analisi dei cluster, comprese le analisi delle sequenze. A.J.M., S.F.L., E.B., S.J.D., D.S., C.D., R.L., T.D., A.J.P., J.C.K., P.K., M.W.C., T.L., S.B., A.F., M.B., S.B.-R. S.G. ha assistito con i campioni dei pazienti e le prove del vaccino. E.B., M.C., S.J.D., P.K., e D.S. hanno concepito lo studio degli operatori sanitari vaccinati e hanno supervisionato lo studio OPTIC sugli operatori sanitari e la raccolta/elaborazione dei campioni. G.R.S. e D.I.S. hanno scritto la bozza iniziale del manoscritto con altri autori che hanno fornito commenti editoriali. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto. DICHIARAZIONE DI INTERESSI G.R.S. fa parte del comitato consultivo scientifico di GSK Vaccines. L'Università di Oxford detiene la proprietà intellettuale relativa al vaccino Oxford-AstraZeneca. A.J.P. è presidente del Comitato congiunto per la vaccinazione e l'immunizzazione (JCVI) del Ministero della Salute e dell'assistenza sociale del Regno Unito (DHSC), ma non partecipa al comitato COVID-19 del JCVI, ed è un membro del SAGE dell'OMS. Le opinioni espresse in questo articolo non rappresentano necessariamente le opinioni del DHSC, del JCVI o dell'OMS. L'Università di Oxford è entrata in una partnership con AstraZeneca sullo sviluppo del vaccino contro il coronavirus. L'Università di Oxford ha protetto la proprietà intellettuale divulgata in questa pubblicazione. 12 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021
- 27. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO Ricevuto: 8 febbraio 2021 Rivisto: 16 febbraio 2021 Accettato: 17 febbraio 2021 Pubblicato: 23 febbraio 2021 RIFERIMENTI Andreano, E., Piccini, G., Licastro, D., Casalino, L., Johnson, N.V., Paciello, I., Monego, S.D., Pantano, E., Manganaro, N., Manenti, A., et al. (2020). SARS- CoV-2 fuga in vitro da un plasma convalescente COVID-19 altamente neutralizzante. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.12.28.424451. Aricescu, A.R., Lu, W., and Jones, E.Y. (2006). Unsistemaefficiente in termini di tempo e costi per la produzione di proteine di alto livello in cellule di mammifero. Acta CrystallogrDBiol Crystallogr62,1243-1250. Baden,L.R.,ElSahly,H.M.,Essink,B.,Kotloff,K.,Frey,S.,Novak,R.,Diemert, D., Spector, S.A., Rouphael, N., Creech, C.B., et al.; COVE Study Group (2021). Efficacia e sicurezza del vaccino mRNA-1273 SARS-CoV-2. N. Engl. J. Med. 384,403–416. Baum,A.,Fulton,B.O.,Wloga,E.,Copin,R.,Pascal,K.E.,Russo,V.,Giordano, S.,Lanza,K.,Negron,N.,Ni,M.,etal. Il cocktail dianticorpicontro la proteina spike di SARS-CoV- 2 impedisce la rapida fuga mutazionale vista con singolianticorpi.Scienza369,1014-1018. Caly, L., Druce, J., Roberts, J., Bond, K., Tran, T., Kostecki, R., Yoga, Y., Naughton, W., Taiaroa, G., Seemann, T., et al. (2020). Isolamento erapida condivisionedelnuovocoronavirus2019(SARS-CoV- 2)dalprimopazientediagnosticato con COVID-19 in Australia. Med. J. Aust. 212,459–462. Cerutti, G., Guo, Y., Zhou, T., Gorman, J., Lee, M., Rapp, M., Reddem, E.R., Yu, J., Bahna, F., Bimela, J., et al. (2021). Potenti Anticorpi Neutralizzanti SARS-CoV-2 Diretti contro il Dominio N-Terminale dello Spike mirano ad un singolo contatto di piombo Supersite. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2021.01.10.426120. Chi,X.,Yan,R.,Zhang,J.,ZhangG.,Zhang,Y.,Hao,M.,Zhang,Z.,Fan,P., Dong,Y.,Yang,Y.,etal.Unanticorpoumanoneutralizzantesi legaal dominioN- terminaledellaproteinaSpikediSARS-CoV-2Scienza369,650-655. Dejnirattisai, W., Zhou, D., Ginn, H.M., Duyvesteyn, H.M.E., Supasa, P., Case, J.B., Zhao, Y., Walter, T.S., Mentzer, A.J., Liu, C., et al. L'anatomia antigenica del dominio di legame del recettore SARS-CoV-2. Cell 184. https://doi.org/ 10.1016/j.cell.2021.02.032. Faria, N.R., Claro, I.M., Candido, D., Moyses Franco, L.A., Andrade, P.S., Co- letti, T.M., Silva, C.A.M., Sales, F.C., Manuli, E.R., Aguiar, R.S., et al. (2021). Genomic characterisation of an-emergent SARS-CoV-2 lineage in Manaus: preliminary findings - SARS-CoV-2 coronavirus / nCoV-2019 Genomic Epidemiology - Virological. virological.org. https://virological.org/t/genomic- characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2- lineage-in-manaus-preliminary- findings/586. Hoffmann, M.,Kleine-Weber, H.,Schroeder, S.,Kru¨ger, N.,Herrler, T., Erichsen, S., Schiergens, T.S., Herrler, G., Wu, N.H., Nitsche, A., et al. (2020). L'ingresso nelle cellule di SARS-CoV-2 dipende da ACE2 e TMPRSS2 ed è bloccato da un inibitore della proteasi clinicamente provato. Cell181, 271-280.e8. Huang, K.A., Zhou, D., Fry, E.E., Kotecha, A., Huang, P.N., Yang, S.L., Tsao, K.C., Huang, Y.C., Lin, T.Y., Ren, J., e Stuart, D.I. (2020). Strutturale e analisi funzionale degli anticorpi protettivi che hanno come bersaglio il triplice plateau di enterovirus 71. Nat. Commun. 11, 5253. Kemp, S.A., Collier, D.A., Datir, R.P., Ferreira, I.A.T.M., Gayed, S., Jahun, A., Hosmillo, M., Rees-Spear, C., Mlcochova, P., Lumb, I.U., et al.; CITIID- NIHR BioResource COVID-19 Collaboration; COVID-19 Genomics UK (COG-UK) Consortium (2021). Evoluzione della SARS-CoV-2 durante il trattamento dell'infezione cronica. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586- 021-03291-y. Keogh-Brown, M.R., Jensen, H.T., Edmunds, W.J., e Smith, R.D. (2020). L'impatto di Covid-19, i comportamenti e le politiche associate sull'economia del Regno Unito: Un modello di equilibrio generale computabile. SSM Popul. Health12, 100651. Krammer, F. (2020). Vaccini SARS-CoV-2 in sviluppo. Natura586, 516-527.
- 28. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Ku,Z.,Xie,X.,Davidson,E.,Ye,X.,Su,H.,Menachery,V.D.,Li,Y.,Yuan,Z., Zhang, X., Muruato, A.E., et al. Determinanti molecolari e meccanismo per il cocktail di anticorpi che previene la fuga di SARS-CoV-2. Nat. Commun. 12,469. Lu,R.,Zhao,X.,Li,J.,Niu,P.,Yang,B.,Wu,H.,Wang,W.,Song,H.,Huang,B., Zhu, N., et al. (2020). Caratterizzazione genomica ed epidemiologia del 2019 romanzo coronavirus: implicazioni per le origini del virus e il legame del recettore. Lancet 395,565-574. Madhi, S.A., Baillie, V., Cutland, C.L., Voysey, M., Koen, A.L., Fairlie, L., Pa- dayachee, S.D., Dheda, K., Barnabas, S.L., Bhorat, Q.E., et al. (2021). Sicurezza ed efficacia del vaccino ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) cOVID-19 contro la variante B.1.351 in Sud Africa. medRxiv. https://doi.org/10.1101/2021. 02.10.21251247. McCallum, M., De Marco, A., Lempp, F., Tortorici, M.A., Pinto, D., Walls, A.C., Beltramello, M., Chen, A., Liu, Z., Zatta, F., et al. (2021). La mappatura antigenica del dominio N-terminale rivela un sito di vulnerabilità per SARS-CoV-2. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2021.01.14.426475. Nettleship, J.E., Ren, J., Rahman, N., Berrow, N.S., Hatherley, D., Barclay, A.N., e Owens, R.J. (2008). Una pipeline per la produzione di frammenti di anticorpi perstudistrutturaliutilizzando l'espressionetransitoriaincelluleHEK293TPro- tein Expr Purif62,83-89. Polack,F.P.,Thomas,S.J.,Kitchin,N.,Absalon,J.,Gurtman,A.,Lockhart,S., Perez,J.L.,Pe´rezMarc,G.,Moreira,E.D.,Zerbini,C.,etal.;C4591001Clinical TrialGroup(2020).SicurezzaedefficaciadelBNT162b2mRNACovid-19Vac- cine. N. Engl. J. Med. 383, 2603–2615. Seemann, T., Lane, C.R., Sherry, N.L., Duchene, S.,Gonc¸alves da Silva, A., Caly, L., Sait, M., Ballard, S.A., Horan, K., Schultz, M.B., etal. (2020). Tracciare la pandemia COVID-19 in Australia usando la genomica. Nat. Commun. 11,4376. Shang,J.,Ye,G.,Shi,K.,Wan,Y.,Luo,C.,Aihara,H.,Geng,Q.,Auerbach,A., andLi,F.(2020).Basestrutturaledelriconoscimento delrecettoreda parte dellaSARS-CoV-2Na- tura581, 221-224. Shi,R.,Shan,C.,Duan,X.,Chen,Z.,Liu,P.,Song,J.,Song,T.,Bi,X.,Han,C., Wu,L.,etal.Unanticorponeutralizzanteumanosi rivolge al sito di legame del recettore di SARS-CoV-2.Nature584,120-124. Starr, T.N., Greaney, A.J., Hilton, S.K., Ellis, D., Crawford, K.H.D., Dingens, A.S., Navarro, M.J., Bowen, J.E., Tortorici, M.A., Walls, A.C., et al. (2020). La scansione mutazionale profonda del dominio di legame del recettore della SARS-CoV-2 rivela Vincoli sul ripiegamento e sul legame con ACE2. Cell 182, 1295-1310.e20. Supasa, P., Zhou, D., Dejnirattisai, W., Chang, L., Mentzer, A.J., Ginn,H.M., Zhao, Y., Duyvesteyn, H.M.E., Nutalai, R., e Tuekprakhon, A. (2021). RidottaneutralizzazionedellavarianteSARS-CoV-2B.1.1.7dall'immunità anticorpale acquisitanaturalmente e indotta dal vaccino.SSRN. Tatusov,R.L.,Galperin,M.Y.,Natale,D.A.eKoonin,E.V.(2000).Il database COG: uno strumento per l'analisi su scala genomica delle funzioni e dell'evoluzione delle proteine. Nucleic Acids Res.28,33-36. Tegally, H., Wilkinson, E., Lessells, R.J., Giandhari, J., Pillay, S., Msomi, N., Mlisana, K., Bhiman, J.N., von Gottberg, A., Walaza, S., et al. Sedici nuovi lignaggi di SARS-CoV-2 in Sudafrica. Nat. Med. https://doi.org/10. 1038/s41591-021-01255-3. Voysey, M., Clemens, S.A.C., Madhi, S.A., Weckx, L.Y., Folegatti, P.M., Aley, P.K., Angus, B., Baillie, V.L., Barnabas, S.L., Bhorat, Q.E., et al.; Ox- ford COVID Vaccine Trial Group (2021a). Sicurezza ed efficacia del vaccino ChA- dOx1 nCoV-19 (AZD1222) contro la SARS-CoV-2: un'analisiintermedia di quattro studi randomizzati controllati in Brasile, Sud Africa e Regno Unito.Lancet397,99-111. Voysey, M., Clemens, S.A.C., Madhi, S.A., Weckx, L.Y., Folegatti, P.M., Aley, P.K., Angus, B., Baillie, V.L., Barnabas, S.L., Bhorat, Q.E., et al. (2021b). Somministrazione di una singola dose e l'influenza della tempistica della dose di richiamo sull'immunogenicità e l'efficacia del vaccino ChAdOx1nCoV- 19 (AZD1222). SSRN. https://www.ssrn.com/abstract=3777268. Wajnberg, A., Amanat, F., Firpo, A., Altman, D.R., Bailey, M.J., Mansour, M., McMahon, M., Meade, P., Mendu, D.R., Muellers, K., et al. (2020). Robusto Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 13
- 29. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o anticorpi neutralizzanti contro l'infezione da SARS-CoV-2 persistono per mesi. Scienza 370, 1227–1230. Yang,L.,Liu,W.,Yu,X.,Wu,M.,Reichert,J.M.,eHo,M.(2020).COVID-19 antibody therapeutics tracker: un database globale online di anticorpi terapeutici. tica per la prevenzione e il trattamento della COVID-19. Antib. Ther. 3, 205– 212. Yuan, M., Liu, H., Wu, N.C., Lee, C.D., Zhu, X., Zhao, F., Huang, D., Yu,, Hua, Y., Tien, H., et al. (2020). Base strutturale di una risposta anticorpale condivisa alla SARS-CoV-2. Scienza 369, 1119-1123. Zahradnı´k,J.,Marciano,S.,Shemesh,M.,Zoler,E.,Chiaravalli,J.,Meyer,B., Dym,O.,Elad,N.,andSchreiber,G.(2021). L'evoluzioneinvitro della SARS-CoV- 2RBD segue ladiffusione dellamutazionecontagiosa,magenerauninibitore diinfezionecapace. bioRxiv, 2021.01.06.425392. Zhou, D., Duyvesteyn, H.M.E., Chen, C.P., Huang, C.G., Chen, T.H., Shih, S.R., Lin, Y.C., Cheng, C.Y., Cheng, S.H., Huang, Y.C., et al. Strutturale base strutturale per la neutralizzazione della SARS-CoV-2 da parte di un anticorpo di un paziente convalescente paziente. Nat Struct Mol Biol 27, 950- 958.
- 30. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 14 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021
- 31. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 SARS-CoV-2 (Australia/VIC01/2020) SARS-CoV-2/B.1.1.7 Batteri DH5a Caly et al., 2020 Salute pubblica in Inghilterra In Vitrogen N/A N/A Cat#18263012 Articol o ll ACCESSO APERTO STELLA+METODI TABELLA DELLE RISORSE CHIAVE REAGENTE o IDENTIFICATORE DI RISORSE Anticorpi Fab(Dejnirattisai et al., 2021 )N/A IgG(Dejnirattisai et al., 2021 )N/A Anti-NP umano (mAb 206)(Dejnirattisai et al., 2021 )N/A Regeneron mAbsAstraZenecaCat#REGN10933, e REGN10987 AstraZeneca mAbsAstraZenecaCat#AZD1061, AZD8895 Anti-IgG umane (Fc specifiche)- PerossidasiSigmaCat#A0170 RRID: AB_257868 Ceppi batterici e virali Campioni biologici Prodotti chimici, peptidi e proteine ricombinanti (Continua nella pagina seguente) RBD di SARS-CoV-2 legato a His SARS-CoV-2 RBD legato a His K417N, E484K, N501Y ACE2 umano legato a lui ACE2 umano-hIgG1Fc Compresse di soluzione salina tamponata al fosfato Dulbecco's Modified Eagle Medium, alto glucosio Dulbecco's Modified Eagle Medium, a basso contenuto di glucosio FreeStyle 293 Expression Medium L-Glutamina-Penicillina- Streptomicina soluzione Siero bovino fetale Polietilenimina, ramificata Carbossimetilcellulosa Strep-Tactin®XT HEPES Cloruro di sodio brodo LB Mem Neaa (100X) Tripsina-EDTA L-Glutammina 200 mM (100X) SYPROorange (5000X in DMSO) Isopropyl b-d-1-thiogalactopyranoside Kanamicina Questo document o Questo document o N/A N/A Questo documento Questa carta Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich N/A N/A Cat#P4417 Cat#D5796 Sigma-Aldrich Cat#D6046 GIBCO Sigma-Aldrich Cat#12338018 Cat#G1146 GIBCO Sigma-Aldrich Sigma IBA Lifesciences Melford Honeywell Fisher Scientific UK GIBCO GIBCO GIBCO Thermo Meridian Bioscience Melford Cat#12676029 Cat#408727 Cat#C4888 Cat#2-1206-025 Cat#34587-39108 Cat#SZBF3340H Cat#51577-51656 Cat#2203945 Cat#2259288 Cat#2036885 Cat#S6651 Cat#BIO-37036 Cat#K22000 Siero di individui vaccinati alla Pfizer Siero di individui vaccinati da AstraZeneca-Oxford Plasma di pazienti con SARS-CoV-2 Università di Oxford Università di Oxford N/A N/A Ospedale John Radcliffe di Oxford UK N/A
- 32. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021 e1
- 33. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o Continua REAGENTE o IDENTIFICATORE DI RISORSE Modelli sperimentali: linee cellulari Cellule HEK293S GnTI- ATCCCat#CRL-3022 RRID: CVCL_A785 Cellule HEK293ATCCCat#CRL-3216 RRID: CVCL_0063 Expi293F CellsGIBCO,Cat#A14527 Criceto: ExpiCHO cellsThermo FisherCat#A29133 Cellule VeroATCCCat#CCL-81RRID: CVCL_0059 DNA ricombinante Vettore: pNEO(Aricescu et al., 2006 )N/A Vettore: pOPING-ET(Nettleship et al., 2008 )N/A ACE2 umano cDNASourcebiosciencesCat#5297380 Vettore: catena pesante IgG1 umanaGermanCancer Research Center, Heidelberg, Germania (H. Wardemann Vettore: catena leggera umana lambdaGermanCancer Research Center, Heidelberg, Germania (H. Wardemann Vettore: catena leggera kappa umanaGermanCancer Research Center, Heidelberg, Germania (H. Wardemann N/A N/A N/A Vettore: Fab umanoUniversità di OxfordN/A Software e algoritmi PyMOLSchrodinger https://pymol.org/2/; RRID: SCR_000305 Software di acquisizione dati 11.1.0.11Fortebiohttps://www.sartorius.com/en/products/ protein-analysis/octet- systems-software Software di analisi dei dati HT 11.1.0.25Fortebiohttps://www.sartorius.com/en/products/ protein-analysis/octet- systems-software Prisma 8.0GraphPadhttps://www.graphpad.com/ scientific-software/prism/ RRID: SCR_002798 mabscapeQuesta cartahttps://github.com/helenginn/mabscape https://snapcraft.io/mabscape IBM SPSS Software 26 IBM https://www.ibm.com/us-en/?ar=1 RRID: SCR_019096 Vettore: ScFv umano Università di Oxford, NDM (G. Screaton) N/A Lisozima Tris-base Imidazolo Triton X-100 Turbonucleasi RNase A NaCl MgSO4 Na2HPO4 NaH2PO4 Sigma-Aldrich Melford Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich QIAGEN Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Melford Melford Cat#L6876 Cat#T60040 Cat#56750 Cat#8787 Cat#T4330 Cat#158922 Cat#S9888 Cat#746452 Cat#S23100 Cat#S23185 Vettore: pHLsec (Aricescu et al., 2006) N/A
- 34. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Altro (Continua nella pagina seguente) e2 Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021 TALON® Superflow Metal Affinity Resin HiLoad® 16/600 Superdex® 200 pg Superdex 200 increase 10/300 GL column HisTrap HP 5-ml column Colonna HiTrap Heparin HT da 5 ml Clontech Cytiva Cytiva Cytiva Cytiva Cytiva Cat#635668 Cat#28-9893-35 Cat#28990944 Cat#17524802 Cat#17040703
- 35. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO Continua REAGENTE o IDENTIFICATORE DI RISORSE Biosensori amminici reattivi di seconda generazione (AR2G) FortebioCat#18-5092 DISPONIBILITÀ DI RISORSE Contatto principale Le risorse, i reagenti e le ulteriori informazioni richieste devono essere inoltrate al contatto principale, David I Stuart (dave@strubi.ox.ac.uk). Disponibilità dei materiali I reagenti generati in questo studio sono disponibili presso il contatto principale con un accordo di trasferimento dei materiali completato. Disponibilità dei dati e del codice Mabscape è disponibile presso https://github.com/helenginn/mabscape, https://snapcraft.io/mabscape. I dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili su richiesta presso gli autori corrispondenti. MODELLO SPERIMENTALE E DETTAGLI DEL SOGGETTO Azioni virali SARS-CoV-2/human/AUS/VIC01/2020 (Caly et al., 2020) e SARS-CoV-2/B.1.351, forniti dal Public Health England, sono stati entrambi coltivati in cellule Vero (ATCC CCL-81). Le cellule sono state infettate con il virus SARS-CoV-2 usando un MOI di 0,0001. Il virus contenente il super-natante è stato raccolto all'80% di CPE e centrifugato a 2000 rpm a 4○C prima della conservazione a -80○C. I titoli virali sono stati determinati da un saggio di focalizzazione su cellule Vero. Sia Victoria passaggio 5 e B.1.351 passaggio 4 stock sono stati sequenziati per verificare che conteneva la sequenza prevista proteina spike e senza modifiche ai siti di furina scissione. Il virus B1.351 utilizzato in questi studi conteneva le seguenti mutazioni: D80A, D215G, L242- 244 cancellato, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V. Ceppi batterici e coltura cellulare Le cellule Vero (ATCC CCL-81) sono state coltivate a 37○C in Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio (Sigma-Aldrich) sup- pletato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM GlutaMAX (GIBCO, 35050061) e 100 U/ml di penicillina-streptomicina. I mAbs umani sono stati espressi in cellule HEK293T coltivate in UltraDOMA PF Protein-free Medium (Cat# 12-727F, LONZA) a 37○C con 5% CO2. I batteri E.coli DH5a sono stati utilizzati per la trasformazione del plasmide pNEO- RBD K417N, E484K, N501Y. Una singola colonia è stata raccolta e coltivata in brodo LB con 50 mg mL-1 Kanamicina a 37○C a 200 rpm in un agitatore per una notte. Le cellule HEK293T (ATCC CRL-11268) sono state coltivate in DMEM alto glucosio (Sigma-Aldrich) integrato con 10% FBS, 1% 100X Mem Neaa (GIBCO) e 1% 100X L-Gluta- mine (GIBCO) a 37○C con 5% CO2. Per esprimere RBD, RBD K417N, E484K, N501Y e ACE2, le cellule HEK293T sono state coltivate in DMEM ad alto contenuto di glucosio (Sigma) integrato con 2% FBS, 1% 100X Mem Neaa e 1% 100X L-Glutamina a 37○C per la trasfezione. Partecipanti I partecipanti sono stati reclutati attraverso tre studi: Sepsis Immunomics [Oxford REC C, riferimento:19/SC/0296]), ISARIC/WHO Clin- ical Characterization Protocol for Severe Emerging Infections [Oxford REC C, riferimento 13/SC/0149] e il Gastro-intestinal illness in Oxford: COVID sub studio [Sheffield REC, riferimento: 16/YH/0247]. La diagnosi è stata confermata attraverso la segnalazione di sintomi coerenti con COVID-19 e un test positivo per SARS-CoV-2 utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) da un tampone del tratto respiratorio superiore (naso/gola) testato in laboratori accreditati. Un campione di sangue è stato prelevato, previo consenso, almeno 14 giorni dopo la comparsa dei sintomi. Le informazioni cliniche tra cui la gravità della malattia (infezione lieve, grave o critica secondo le raccomandazioni dell'Organizzazione Mondiale della Sanità) e i tempi tra l'insorgenza dei sintomi e il campionamento e l'età del partecipante sono stati raccolti per tutti gli individui al momento del campionamento. Siero dei vaccinati Pfizer Il siero del vaccino Pfizer è stato ottenuto 7-17 giorni dopo la seconda dose di vaccino che è stata somministrata 3 settimane dopo Ottetto RED96e Fortebio Sistema di scambio tampone ''QuixStand Sonics vibra-cell vcx500 sonicator GE Healthcare VWR https://www.sartorius.com/en/products/ proteina-analisi/sistemi di rilevamento senza etichetta a ottetto Cat#56-4107-78 Cat#432-0137
- 36. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 la prima dose (i partecipanti erano al meglio delle loro conoscenze sieronegativi all'ingresso). Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021 e3
- 37. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll ACCESSO APERTO Articol o Lo studio è stato approvato dall'Oxford Translational Gastrointestinal Unit GI Biobank Study 16/YH/0247 [comitato etico di ricerca (REC) dello Yorkshire & The Humber - Sheffield]. Lo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human- subjects/) e le linee guida della International Conference on Harmonization (ICH) Good Clinical Practice (GCP). Il consenso informato scritto è stato ottenuto per tutti i pazienti arruolati nello studio. I vaccinati erano operatori sanitari, con sede presso l'Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, non noti per avere una precedente infezione da SARS-CoV-2. Ognuno ha ricevuto due dosi di vaccino COVID-19 mRNA BNT162b2, 30 mg, somministrato per via intramuscolare dopo diluizione in una serie di due dosi (0,3 mL ciascuna) a distanza di 18-28 giorni. L'età media dei vaccini era di 43 anni (range 25-63), 11 maschi e 14 femmine. Procedure di studio del vaccino AstraZeneca-Oxford e trattamento dei campioni Tutti i dettagli dello studio controllato randomizzato di ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222), sono stati precedentemente pubblicati (PMID: 33220855/PMID: 32702298). Questi studi sono stati registrati presso ISRCTN (15281137 e 89951424) e ClinicalTrials.gov (NCT04324606 e NCT04400838). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e lo studio è stato fatto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki (2008) e la buona pratica clinica. Gli studi sono stati sponsorizzati dall'Università di Oxford (Ox- ford, UK) e l'approvazione è stata ottenuta da un comitato etico nazionale (South Central Berkshire Research Ethics Committee, riferimento 20/SC/0145 e 20/SC/0179) e da un'agenzia di regolamentazione nel Regno Unito (Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency). Un DSMB indipendente ha esaminato tutte le relazioni intermedie sulla sicurezza. Una copia dei protocolli è stata inclusa nelle pubblicazioni precedenti (PMID: 33220855/PMID: 32702298). I dati dei volontari vaccinati che hanno ricevuto due vaccinazioni sono inclusi in questo documento. Le dosi del vaccino erano 5 3 1010 particelle virali (dose standard; coorte SD/SD n = 21) o metà dose come prima dose (dose bassa) e una dose standard come seconda dose (coorte LD/SD n = 4). L'intervallo tra la prima e la seconda dose era nell'intervallo di 8-14 settimane. I campioni di sangue sono stati raccolti e il siero separato il giorno della vaccinazione e in giorni prestabiliti dopo la vaccinazione, ad esempio, 14 e 28 giorni dopo la spinta. DETTAGLI DEL METODO Analisi delle sequenze COG-UK Le sequenze COG-UK del 2 febbraio 2021 (Tatusov et al., 2000), e le sequenze GISAID (https://www.gisaid.org/) del Sud Africa del 30 gennaio 2021 sono state scaricate e la sequenza della proteina Spike è stata ottenuta dopo il nucleotide 21000, seguita dall'allineamento di sequenza e dal riconoscimento delle mutazioni. La variante B.1.351 è stata filtrata utilizzando i criteri di selezione 501Y e D242. La variante B.1.1.7 è stata filtrata usando i criteri di selezione 501Y e D69. Le posizioni strutturali delle mutazioni sono state modellate in rosso (mutazioni a punto singolo), nero (delezioni) o blu (aggiunte) sulla struttura Spike con la dimensione proporzionale al logaritmo dell'incidenza, e le mutazioni con incidenza superiore al 5% nella popolazione sono state esplicitamente etichettate. Focus Reduction Neutralization Assay (FRNT) Il potenziale di neutralizzazione dell'Ab è stato misurato usando il Focus Reduction Neutralization Test (FRNT), dove la riduzione del numero di focolai infetti viene confrontata con un pozzo di controllo negativo senza anticorpo. In breve, l'Ab o il plasma diluito in serie è stato mescolato con il ceppo SARS-CoV-2 Victoria o B.1.351 e incubato per 1 ora a 37○C. Le miscele sono state poi trasferite in micropiastre a fondo piatto a 96 pozzetti, trattate per la coltura cellulare, contenenti monostrati di cellule Vero confluenti in duplicato e incubate per altre 2 ore, seguite dall'aggiunta di un mezzo di copertura semisolido all'1,5% di carbossimetilcellulosa (CMC) ad ogni pozzetto per limitare la diffusione del virus. Un focus form-ing test è stato poi eseguito colorando le cellule Vero con umano anti-NP mAb (mAb206) seguita da perossidasi coniugata capra anti-human IgG (A0170; Sigma). Infine, i foci (cellule infettate) circa 100 per pozzetto in assenza di anticorpi, sono stati visualizzati aggiungendo il substrato TrueBlue Peroxidase. I foci delle cellule infettate dal virus sono stati contati sul classico lettore AID EliSpot utilizzando il software AID ELISpot. La percentuale di riduzione dei focolai è stata calcolata e l'IC50 è stata determinata utilizzando il programma probit del pacchetto SPSS. Clonazione di RBD nativo, ACE2 e RBD K417N, E484K, N501Y I costrutti di RBD nativo e ACE2 sono gli stessi di (Zhou et al., 2020). Per clonare RBD K417N, E484K, N501Y, un costrutto di RBD con la mutazione N501Y (Supasa et al., 2021) è stato usato come modello e quattro primer di RBD (K417N primer Forward 50- CAGGGCAGACCGGCAATCGCCGACTACAATTAC-30, K417N primer reverse 50-GTAATTGTAGTCGGCGATGCCGGTCT GCCCTG-30, E484K Forward primer 50-CACCGTGTAATGGCGTGAAGGGCTTCAATTGCTAC-30 e E484K reverse primer 50- GTAGCAATTGAAGCCCTTCACGCCATTACGGTG-30) e due primer del vettore pNEO (Forward primer 50- CAGCTCCTGGG- CAACGTGCT-30 e reverse primer 50-CGTAAAAGGAGCAACATAG-30 ) sono stati usati per fare la PCR. I frammenti di DNA amplificati sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione AgeI e KpnI e poi legati al vettore pNEO digerito. Questo costrutto codifica esattamente la stessa proteina come RBD nativo tranne le mutazioni K417N, E484K e N501Y, come confermato dal sequenziamento.
- 38. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 e4 Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021
- 39. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Articol o ll ACCESSO APERTO Produzione di proteine Produzione di proteine è stato come descritto in (Zhou et al., 2020). Brevemente, i plasmidi che codificano le proteine sono stati espressi transitoriamente in cellule HEK293T (ATCC CRL-11268). Il mezzo condizionato è stato dializzato e purificato con una colonna di nichel HisTrap 5 mL (GE Healthcare) e ulteriormente lucidato utilizzando una colonna di filtrazione gel Superdex 75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare). Interferometria a bio-strato Gli esperimenti BLI sono stati eseguiti su una macchina Octet Red 96e (Fortebio). Per misurare l'affinità di anticorpi monoclonali e ACE2 con RBD nativo e RBD K417N, E484K, N501Y, ogni RBD è stato immobilizzato su un biosensore AR2G (Fortebio). Gli anticorpi monoclonali (Dejnirattisai et al., 2021) sono stati utilizzati come analiti o diluizioni seriali di ACE2. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a 30○C. I dati sono stati registrati utilizzando il software Data Acquisition 11.1 (Fortebio) e Data Analysis HT 11.1 (Fortebio) con un modello di adattamento 1:1 utilizzato per l'analisi. QUANTIFICAZIONE E ANALISI STATISTICA Le analisi statistiche sono riportate nei risultati e nelle legende delle figure. La neutralizzazione è stata misurata tramite FRNT. La percentuale di riduzione del fuoco è stato calcolato e IC50 è stato determinato utilizzando il programma probit dal pacchetto SPSS.The Wilcoxon matched-pairs signed rank test è stato utilizzato per l'analisi e due code P valori sono stati calcolati e valori medi geometrici. I dati BLI sono stati analizzati utilizzando Data Analysis HT 11.1 (Fortebio) con un modello di adattamento 1:1.
- 40. Si prega dicitare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021 e5
- 41. Articolo Cifre supplementari ll ACCESSO APERTO Figura S1.Neutralizzazione di Victoria e B.1.351 da parte del siero raccolto prima della vaccinazione, relativa alla Figura 3 Neutralizzazione per i ceppi Victoria e B.1.351 da parte di 50 sieri prelevati al giorno zero prima della prima dose di vaccino AstraZeneca. Tutti i sieri sono stati analizzati in diluizioni triplicate a 1:20 e 1:60 per le diluizioni finali.