La piattaforma genomica di sequenziamento massivo della rete SELGE: genomi, metagenomica ed elaborazione bioinformatica dei dati

1. La piattaforma genomica di sequenziamento massale 
della rete SELGE: genomi, metagenomica ed
elaborazione bioinformatica dei dati
P. Saldarelli
Istituto di Virologia Vegetale del CNR UOS-Bari,
Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli
Alimenti, Università degli Studi di Bari “A.Moro”

2. 
Il progetto Reti di Laboratori
SELGE
SELGE si propone di innovare i laboratori
istituzionalmente impegnati nelle attivita di
miglioramento genetico e diagnosi fitosanitaria
presenti nel territorio regionale al fine di introdurre
innovazioni tecnologiche al
caratterizzazione
varietale indagine
genetica controllo
organismi nocivi quarantena
servizio della
, dell’
biochimica e
e da
e del
degli

3. La piattaforma di sequenziamento
Tecnologia Illumina
‘Sequencing by synthesis’
Cella a flusso
HiScanSQ (Illumina)

4. La piattaforma di sequenziamento ed 
analisi bioinformatica
Output 150 Gb
Single reads: 750 milioni/flow cell
Paired ends: 1,5 miliardi/flow cell
Lunghezza reads: 2x100bp
% basi con Q>30 85%
HiScanSQ (Illumina)
Servizi di bioinformatica
Server di
analisi/acquisizione/conservazione
dati Dell Power edge R900
Powervault MD3000

5. Servizi in conto terzi
Indagine nuovo agente virale (Cooperativa Mezzocorona)
Scoperta di un
nuovo virus della
vite in Trentino
small RNA sequencing
5’
CP
RdRpol
AAAAA3’
MP
Grapevine Pinot gris virus
Giampetruzzi et al. 2013

6. small RNA sequencing
Silenziamento genico dell’RNA
nelle piante un sistema immunitario
RNA virus
RNA a doppia elica
Dicer
vsiRNA
21-24 nt
smallRNA
p
AGO
OH
p
OH
21 mer
CUAUAACCGCGCCGAGUUAGU
p
OH
AGO
RISC
21-24 nt
RNA virale
Una istantanea del contenuto in RNA virali/viroidali e
del progredire del silenziamento dell’RNA in una data
condizione fenologica e/o patologica
Degradazione target
CUAUAACCGCGCCGAGUUAGU
AGO

7. Analisi bionformatica small RNA
de novo assembly di small RNA con Velvet
creazione di contigs ed analisi BLAST
assembly su genoma di riferimento con SOAP

8. Collaborazioni per lo studio di patogeni di quarantena
Scoperta di un nuovo virus degli agrumi in
Turchia
Small RNA
e
DNA sequencing
Initiation site
(TAATATTAC
conserved across
geminiviruses)
3462
3510
V2 (MP)
C1 (Rep)
P3
P1
V1 (CP)
P2
C2 (Rep)
T3
T
1
T2
V3 (MP)
Loconsole et al. 2012
Citrus chlorotic dwarf associated virus

9. Progetti
Mendel University, Faculty of horticulture – Department of
virology, Brno, Czech Republic - librerie da piccoli RNA di vite
per studio viroma viroma di 8 viti
CRA-PAV di Roma - librerie di piccoli RNA da pesco
suscettibile/tollerante a PPV
Università degli Studi della Tuscia (Viterbo) - librerie di piccoli
RNA per lo studio del mirnoma in piante di Leccino dwarf vs
wild type.
Regione Puglia “Progetti
integrati per la biodiversità”
“Recupero del Germoplasma Viticolo Pugliese” (Re.Ge.Vi.P.)

10. Servizi per il territorio
Stato sanitario di 4 cloni
fenotipicamente distinti di
Primitivo di Manduria
 Viroma prima del risanamento
 Clone 1: GVA, GLRaV-3, GSyV1
 Clone 2: GFLV, GRSPaV, HSVd
 Clone 3: GYSVd, HSVd
 Clone 4: GFLV, GVA
 Viroma dopo risanamento
1
2
 Clone 1: sano
3
4
 Clone 2: GRSPaV
 Clone 3: sano
 Clone 4: sano
Small RNA sequencing
CNR CISIA - Valorizzazione delle risorse
genetiche di colture mediterranee attraverso
approcci di metagenomica, trascrittomica e
analisi funzionale per la caratterizzazione di
germoplasma autoctono, endofiti, agenti di
biocontrollo e fitopatogeni (METAGERM).

11. Servizi per il territorio
Studi di comparazione del profilo dei
sRNA e del transcrittoma (RNASeq) in
cultivar di olivo ad alto e basso
contenuto in acido grasso linolenico
cv TOSCANINA, NOCIARA
basso contenuto acido
linolenico
vs
cv OGLIASTRO
alto contenuto acido linolenico
Pipeline
Analisi in corso
-Preprocessing
-Assembling
denovo
transcripts
(Velvet/Oases)
-BLASTN searching homologies of
trancripts vs olea mRNA
-Bowtie alignment on transcripts--RSEM alignment
-RSEM quantification of gene
expression -
Isolamento della isoforma plastidiale del gene Fad7
(Sabetta et al. 2013)

12. Servizi di sequenziamento : Analisi del trascrittoma
(RNASeq)
Purificazione mRNA
Sintesi cDNA
Sequenziamento high-throughput del cDNA
Analisi bioinformatica dei dati
Allineamento reads sul genoma
di riferimento
Normalizzazione e
valutazione
dell’espressione genica

13. Attività di ricerca
RNA-Seq
Escoriosi della vite
Phomopsis viticola
Vitis vinifera
Studio dell’interazione
Trattato
(campione infetto)
Non Trattato
(campione sano)
Progetto Fondazione Cassa di Risparmio di Puglia
De Miccolis et al. 2013

14. Servizio in conto terzi
Induzione di resistenza in vite
Vitis vinifera
Trattato
(induzione dei meccanismi di difesa )
Non Trattato
(controllo di riferimento)
Estrazione RNA totali
Botrytis cinerea
Plasmopara viticola
Sequenziamento librerie di mRNA
Analisi trascrittomica (RNA-Seq)
Azienda di fitofarmaci

15. Attività di ricerca
RNASeq
Marciumi radicali
Portinnesti di Pesco (Prunus spp.)
P. domestica
selezione Tetra
Armillaria mellea
P. persica
GF305
Trattato
Non Trattato
(campione infetto)
(campione sano)
Interazione pianta patogeno)
De novo assembly del trascrittoma del fungo

16. Analisi bioinformatica dei dati
RNASeq
Numero totale di sequenze trascritte
Campione
Filtrate per la qualità QS≥30
Generate
Totali
Uniche
Sano
36.388.913
29.541.451
15.543.933
Infetto
37.471.358
30.077.419
15.869.459
Analisi di espressione genicaRNA-Seq
Campione
CLCbio
Non allineate Allineate
ArrayStar (Q-Seq)
Non allineate Allineate
http://genomes.cribi.unipd.it/
Sano
7.194.822
22.346.629
4.227.046
25.314.405
Infetto
7.651.459
Vitis vinifera (12x) – PN40024
22.425.960
4.618.291
25.459.128
genoma: 486.265.420 bp
geni annotati (V1): 29.971

17. Comparazione dei valori di espressione genica
RNASeq
19068
20000
18000
16000
Sovraespressi:
3374
Numero geni
14000
12000
Sottoespressi:
2029
10000
8000
6000
2600
4000
2000
53
60
209
1908
452
93
24
4
0
0
Fold change
Fold change:
Rapporto tra i valori di espressione di ogni singolo gene in due
campioni posti a confronto

18. Attività di ricerca
Lotta a patogeni del post-raccolta
Bicarbonato di sodio elettrolizzato per induzione di resistenza alla muffa
grigia degli agrumi
Penicillium digitatum
Trattamenti/Librerie
Individuazione delle vie
metaboliche indotte nei frutti
trattati e non mediante
RNASeq
Testimone (acqua)
Sodio bicarbonato
Acqua elettrolizzata in assenza di sale
Sodio bicarbonato elettrolizzato

19. Attività di ricerca
RNASeq in patotipi defolianti e non defolianti di Verticillum
dahliae
Espressione differenziale degli mRNA nei
due patotipi in esame

20. Attività di ricerca
RNASeq in Aspergillus carbonarius in condizioni inducenti e non la
sintesi di Ocratossina A
Over-expressed genes in inducing conditions for OTA biosynthesis
2
17
17
1
4
2
2
5
1
7
13
8
6
12
Secondary metabolites biosynthesis
Carbohydrate metabolism
Amino acid metabolism
Lipid metabolism
Nucleotide/nucleoside metabolism
Energy production and conversion
General function
Transcription and translation
Signal transduction mechanisms
Transporter
Cell wall/membrane/envelope biogenesis
Protein integral to membrane
Hypotetical protein
No functional annotation

21. Applicazioni di metagenomica
Viroma di un vigneto:
Chiumenti et al. 2012
Libreria dsRNA
Libreria sRNA
N° contigs
N° contigs
Vitis vinifera
479
97
Grapevine leafroll-associated virus 3
132
-
Grapevine rupestris stem pitting associated virus
131
-
Grapevine leafroll-associated virus 2
80
12
Grapevine leafroll-associated virus 1
65
91
Grapevine leafroll-associated virus 9
40
-
Grapevine virus A
37
3
Grapevine leafroll-associated virus Pr
15
-
cv.
Grapevine leafroll-associated virus 5 Panse precoce, Trani 5
-
Grapevine virus B
3
-
Grapevine yellow speckle viroid 1
-
7
Grapevine fleck virus
-
5
Hop stunt viroid
-
2
PoolGrapevine fanleaf da 7 piante con manifesti sintomi di enazioni
di tessuti virus
1
16

22. Servizi per il territorio
• Studio dell’eziologia del complesso del disseccamento
rapido dell’olivo
• Caratterizzazione della subspecie di Xylella fastidiosa
associata alla malattia
Paired end sequencing of a
DNA library
• Impatto: attività vivaistica
ambientale
economia agricola regionale

23. Ringraziamenti
CNR-CISIA - Valorizzazione delle risorse genetiche di colture mediterranee attraverso approcci di
metagenomica, trascrittomica e analisi funzionale per la caratterizzazione di germoplasma
autoctono, endofiti, agenti di biocontrollo e fitopatogeni (METAGERM).
www.selge.uniba.it
Rotolo
Pollastro
Saponari
Ippolito
Savino V
C Gerin
S Minafra
M Nigro
A Faretra
D
A
F
F
De Miccolis Angelini RM
Giampetruzzi
A
Loconsole G Chiumenti
M Sanzani S Antelmi I
Montemurro C Sabetta
W