moleküler klonlama uygulamaları

1. REKOMBINANT DNA
TEKNOLOJISI VE GEN KLONLAMA
Mehmet Gülçimen
Moleküler biyoloji A.B.D. (YL Tezli)
Dersi veren öğretim görevlisi: Doç. Dr. Filiz Alanyalı

2. Genel Bakış: Gen Klonlama
• Klonlama, birbiri ile
aynı bir kısım
molekül
topluluğunun,
hücrelerin ve hatta
organizmaların,
Aseksüel şekilde
çoğaltılmasıdır.
Klonlama Çeşitleri

3. Gen Klonlama
• Bir genin izole edilerek, başka bir Vektör DNA’ya eklenmesi ile oluşan
yapı, Rekombinant DNA olarak adlandırılır.
• Rekombinant DNA’lar, daha sonra bu hedef DNA parçasının bir klonunu
üretmiş konak hücre (host cell) içinde çoğaltılır.
• Konak hücre olarak, genellikle bir model organizma olan, E.coli bakterisi
kullanılır.

4. Başlamadan Önce:
Klonlama işlemlerinde kullanılan enzimler:
Restriksiyon Endonükleaz (RE): Plazmid yapısındaki DNA bölgesini (gene of interest)
iki ucundaki fosfodiester bağlarından keserek serbest bırakır (yapışkan ve küt uçlar).
Ligaz: İki ucundan kesilmiş bölgeye entegre edilen hedef DNA’yı aynı bölgelerden
fosfodiester bağları oluşturarak bütünleşik bir plasmid yapısı oluşumunu sağlar.

5. DNA Polimeraz enzimleri,
DNA POL I: In vivo’da DNA replikasyonu ve onarımından sorumludur
Taq DNA Polimeraz: Yüksek ısıda stabil kalabilen bir DNA Polimeraz
Terminal Transferaz: Lineer tek veya çift zincirli DNA veya RNA nın 3’ ucuna birkaç
nükleotit ekler
Alkalin Fosfataz: Nükleik asidin 5’ ucundan fosfat grubunu siler

6. Genel Hatları ile Gen Klonlama
Aşamaları
• 1. Saf DNA örneklerinin hazırlanması
• 2. DNA örneklerinin kesilmesi (Restriksiyon endonükleazlar)
• 3. DNA moleküllerinin bir araya getirilmesi (Rekombinasyon)
• 4. DNA özelliklerinin incelenmesi ( Doğrulama)
• 5. DNA’nın konak hücreye girişi (Transfeksiyon,
Transformasyon,Transdüksiyon)
• 6. Rekombinant DNA moleküllerinin belirlenmesi (Genetik,
İmmünokimyasal)

7. 1.Kısım: DNA Manipülasyonu
• Plazmid İzolasyonu
• Plazmidler, hücre içerisinde, kromozomların dışında bulunan, kendilerini
eşleyebilen halka şeklindeki DNA molekülleridir. Moleküler klonlama için,
kullanacağımız plazmidi önce bakteriden ayrıştırmamız, değiştirmemiz ve
konak hücreye geri koymamız gerekir.
• Alkalin Lizis
• Plazmidi bakteriden ayırmak için, ilk önce Alkalin Lizis yapılır. Bu işlemde,
bakteriler alkalin(Yüksek pH; NaOH) ortama konularak hücre zarının
açılması sağlanarak plazmidlerin hücre dışına çıkışı sağlanır.

8. Alkalin Lizis ile Plazmid İzolasyonu

9. • Silika Adsorpsiyonu
• Alkalin Lizis işlemi ile birçok hücresel bileşeni,
kromozomal DNA’yı ve lipidleri elememize
ragmen, bir kısım hücresel protein ve
metabolitler hala tüpümüzün içerisinde
bulunmaktadır. Bundan dolayı, plazmid
DNA’yı daha da saflaştırmamız gerekir.
• Plazmid DNA’yı bir silika zara yüksek tuz
konsantrasyonlu ortamda tutturarak seçici
bir plazmid DNA eldesi gerçekleştirilir. Daha
sonra bu zara tutunmuş plazmidler düşük tuz
konsantrasyonlu elüsyon çözeltisi ile toplanır.
• Daha fazla saflaştırma için DNA
kantifikasyonu yapılır.
Silika Adsorpsiyonu Adımları

10. Bakteriyel Plazmid İllüstrasyonu

11. • Restriksiyon Enzimi ile Plazmid Kesimi
E.Coli plazmidini doğru bir
şekilde elde ettikten sonra,
plazmidin hedef gen
bölgesinde(gene of interest),
Restriksiyon Enzimi aracılığı ile iki
taraftan DNA kesimi yapılır.
Restriksiyon endonükleaz
Restriksiyon endonükleazlar makas
gibi davranarak DNAʼ’yı spesifik
bölgelerinden keserler.
Her bir restriksiyon enzim spesifik DNA
dizilerini tanır ve bu dizinin içindeki belli bir
yerden keser.
Enzim, bir deoksiribonükleotidin fosfat grubu
ve komşu deoksiribonükleotidin şeker grubu
arasındaki kovalent bağların kırılmasıyla
DNAʼ’yı çift ipliğinden keser.
Restriksiyon enzimler izole edildiği organizmanın ismi
kullanılarak adlandırılırlar.
Örneğin EcoRI, E. coli RY13ʼ’den izole edilmiştir.
Eco cins isminin ilk harfi ve tür isminin ilk iki harfinden
gelmektedir.
R nesil tipi için, I bu tipin ilk enzimi için kullanılır.

12. RE Çeşitleri ve Örnekleri

13. • Ligaz Enzimi
• DNA ligaz enzimi, klonlanacak DNA ile
vektör molekülünü birleştirir.
• Yapışkan uçların ligasyonu oldukça
verimlidir. Sebebi ise; birbirleri ile H bağı
yaparak enzimin çalışabileceği stabil
yapıyı oluşturmalarıdır.
• Küt uçların ise ligasyonu zordur.Çünkü
DNA ligazın doğru molekülü yakalaması
güçtür.
• Küt uçla ligasyon, yüksek DNA
konsantrasyonunda yapılırsa, doğru
birleşme şansı arttırılır

14. DNA Ligaz Enzimi ile Rekombinant
Plazmid Sentezi

15. • Transformasyon
• Rekombinant DNA konak
hücre içine girerek hızla
çoğalır.Transformasyon
olarak adlandırılmasının
sebebi konak hücreyi
değiştirebilme
fonksiyonunun olmasıdır.
• E.coli hücrelerini plasmid
DNA ile ortamdan izole
etmek zordur.CaCl2
ilavesiyle bu izolasyon
sağlanabilir.

17. 2. Kısım: Transformantları İzleme
• Mavi-Beyaz Görüntüleme (Blue
White Screening )
• Blue-White görüntüleme başarılı
klon belirleme hususunda
oldukça yaygın bir şekilde
kullanılan bir tekniktir.
• Bu metod, transforme edilmiş
plazmid vektörlerinin içinde
bulunan Lac-Z bölgesinin ürettiği
proteinin , IPTG ve X-Gal içeren
ortamda mavi renk vermesi
esasına dayanır.

18. Bilim insanları, alfa-birleşimli bir
vektör oluşturacak şekilde, Çoklu
Klonlama Bölgesini(MCS) alfa-
peptit (turuncu dilim/ lacZ)
bölgesinin içine dahil ederek
plazmid oluşturmuşlardır (pUC18,
pUC19 gibi).
Rekombinant DNA, eğer başarılı
olduysa, MCS bölgesinde entegre
şekilde bulunan genler, alfa-peptit
bölgesi transkript edilirken, farklı
bir şifreleme ortaya çıkarır. Bu
şifreleme daha sonra bu bölgeden
sentezlenecek olan protein ß-
galaktosidaz’ın işleyişini
değiştirecektir. Nitekim, bu durum
ß-Galaktosidaz enziminin bu
hücrede fonsiyonel olmaması ile
sonuçlanır.
ß-Galaktosidaz enzimi fonksiyonel
olmayan organizmalar, IPTG ve X-
Gal içerikli medyumda, mavi renk
vermez.

19. • Tekrar Restriksiyon
Enzimi Kullanımı
• Bu enzimatik teknik,
Rekombinant DNA’yı
spesifik bölgelerden
kesmek için kullanılır.
• Kesilen her fragman,
pozitif sonuç ortaya
çıkarıyorsa, en başta
hedeflenen
rekombinasyon işlemi
başarılı olmuş demektir.
• Fragmanların,
hedeflenmiş olan
partiküler sekansları
içerip içermediğini
anlamak için PCR, Jel
Elektroforez veya
Kromatografi teknikleri
uygulanır.
Rekombinant
Plazmid
• Hedeflenen DNA parçalarını (insert) içeriyor mu?
Restriksiyon Enzimi
• Plazmidi spesifik bölgelerden kesecek RE’ler kullanılır.
• Elde edilen fragmanlar hedef sekans olacaktır.
PCR
• Bu sekansların primerleri kullanılarak PCR da çoğaltımı sağlanır.
• Eğer fragmanlar, hedeflenmiş DNA sekanslarını içermiyorsa,
çoğaltma gerçekleşmez.
Jel Elektroforez
• Amplifikasyon sağlandıysa, Agaroz Jel Elektroforezi protokolü
uygulanarak ürünlerin baz çifti sayısına bakılır, bilgiler
örtüşüyorsa doğrulama yapılmış olur.

20. • Koloni PCR ile Doğrulama
• Koloni PCR, plasmid yapısında hedef DNA (insert)nın varlığını saptamak
için uygun ve yüksek verimli bir yöntemdir.
• Transformantlar ufak bir ısıtma adımı ile su içerisinde lize (lysed)
edilebilir veya başlangıç ısıtma adımında( initial heating step) direkt
olarak PCR reaksiyonuna eklenebilir. Bu ısıtma adımı plazmidlerin hücre
içinden çıkmasına neden olur, böylece amplifikasyon için şablon
(template) olarak kullanılabilir.
• Koloni PCR ayrıca hedef DNA(insert) oryantasyonu için kullanılabilir.
• Eğer DNA doğru oryantasyonda ise, insert primeri ve vektör primeri
bir büyüklükte, spesifik bir PCR ürünü ortaya çıkaracaktır.

22. • DNA Sekanslama
• Transformantların
izlenmesinde %100 kesin
sonuç veren bir yöntemdir.
• Transforme edilmiş
plazmidlerden izole edilen
DNA fragmanları(insert),
tekrar PCR gibi işlemlerden
geçirerek çoğaltılarak
sekanslama için uygun hale
getirilir.
• Veya, sadece plazmid
izolasyonu yapılarak
sekanslama işlemi için bütün
plazmid kullanılır.
• Ancak, diğer yöntemlere göre
oldukça zahmetli ve pahalı bir
yöntemdir.

23. 3. Kısım: Bakterideki Rekombinant
Proteinlerin Belirlenme,Saflaştırma ve
Sentezlenme İşlemleri
• Rekombinant proteinlerin eksprese edilip edilmediğini
anlamak için, saflaştırma adımları uygulanması ve
akabinde doğrulama teknikleri yapılması gerekir.
• Hücrelerin olduğu besiyerde, IPTG, LB-Amp, X-Gal gibi
protein üretimini indükleyici faktörler bulunmalıdır.
• Koloniler arasından hücre hasadı yaparken, proteolizi
engellemek için, logaritmik fazdaki (h.sayısı en hızlı
artan faz) hücreler seçilmelidir.
• Daha sonra toplanan hücreler, belirli saflaştırma
aşamalarından geçirilmeli ve analiz etmeye hazır hale
getirilmelidir.

24. • Saflaştırma adımlarından sonra, rekombinasyon işlemlerinin başarılı olup
olmadığını görmek için kullanılan protein analiz yöntemleri:
SDS-PAGE Yöntemi
SDS poliakrilamit jel elektroforezi protein analizi
açısından güçlü bir yöntemdir çünkü prensip olarak
suda çözülmeyenler dahil, bütün proteinlerin
ayırımı için kullanılabilir. Zar proteinleri, hücre
iskeletinin protein bileşenleri ve daha büyük
hücresel topakların bileşenlerini oluşturan
proteinlerin hepsi bu yöntemle ayrılabilir. Yöntem
polipeptitleri büyüklüklerine göre ayırdığından
molekül ağırlıkları ve protein kompleksindeki
altbirimlerin bileşimi hakkında bilgi verir.
% 5’lik jel için 60-212 kDa (kiloDalton)
% 10’luk jel için 18-78 kDa
% 15’lik jel için 15-45 kDa

26. • Western Blot Analizi
SDS-Poliakrilamid Jel Üzerindeki Proteinlerin Membrana Aktarılması
1- Islak Sistem Transfer
2- Yarı Kuru Sistem Transfer
3- Kuru Sistem Transfer
Nitroselüloz veya poli-viniliden florür (PVDF) membran

28. • Afinite Kolon Kromatografisi

29. • Protein Kantifikasyonu

30. • Daha fazla ve ayrıntılı çözüm için:

31. KAYNAKÇA:
• Web Siteleri:
• https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/
• http://www.wikizeroo.net/index.php?q=aHR0cHM6Lyn
• https://www.thermofisher.com/tr/en/home/life-science/cloning/cloning-
learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/molecular-
cloning/cloning.html
• https://molbio.mgh.harvard.edu/szostakweb/protocols/clone_seq2/clone_s
eq.html
• https://international.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-
biology/dna-analysis/colony-pcr
• https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/blue-
white-screening.html
• https://www.foodelphi.com/tag/logaritmik-ureme-fazi/
• https://studylibtr.com/doc/1086396/protein-analiz-ve-
safla%C5%9Ft%C4%B1rma-y%C3%B6ntemleri

32. • Makale ve sunumlar:
• WESTERN BLOT, Yrd. Doç. Dr. Eda Becer, YDTÜ 2009
• Yıldırım, A., Bardakçı, F., Karataş, M., Tanyolaç, B., Moleküler Biyoloji, 1.
baskı, Nobel basımevi, 2007
• Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff , M., Roberts, K., Walter, P.,
Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition, Garland Science, 2002
• Gene Cloning, Mohammed Nader Shalaby, Suez Canal University 2015
• Rekombinant DNA Teknolojisi, Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN 2012
• Enzymes used in molecular biology: a useful guide,Laure Rittié &
Bernard Perbal, J. Cell Commun. Signal. (2008) 2:25–45
• Molecular Biology Techniques: A Classroom Laboratory Manual THIRD
EDITION, Susan Carson,Heather B. Miller,D. Scott Witherow, Elsevier
2012

33. Dinlediğiniz için Teşekkürler!