La diagnosi dei giallumi della vite nell’ambito
dei monitoraggi ufficiali

Martedi 31 gennaio 2012
Convegno Termovit - Un ...
Fitoplasmi maggiormente riscontrati in viti affette da giallumi

Flavescenza dorata FD

16Sr(V)-C/D Candidatus phytoplasma...
Attività di monitoraggio e controllo del SFR
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D.M. del 31/5/2000 “Misure per la lotta obbligatoria contro la Flavescenza...
Analisi di laboratorio
punti critici
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Fasi del procedimento di analisi

campionamento

Protocollo analisi

Tecnica e str...
campioni di vite infette da giallumi analizzati dal 2004

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FD e LN in Lombardia dal 2004 al 2011
risultati analisi di laboratorio
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Protocollo analisi ufficiale Eppo PM 7/79 2007

Nervatura fogliare
Patogeno floematico

1- Estrazione DNA totale
2- PCR pe...
Protocollo analisi ufficiale Eppo

Fase 3
Taglio enzimatico RFLP per distinguere il tipo di fitoplasma: FD, LN, AY, EY.

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Ricerca di un protocollo alternativo

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Affidabile
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Veloce ed economico
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Protocollo alternativo
Analisi real time PCR

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PCR veloce: utilizza un solo ciclo
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Analisi real time PCR

Valori di fluorescenza

Numero di cicli

Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Az...
sviluppo saggio real time PCR
progetto DIACERVIT

– DIA.CER.VIT, 2008-2009 finanziato da Regione Lombardia, Unimi
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sviluppo saggio real time PCR progetto DIACERVIT
Confronto con protocollo standard EPPO

direct PCR primer P1/P7
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saggio real time PCR
progetto DIACERVIT

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saggio real time PCR LN
progetto DIACERVIT
saggio real time PCR LN
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Media Ct cycle threshold
(ciclo soglia) campioni positivi
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saggio real time PCR FD
progetto DIACERVIT
saggio real time PCR LN
progetto DIACERVIT

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(ciclo soglia) campioni positivi
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risultati di valutazione saggi real time PCR

Specificity

Efficiency
e=101/-S-1

Sensitivity

Reliability of assay

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campioni di vite analizzati per fitoplasmi in real time PCR

4000
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campioni

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Laboratorio fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio
v.le Raimondi 54 Vertemate con Minoprio CO

fitolab@regione.lombard...
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Calvi la diagnosi dei giallumi della vite

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Calvi la diagnosi dei giallumi della vite

  1. 1. La diagnosi dei giallumi della vite nell’ambito dei monitoraggi ufficiali Martedi 31 gennaio 2012 Convegno Termovit - Un progetto per la termoterapia in Lombardia Torrazza Coste PV Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  2. 2. Fitoplasmi maggiormente riscontrati in viti affette da giallumi Flavescenza dorata FD 16Sr(V)-C/D Candidatus phytoplasma vitis Legno Nero LN 16Sr(XII)-A Stolbur C. Phytoplasma solani Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  3. 3. Attività di monitoraggio e controllo del SFR • D.M. del 31/5/2000 “Misure per la lotta obbligatoria contro la Flavescenza dorata della vite” Controllo barbattellai campi PMM PMP Controllo vigneti Monitoraggio diffusione malattia Espianto viti infette Controllo vettore Progetti di ricerca Prove di campo • Analisi di laboratorio Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  4. 4. Analisi di laboratorio punti critici • Fasi del procedimento di analisi campionamento Protocollo analisi Tecnica e strumento Esperienza del tecnico • Sensibilità, specificità, affidabilità, ufficialità Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  5. 5. campioni di vite infette da giallumi analizzati dal 2004 4000 2000 campioni 0 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 campioni 154 359 243 318 227 219 219 total e 330 2069
  6. 6. FD e LN in Lombardia dal 2004 al 2011 risultati analisi di laboratorio
  7. 7. analisi su PMM nel 2011 16 14 12 10 8 6 Mantova 4 Pavia 2 0 N° N° campioni campioni positivi FD positivi LN N° campioni positivi Misti numero campioni negativi per virus e giallumi Numero campioni affetti da virus Totale campioni analizzati per provincia
  8. 8. Protocollo analisi ufficiale Eppo PM 7/79 2007 Nervatura fogliare Patogeno floematico 1- Estrazione DNA totale 2- PCR per rilevare la presenza di fitoplasmi marcatori gene 16S 1. PCR diretta P1P7 2. PCR nested 16SrV 16SrI DNA amplificato del fitoplasma Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  9. 9. Protocollo analisi ufficiale Eppo Fase 3 Taglio enzimatico RFLP per distinguere il tipo di fitoplasma: FD, LN, AY, EY. 2 giorni 30 campioni Profili specifici ed identificativi dei diversi fitoplasmi in base a numero delle bande e loro posizione sul gel Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  10. 10. Ricerca di un protocollo alternativo • • • • Affidabile Specifico e sensibile Veloce ed economico Ufficialmente e legalmente riconosciuto Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  11. 11. Protocollo alternativo Analisi real time PCR     PCR veloce: utilizza un solo ciclo reaI time: i risultati sono visualizzati in tempo reale sensibile: rileva fino ad 1 sola molecola di DNA target specifica: chimica Taqman, primers e sonda specifiche Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  12. 12. Analisi real time PCR Valori di fluorescenza Numero di cicli Laboratorio Fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio, Azienda con Sistema di Qualità Certificato ISO 9001:2008
  13. 13. sviluppo saggio real time PCR progetto DIACERVIT – DIA.CER.VIT, 2008-2009 finanziato da Regione Lombardia, Unimi Istituto Patologia Vegetale Dr.ssa Casati e Dr. Durante, Fondazione Minoprio Lab Fitopatologico – Sviluppo specifico saggio per il rilevamento di FD e LN •Primer and MGB probe disegnati su parziale sequenza dell’operone S10-spc •Sequenziamento di 8 isolati di fitoplasmi diversi •Ottimizzazione del saggio •Valutazione dell’affidabilità
  14. 14. sviluppo saggio real time PCR progetto DIACERVIT Confronto con protocollo standard EPPO direct PCR primer P1/P7 Nested PCR R16(V/I)F1/R1 RFLP with BfaI/MseI Viti sintomatiche FD BN virus negative 285 139 109 5 32
  15. 15. saggio real time PCR progetto DIACERVIT 102 106 105 104 103 102 106 Dilution of the standard curve standard curve Specificity Sensitivity Efficiency e=101/-S-1 16SrV - C/D 2 target molecule Ct 98.6%
  16. 16. saggio real time PCR LN progetto DIACERVIT
  17. 17. saggio real time PCR LN progetto DIACERVIT Media Ct cycle threshold (ciclo soglia) campioni positivi 26<39
  18. 18. saggio real time PCR FD progetto DIACERVIT
  19. 19. saggio real time PCR LN progetto DIACERVIT Media Ct cycle threshold (ciclo soglia) campioni positivi 26<37
  20. 20. risultati di valutazione saggi real time PCR Specificity Efficiency e=101/-S-1 Sensitivity Reliability of assay results Reference data results Reference data results Reference data results Reference data SYBR green FD Galletto et al 2005 16SrV* 16SrV* (20 fg) Ct 27.89 (20 fg) Ct 27.86 97% Data not shown 100%** 94% Taqman FD Angelini et al. 2006 No amplificat ion 16SrV Not tested 10-6 dilution infected periwinkle Not tested 94.6% 0% 100% 16SrXII-A (0.5 ng) 106 dilution infected periwinkle (0.25 ng) 106 dilution infected periwinkle 98% 96.5% 100%** 100% Taqman BN Angelini et al. 2006 16SrXII-A Taqman FD DIACERVIT unpublished Specificity Sensitivity Efficiency e=101/-S-1 16SrV - C/D 2 target molecule Ct 98.6% * Specificità relativa al gruppo 16SrV ** il saggio di real time PCR si è dimostrato maggiormente sensibile della nested PCR , dati elaborati su 285 campioni
  21. 21. campioni di vite analizzati per fitoplasmi in real time PCR 4000 2000 campioni 0 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 4 ore 45 campioni total e campioni 154 359 243 318 227 219 219 330 2069
  22. 22. Laboratorio fitopatologico SFR c/o Fondazione Minoprio v.le Raimondi 54 Vertemate con Minoprio CO fitolab@regione.lombardia.it

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