Recommended
More Related Content
What's hot
What's hot (20)
Viewers also liked
Mb5~protein saflaştırma ve analizi
- 1. Moleküler Biyoloji GIDA456 Yrd. Doç. Dr. Barçın KARAKAŞ Bahar 2015-2016 T.C. AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ • Protein saflaştırma ve analizi (devam)
- 2. Bir önceki derste … • Proteinlerin saflaştırılması-saflık, verim ekonomi • Hücre ekstraktı; hücre parçalama • Büyüklüğe göre (MA, ebat) ayırma: • Santrifüj işlemleri (diferansiyel ve zonal santrifüjleme) • Membran teknikleri – diyaliz, ultrafiltrasyon • Jel filtrasyonu • İyonik şiddete bağlı çöktürme (salting-out) • Yüklerine göre ayırma: • İyon değişim kromatografisi • Elektroforez: SDS-PAGE
- 3. Bu derste… • Yüklerine göre ayırma(devam)…Elektroforez… • Bağlanma özelliğinden faydalanarak ayırma (affinity) • Elektroforetik yöntemler…İzoelektirik odaklama ve SDS PAGE, 2 boyutlu elektroforez, • Saflaştırma işleminin değerlendirilmesi • Maldi-TOF ile protein MA tayini • Amino asit dizilerinin belirlenmesi • İmmunolojik analizler
- 4. Afinite (bağlanma) özelliğinden faydalanarak ayırma • “Affinity chromatography” • Ör: bir bitkisel protein olan Concanavalin A glikoza meyillidir (ortamdaki glikoza bağlanır) • Con A önce kolon malzemesinde bulunan G’a bağlanır; glikoz içeren çözelti kolondan geçirilince ise Con A serbest glikoza bağlanmayı tercih eder ve elüsyon sağlanmış olur
- 5. Afinite (bağlanma) özelliğinden faydalanarak ayırma • Dolgu malzemesinin maliyetinden ötürü pahalı bir yöntem olmakla birlikte son derece spesifik oluşu sebebiyle tercih edilebilir. • DNA’da belirli dizileri tanıyarak bağlanan ve transkripsiyonda görev alan bazı proteinler vardır (transkripsiyon faktörleri); bunların ayrılmasında kolon matrisinde DNA dizisini içeren moleküller kullanılır. • Ayırma için son derece etkili ve seçici bir yöntemdir
- 6. Jel Elektroforezi • Jel elektroforezi, saflaştırılmış nükleik asit ve proteinlerin molekül ağırlığı, miktarı ve alt tiplerinin saptanmasında yaygın olarak kullanılan moleküler bir inceleme yöntemidir. • Yöntemin avantajı; basit ve hızlı • En çok kullanılan jel elektroforezi yöntemleri agaroz jel elektroforezi ve poliakrilamid jel elektroforezidir. • Nükleik asitler için genellikle agaroz jel, • proteinler için ise poliakrilamid jel elektroforezi kullanılmaktadır. • SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) hemen tüm protein tiplerinin analizinde uygulanabilmektedir.
- 7. SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) • SDS (sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri biribirinden ayırır. • Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda '(-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.
- 10. Protein saflaştırma işlemlerinin her basamagında örnek alınarak bu örnekler bir SDS-PAGE ile incelenebilir • Herbir fraksiyondan jel kuyularına aynı miktarda yüklenmiştir • Son fraksiyonda saflaştırılması hedeflenen proteine ait bant tek bant olarak kalmıştır ve kalınlaşmıştır
- 11. M: marker H: homojenat F1-3: farklı saflaştırma işlemleri ile elde edilen fraksiyonların örnekleri M H F1 F2 F3 M 100 kDa 50 kDa 10 kDa
- 12. İzoelektirik odaklama • İzozimleri ya da özellikleri çok benzeyen proteinleri ayırmak için kullanılır • pH gradienti oluşturulan jel üzerinde elektroforez yapılarak, proteinlerin pI değerleri tayin edilir • pH gradienti: Küçük molekül ağırlıklı organik asit ve bazları içeren bir amfolit ya da amfolin (katyonik/anyonik polistiren elektrolitler) çözeltisi ilave edilen jele elektrik alanı uygulanır • Amfolit çözeltisindeki H+ve OH- iyonları, biri diğerini nötralize ederek sürüklenirken, jel üzerinde pH gradienti oluşur
- 13. İzoelektirik odaklama • protein karışımı izoelektrik jele uygulanıp elektroforez yapıldığında, karışımdaki her protein kendi izoelektrik noktasına kadar jel üzerinde sürüklenir ve durur
- 14. İki boyutlu SDS-page Elektirik yüküne bağlı olarak ayrışma ↔MA’yabağlıolarakayrışma ↕
- 16. • E. coli proteinleri, bu şekilde belirli uygulamalar sonucunda hangi proteinlerin üretiminin arttığı, hangilerinin ise azaldığı araştırılabilir • (not: tür isimleri yazılırken klavye kullanılıyorsa MUTLAKA italik yazılır. El yazısı ile tür isimleri yazılırken ise MUTLAKA altı çizilir)
- 17. Proteom • Proteom (ing: “proteome”): bir organizmanın sentezlediği proteinlerin tamamı • En iyi ayırma yöntemi 2 boyutlu jel elektroforezidir (>10 000 protein ayrıştırılabilir) • Klasik proteom analizi 3 aşamada gerçekleştirilir: • Jel elektroforezi/kutle spektrometrisi • Kısmi dizi belirleme • Veritabanlarının taranması • Proteinin molekül ağırlığı kütle spektrometrisi ile belirlenebilir • Proteinin aa dizisi klasik olarak Edman dizi belirleme yöntemine göre gerçekleştirilebilir.
- 18. Saflaştırma işleminin değerlendirmesi • Taplam protein: bir fraksiyonda mevcut olan protein miktarı protein konsantrasyonu belirlenerek ve fraksiyon hacmi ile çarpılarak bulunur • Toplam aktivite: aktivite analizinde kullanılan miktar için tespit edilen aktivite değeri belirlenir ve toplam fraksiyon hacmi ile çarpılarak toplam aktivite hesaplanır • Spesifik aktivite: toplam aktivitenin toplam proteine bölünmesiyle hesaplanır • Verim: herbir saflaştırma aşaması sonrasında fraksiyonda kalan aktivitenin ham ekstredeki aktiviteye oranının yüzdesel ifadesidir • Saflaştırma seviyesi: bu parametre saflık artışının göstergesidir ve herbir aşamada hesaplanan spesifik aktivitenin başlangıçtaki spesifik aktiviteye bölünmesi ile hesaplanır.
- 19. Proteinlerin karakterizasyonu • Protein homojen bir çözeltide saflaştırıldığı taktirde – aa bileşimi – molekül ağırlığı – aa dizisi belirlenerek karakterize edilebilir.
- 20. Kütle Spektrometrisi • Kütle spektrometrisi organik kimyada çok uzun yıllardan beri kullanılagelen bir analiz yöntemidir. • Bileşikler iyonize edilerek gaz fazına geçirilir ve belirli bir mesafeyi kat etmeleri sağlanır; moleküllerin dedektöre ulaşması kütlelerine bağlı olduğu için buradan molekülün kütlesi hesaplanabilir. • Proteinlerin (ve diğer makromoleküllerin) spektrofotometride analizi bu büyük moleküllerin gaz fazına geçmesini sağlayan tekniklerin geliştirilmesi sayesinde mümkün olmuştur. • Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization (MALDI) time of flight (TOF) • Matris-destekli lazer desorpsyonu uçuş süresi • Electrospray Spectrometry (ES) • Elektrosprey spektometrisi
- 21. MALDI spektrometrisi • Bu yöntemde proteinler iyonize edilir ve oluşan yüklü gruplar elektirik alan içinde hızlandırılır • En küçük iyonlar daha hızlı yol alır…dedektöre daha çabuk ulaşır • TOF (yani uçuş süresi) » kütle/yük oranı (m/z) • Bu yöntemle pikomol (pmol; 10-12) veya fmol (femtomol; 10-15) gibi küçük miktardaki örneklerin analizi mümkündür
- 22. Maldi-TOF-MS ile protein MA tayini (1) Uygun bir matris içinde hazırlanmış protein örneği üzerine lazer ışını verilerek iyonizasyon sağlanır (2) Oluşturulan elektrik alanı sayesinde iyonların detektöre doğru ilerlemesini sağlanır (3) En hafif iyonlar daha çabuk ulaşır (4) İyonize edici lazer ayrıca uçuş süresinin (TOF) belirlenmesini sağlayan bir “kronometre”yi başlatır
- 23. MALDI-TOF …………150 0 000 – 700 000 €
- 24. Maldi-TOF-MS ile protein MA tayini • Yukarıda β-laktoglobulin ve insülin içeren bir protein karışımına ait MALDİ- TOF spektrumu verilmiştir • β-laktoglobulin ve insülin için aa dizilerinin bilinmesi sayesinde hesaplanarak bulunmuş olan MA değerleri sırasıyla 5733.5 ve 18388 Da’dur. Spektrumdan okunan MA değerleri ise sırasıyla 5733.9 ve 18364 Da. • MALDI-TOF’un proteinin kütlesinin belirlenmesinde ne kadar etkin bir araç olduğu görülmektedir.
- 25. • Kütle spektrometrisi ile peptid parmak izinin alınması (ing:“peptide fingerprinting”) adında bir yöntem geliştirilmiştir. • Peptidlerin tanınmasını sağlayan bu teknik sayesinde 2 boyutlu jellerin kullanılırlığını büyük ölçüde arttırmıştır. • Burada… • 2 boyutlu jelden kesilerek alınan protein lekesi jelden ekstrakte edilir. • Protein enzimatik veya kimyasal olarak spesifik noktalardan kesilir. • Spektrometre ile peptid parçalarının kütleleri belirlenir. • Elde edilen peptid kütleleri (yani “parmak izi”) internet veri tabanlarında bulunan proteinlerin “elektronik ortamda kesilmesi” ile elde edilen parmak izleri ile eşleştirilerek taranır. Tripsin K ve R aa kalıntısından keser.
- 26. The major soluble proteins of Schistosoma mansoni identified by peptide mass fingerprinting, illustrated on an annotated 2D gel of material from eggs. • Bu şekilde 2 boyutlu jellerdeki protein lekelerinin büyük oranda tanımlanabilmesi mümkün olmaktadır.
- 27. Saflaştırma → MA belirleme → aa dizisi (primer yapı) aa bileşiminin belirlenmesi… • Peptid / protein hidrolize edilir (6 N HCl, 110 ºC, 24 saat) • Hidrolize olmuş amino asitler iyon değişim kromatografisi ile sulfone polistiren kolon ile ayrıştırılır. • aa.lerin tanımlanması: Kolondan çıkan aa.ler elüsyon zamanına (hacmine) bağlı olarak tanımlanır. • aa.lerin miktarları: miktar belirleme (quantification) aa fraksiyonlarının ninhidrin ile ısıtılarak tepkimeye sokulması ve absorbansın belirlenmesi yoluyla gerçekleştirilir. • Prolin dışında bütün aa.ler ninhidrin ile koyu mavi renk verir; prolinde bulunan ikinci amin grubu nedeniyle sarı renk oluşur.
- 28. • Bir peptid hidrolizatında bulunan aa.ler sulfone edilmiş polistiren reçine (ör: Dowex-50) kolondan geçirilerek ayrıştırılabilir. • Burada elüsyon için artan pH’da tampon çözelti (bu örnekte sodyum sitrat) kullanılır. • Absorbans ölçülerek her bir amino asidin miktarı belirlenir • Asidik yan zinciri olan aspartat kolondan en hızlı çıkar, bazik yan zinciri olan arjinin ise en son çıkar. • Bu örnek peptidde (Asp1, Gly2, Ala1, Phe1, Arg1) vardır, bu gösterime göre sadece aa içeriği verilmiştir, sıra bilinmemektedir
- 29. • Bu hidroliz ve kromatografiye dayalı yöntemle 10 ng kadar küçük miktarda aa belirlenebilmektedir. • Bir parmak izinde her aa.ten yaklaşık bu miktarda bulunur.
- 30. • Kendiliğinden ışıma yapmayan bileşiklere floresan özellikte guruplar bağlanarak ışıma yapmaları sağlanabilir. • Ninhidrin kullanımı yerine fluorescamine maddesi ile etiketleme yapıldığında analiz daha hassas olur (1 ng = 10 pmol amino asit tayin edilebilir.) • Fluorescamine aa ile tepkimeye girerek floresan bir türev oluşturur.
- 31. • Bir sonraki aşamada hedef N-terminus amino asidini belirlemektir. • Bunun için Frederick Sanger tarafından ilk olarak florodinitrobenzen (fluorodinitrobenzene; FNB) maddesi kullanılmıştır. • Şimdilerde floresan türevler oluşturduğu için daha hassas sonuçlar veren dabsilklorid maddesi kullanılmaktadır.
- 32. • N-terminus ucundan dabsilklorür ile etiketlenen protein hidrolize edilir. • Ortaya çıkan dabsilCl-aa türevi kromatografik olarak tanımlanabilir (yukardaki ör: alanin) • Bu yöntem bir protein için sadece 1 defa gerçekleştirilebilir; zira protein hidroliz aşamasında tamamen bozunur, dizi bilgisi kaybolur. • Sonuç olarak sadece son amino asit belirlenmiş olur. Ala (N-terminus)
- 33. Edman dizi belirleme • Pehr Edman tarafından geliştirilen peptid amino asit dizisini belirleme tekniğidir. • Bu yönteme göre aa dizisinin son kalıntısına (ing: “N-terminus veya terminal residue”) bir “etiketleme” yapılır ve bu kalıntı zincirden koparılır. (ing: “cleaved”) • Bu sırada peptid aa dizisi değişmez.
- 34. Edman dizi belirleme • Edman yönteminde peptidin amino ucundan sırayla birer amino asit ayrılır. • Fenil izotiyonat peptidin yüksüz terminal ucu ile tepkimeye girerek bir fenil tiyokarbomil türevi oluşturur. • Bunu takiben, hafif asidik koşullar altında uçtaki amino asidin halka yapıda (cyclic) bir türevi serbest bırakılır. • Halka yapıdaki bu türev phenylthiohydantoin bileşiğidir; kısaca bu amino aside PTH-amino asit denir.
- 35. Edman degredasyonu ile aa dizisinin belirlenmesi • PTH-amino asitleri kromatografik yollarla tanımlanabilmektedir. • Edman prosedürü tekrar edilerek sırasıyla amino asitler belirlenebilir.
- 37. Otomasyonlu Edman degredasyonu ile aa dizisinin belirlenmesi • Otomasyonu sağlanmış dizi belirleme cihazları geliştirilmiştir. • Bu cihazlar sayesinde Edman yöntemi ile yapılan bir döngü (yani 1 aa etiketleme, kesimi ve belirleme işlemi) bir saatten kısa sürede gerçekleştirilebilir. • Otomasyonlu dizi belirleme cihazları ile 50 kalıntıya kadar aa içeren peptid zincirlerinin N- terminus aa dizisi belirlenebilir.
- 38. Peptidler belirli noktalardan kesilerek dizi belirleme analizi kolaylaştırılabilir. • Edman yöntemi teorik olarak sonsuz sayıda döngü halinde gerçekleştirilebilir. • Ancak, pratikte 50'den fazla sayıda kalıntı analiz edilememektedir. • Bunun sebebi her döngüde bazı PTH- aa.lerin serbest bırakılmasında sorunlar olur, yani ayrılma %100 verimle gerçekleşmez, … (ör: verim %98 olsa? → 60 döngü sonrasında 0.9860=0.30…oldukça heterojen bir örnek olur)
- 39. Peptidler belirli noktalardan kesilerek dizi belirleme analizi kolaylaştırılabilir. • Bu sorunu aşmak için peptid zinciri belirli noktalardan kesilir, sonra dizi belirlenir. • Strateji: böl ve fethet! • Spesifik kesim (spesifik kırma) kimyasal veya enzimatik yolla gerçekleştirilebilir.
- 40. Kimyasal kesme • Örneğin siyanojen bromür (cyanogen bromide; CNBr) polipeptid zincirlerini sadece metiyonin kalıntılarının karboksil tarafından parçalar. • Örneğin 10 metiyonin kalıntısı içeren bir polipeptid CNBr ile muamele sonrasında 11 adet peptid zinciri oluşturur.
- 41. Enzimatik kesme • Oldukça spesifik kesim sağlayan bir diğer madde tripsin enzimidir. • Tripsin pankreasın salgıladığı proteolitik bir enzimdir. • Bu enzim polipeptidleri arjinin ve lisin kalıntılarının karboksil taraflarından kesime uğratır. • Örneğin 9 arjinin ve 7 lisin kalıntısı içeren bir polipeptid tripsin ile muamele edildikten sonra 17 peptid zinciri ortaya çıkarır. Bu peptidlerin C-terminal ucunda ya arjinin ya da lisin bulunacaktır.
- 42. Başka kimyasal / enzimatik kesim yöntemleri
- 43. • Polipeptidleri parçalayarak Edman yöntemiyle dizileri belirlenen parçalar tam olarak proteinin dizisini vermez – peptid parçalarının dizilişini bilemeyiz!! • Bunun için ilave bilgiye ihtiyaç vardır. • Peptidlerin çakıştırılarak analiz edilmesi gerekir ~ ing: “overlapping peptides” • Yani ikinci bir yöntemle daha kesim yapılır.
- 45. • Ör: polipeptid önce tripsin ile kesilip, sonrasında kimotripsin enzimiyle 2. kesim gerçekleştirilebilir. • Tripsin Ala veya Lys kalıntılarından keser; kimotripsin aromatik ve büyük yan zincirli kalıntıların bulunduğu noktadan keser (fenilalanin-triptofan gibi).
- 46. • OLİGOMERİK proteinler, non-kovalent bağlar ve disülfid köprüleriyle birleşmiş, birden fazla alt üniteden oluşurlar. • Eğer protein 2 veya daha fazla sayıda polipeptid zincirinden oluşmuş ise o halde önce bunların sayısı ve yaklaşık uzunlukları SDS-PAGE ile belirlenebilir • Alternatif olarak farklı tipteki N-terminal amino asitler var mı, bakılabilir.
- 47. Proteinler, üre, guanidin HCl, vb kaotropik ajanlar ile denature edilir. Bu işlemlerin sonucunda, primer yapı bozulmaksızın, polipeptid zincirleri birbirinden ayrılmış olur. Bireysel polipeptid zincirlerinin elde edilmesi • SDS-PAGE • Kromatografik yöntemler Oksidan/ redüktanlar ile sistin yapısındaki S-S bağı kırılır. Bunun için β-merkaptoetanol veya ditiyotreitol gibi maddeler kullanılır. 1- Hidrojen bağlarının koparılması 2- Disülfid köprülerinin yıkılması 3- Altünitelerin birbirinden ayrılması
- 48. • Disülfit bağının indirgenmesi • Bunun için önce DTT varlığında disülfit bağları kırılır • Daha sonra da alkilleme ile bağların tekrar kurulması engellenir
- 49. Kükürt köprülerinin konumu? • Diyagonal elektroforez yöntemi ile belirlenebilir. • Önce protein, kükürt köprüleri sağlam kalacak şekilde kesime uğratılır. • Peptid zincirlerini içeren karışım kağıdın bir köşesine uygulanarak elektroforeze tabi tutulur. • Daha sonra kağıda performik asit uygulanır, bu madde sülfit bağlarını parçalar; sisteik asit kalıntıları oluşur.
- 50. • Disülfit bağı içermeyen polipeptidlerin hareketliliği değişmeyeceği için bunlar çapraz çizgi üzerinde hizaya girerler. • Sülfit bağları olan polipeptidlerde ayrışma olur ve çaprazlama giden çigiden farklı yerde gözlenirler Electrophoresis map of the CNBr-cleavage products of the prochymosin solubilized from inclusion bodies with 8 M urea at pH 11
- 51. aa dizilerini bilmek ne işe yarar? 1. Araştırılan proteinin dizisi bilinen diziler ile kıyaslanır, fark olup olmadığı ortaya çıkar. Eğer protein dizisinde bilinen protein ailelerinden birine özgü bir dizi olduğu tespit edilebilirse, söz konusu proteinin de benzer bir işlevi olduğu görüşü oluşabilir. • Ör: kimotripsin ve tripsin serin proteazlar ailesinden proteinlerdir • Bu ailedeki proteinlerin aktif bölgelerinde bulunan reaktif bir serin kalıntısına bağlı olarak proteolitik etki gösterir • Eğer incelenen proteinin dizisi bu iki proteine benzerlik gösteriyorsa bunun da bir serin proteazı olma olasılığı yüksektir sonucu çıkarılabilir
- 52. aa dizilerini bilmek ne işe yarar? 2. Farklı kaynaklardan izole edilmiş aynı işleve sahip proteinlerin aa dizileri kıyaslanarak türler arasındaki (evrimsel) mesafeler araştırılabilir 4. Proteinin çeşitli görev/işlevleri yerine getirmesine yarayan aa dizileri belirlenebilir • Ör: proteinlerin amino ucunda bulunan 20 kalıntılı belirli bir dizi bu proteinin hücre membranı dışına salgılanacağını gösterebilir; 20 hidrofobik kalıntıdan oluşan bu diziye sinyal dizisi veya öncü dizi denir. 3. aa diziler incelenerek tekrar eden dizilerin olup olmadığı belirlenebilir • Ör: Calmodulin kalsiyuma duyarlı bir proteindir. Bu protein birbirine benzer aa dizisi içeren 4 bölgeden oluşur. Herbir bölge bir Ca++ iyonu bağlar.
- 53. aa dizilerini bilmek ne işe yarar? 5. Belirli bir proteinin analizine yönelik antikorun hazırlanabilmesi için o proteinin aa dizisinden faydalanılır. • Bir proteinin aa dizisi incelendiğinde belirli dizilerin, protein fare veya tavşana enjekte edildiği taktirde dizideki belirli bölgelerin antikor üretimini tetiklemede daha etkili olacağı görülebilir. • Bu dizileri içeren peptidler tasarlanarak antikorların üretimi tetiklenebilir. • Çok spesifik olan bu antikorlar daha sonra bu proteinin çözeltideki veya kan içindeki konsantrasyonunun belirlenmesinde, bir hücre içinde proteinin hangi bölgelerde bulunduğunun belirlenmesinde ve proteini kodlayan genin klonlanmasında kullanılabilir.
- 54. aa dizilerini bilmek ne işe yarar? 6. aa dizileri kullanılarak spesifik DNA probları sentezlenebilir, • Bir proteinin primer yapısını bilmek “tersine” genetik yöntemlerin uygulanabilmesini sağlar • Aa genetik şifre ile oluşturulduğu için aa dizisinin bilinmesi genetik şifreye uyumlu DNA problarının sentezlenebilmesini sağlar • Proteinde dizi analizi moleküler genetik biliminin ayrılmaz bir parçasıdır Inverse table Ala/A GCU, GCC, GCA, GCG Leu/L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG Arg/R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys/K AAA, AAG Asn/N AAU, AAC Met/M AUG Asp/D GAU, GAC Phe/F UUU, UUC Cys/C UGU, UGC Pro/P CCU, CCC, CCA, CCG Gln/Q CAA, CAG Ser/S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Glu/E GAA, GAG Thr/T ACU, ACC, ACA, ACG Gly/G GGU, GGC, GGA, GGG Trp/W UGG His/H CAU, CAC Tyr/Y UAU, UAC Ile/I AUU, AUC, AUA Val/V GUU, GUC, GUA, GUG START AUG STOP UAA, UGA, UAG
- 55. Rekombinant DNA teknolojisi proteinlerde dizi analizinde devrim yaratmıştır. • Edman yöntemi ile dizi analizi oldukça pratik bir yöntem olmakla birlikte 1000 kalıntıdan daha fazla sayıda aa içeren proteinlerin analizinde günümüzde rekombinant teknolojinin kullanılması daha iyi bir çözüm olmaktadır. • Bu sayede proteini kodlayan uzun DNA dizileri klonlanarak çoğaltılabilir, ve bu DNA’nın dizisi doğrudan kodladığı proteinin aa dizisini verir
- 57. Rekombinant DNA teknolojisi proteinlerde dizi analizinde devrim yaratmıştır. • Edman yöntemi ile dizi analizi oldukça pratik bir yöntem olmakla birlikte 1000 kalıntıdan daha fazla sayıda aa içeren proteinlerin analizinde günümüzde rekombinant teknolojinin kullanılması daha iyi bir çözüm olmaktadır. • Bu sayede proteini kodlayan uzun DNA dizileri klonlanarak çoğaltılabilir, ve bu DNA’nın dizisi doğrudan kodladığı proteinin aa dizisini verir
- 58. Rekombinant teknoloji var…proteini izole etmeye ne gerek var? • DNA baz dizileri yardımıyla proteinin primer yapısı aydınlatılabilse bile yine de proteinleri izole etmeye gerek duyulur. • DNA baz dizisi ile elde edilen dizi sadece ham proteinin aa dizisini belirlememizi sağlayabilir. Halbuki protein hücrede sentezlenirken uygun katlama işlemi ile tersiyer yapısına kavuşmuştur. • Protein sentezi takip eden bazı translasyonu izleyen (ing: posttranslational) modifikasyonlar sayesinde biyolojik işlevini / aktivitesini kazanabilecek forma kavuşur: • Pek çok protein sentez işlemleri sırasında kırpılır • veya çok daha büyük polipeptid zincirlerinin uygun şekilde kesilmesiyle oluşturulur • Bazı proteinlerde sistein kalıntıları kside edilerek kükürt bağları oluşturulur • Bazı proteinlerde bulunan bbelirli yan zincirler modifiye edilir • Dolayısıyla genomik ve proteomik analizler birbirini tamamlayıcı şekilde bir arada yürütülmelidir.
- 59. İmmünglobulinler • Vücudun savunmasında çok önemli görev alan, B lenfositler tarafından bir enfeksiyon mevcudiyetinde yapılarak kana salınan güçlü savunma maddeleridir (vücudun savunma silahlarıdır). • Plazmada bulunan protein yapısında maddelerdir. Gammaglobulinler veya Antikorlar olarak da bilinir. • “ Ig ” kısaltılmış sembolü ile gösterilirler. • İmmünglobulinler viral enfeksiyonlara, bakteriyel enfeksiyonlara, allerjilere, mantarlara karşı vücudu üst düzeyde korur. • Kolostrum'da 5 çeşit immünglobulin vardır: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM • İnek kolostrumu (Bovin Kolostrum) temel olarak IgG içerir. Diğer Ig'ler daha az düzeydedir. İmmün ~ bağışıklık
- 60. İmmünolojik Analizler • Etiketlenmiş antikorlar (ing: “antibodies”) kullanılarak hedef protein izole edilebilir, miktarı belirlenebilir ve gözlenebilir. Antikor ile etiketlenmiş hücrelerin floresan ışıma görüntüsü
- 61. antikor - antijen • İmmünolojik yöntemler belirli bir proteine duyarlı antikorların (diğer bir deyişle immünoglobulinlerin; kısaca Ig) sentezlenmesi ile başlar. • Antikor, antijen adı verilen yabancı bir maddenin varlığına duyarlılık göstererek hayvan bünyesinde sentezlenen proteindir. Sentezlenmelerinin nedeni hayvanın bünyesini enfeksiyondan korumaktır. • Antikorların sentezlenmelerine sebep olan antijenlerine karşı çok yüksek bir afiniteleri (bağlanma meyilleri) vardır. • Proteinler, polisakaritler veya nükleik asitler etkin antijenler olabilmektedir.
- 62. IgG Antigen binding fragment (Fab) Crystalizable fragment (Fc) V indicates variable portion 62
- 63. • IgG antikorları disülfit bağları ile birbirine bağlanmış 2 ağır (mavi) 2 hafif (kırmızı) olmak üzere 4 zincirden oluşmuştur. • Hafif ve ağır zincirler biraraya gelerek uçlarında antijen bağlama noktalarının bulunduğu Fab bölgelerini (Fab domains) oluşturur. • İki ağır zincir biraraya gelerek Fc bölgesini oluşturur. Fab bölgeleri esnek bağlayıcılar ile Fc bölgesine bağlanmıştır.
- 64. • Antikorlar antijen üzerindeki belirli bir grubu veya aa kümesini tanıyabilirler. Tanımayı sağlayan bu bölgeye antijen determinantı veya epitop (ing: epitope) denir. • Sentetik polipeptid zincirleri de antikor sentezini tetikleyebilir, yeter ki küçük molekül, makromoleküler bir taşıyıcı üzerinde yer alsın ve tanınan bir epitopa sahip olsun. • Bu durumda küçük yabancı moleküle “hapten” adı verilir.
- 65. • Hayvanlarda antikor sentezleyebilme kapasitesine sahip çok fazla sayıda hücre bulunmaktadır. Bunlardan her biri belirli bir antijene duyarlı antikoru üretebilir. • Canlıya verilen antijenin etkisi bu antijene spesifik antikoru üreten az sayıda hücrenin aniden çoğalmasıyla ve sayısının artmasıyla ortaya çıkar. Böylece bol miktarda antikor sentezlenir.
- 66. antijen antikor Bir protein antijen (bu örnekte lizozim) Fab bölgesinin ucuna bağlanır. Antikorun ucu ve protenin birbirine uyumlu yüzeyleri vardır, bağlanma sırasında hatrı sayılır bir yüzey alanında (yani kuvvetli bir) kenetlenme olur.
- 67. Antikorlar heterojendir - poliklonal • Bir tavşana 3 hafta arayla belirli bir antijen enjekte edilir, haftalar sonra artık tavşanın kanında bu antijene karşı oluşturduğu antikorlar dolaşmaktadır. • Bu uygulama ile verilen antijene duyarlı antikorları üreten hücrelerin üremesi sağlanmıştır. • Antikorlar incelendiğinde görülür ki bu antikorların antijene afinitesi farklı seviyelerdedir…birden fazla sayıda (türde) antijen oluşmuştur. • Bunun sebebi tavşanda antijenin farklı tarafını (epitop) tanıyabilen çeşitli antikorların mevcut olmasıdır. Diğer bir deyişle antijende birden fazla epitop vardır. • Bu şekilde üretilen antikorlara poliklonal antikor denir.
- 68. • Poliklonal antikorlar heterojen antikor karışımlarıdır ve bunlar belirli bir antijende farklı epitoplar üzerinden bağlanabilir. • Bu heterojenlik araştırmalarda antikorların kullanımını kısıtlayıcıdır. • Monoklonal antikorlar birbirilerinin kopyasıdır. Bunlar belirli bir antikoru üreten tek tip hücre tarafından üretilirler. • Monoklonal antikorlar antijende sadece belirli bir epitopa duyarlıdır. • Monoklonal antikorların sentezlenebilmesi immünolojik yöntemlerde antikorların kullanımını büyük ölçüde arttıran bir gelişme olmuştur.
- 70. • Hibridoma hücreleri antikor üreten hücreler ile miyelom hücrelerinin birleştirilmesiyle oluşturulur • Seçici besiyerinde geliştirilen hibridoma hücrelerinin çoğalması sağlanır • Hücreler, arzu edilen özellikte (spesifisite) antikor üretimi yapan hücrenin seçimi için taranır.
- 71. Proteinler, enzim ilintili immün testi (ELISA) ile teşhis ve tayin edilebilir. • ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay testinin İngilizce kısaltmasıdır. • ELISA yönteminde: renksiz bir substrat ile renkli bir ürün oluşturan belirli bir enzim belirli bir antijene duyarlı antikora kovalent bağ ile bağlanmıştır. • Eğer antijen ortamda mevcutsa, antikor antijene bağlanır, enzim katalizi ile gerçekleşen tepkime ile de renk oluşur • Dolayısıyla rengin oluştuğu yerde antijen mevcuttur • Bu analiz çabuk ve spesifiktir. Nanogram miktarlarda antikor bu yöntemle analiz edilebilir. • ELISA analizlerinde monoklonal antikorların kullanımı daha güvenilir sonuçlar vermektedir. • 2 tipi vardı: dolaylı ve sadviç E
- 72. Dolaylı ELISA • Dolaylı ELISA: – Antijenin olup olmadığı belirlenir – HIV testi bu temele göre gerçekleştirilir – Antijen (viral proteinler) bir kuyucuğun dibine yerleştirilir/sabitlenir, insan kanı kuyucuğa alınır, insanda antikor varsa antijene bağlanır, bağlanmamış antikorlar ve kan yıkanarak uzaklaştırılır, insan antikorlarına duyarlı enzim etiketli antijen eklenir
- 73. Sandviç ELISA • Sandviç ELISA – Antikor kuyunun dibine sabitlenir, antijeni içeren kan (veya sıvı) kuyu içine alınır, antijen antikora bağlanır, antijene duyarlı ikinci ve ilkinden farklı bir antikor ilave edilir, – enzim etiketi sayesinde çok etkili şekilde miktar belirlemek mümkün olur
- 74. Bir sonraki derste • Western blot tekniği • Floresan etiketleme • Peptidlerin sentezi • Proteinlerin NMR ve X-ışını ile 3 boyutlu yapılarının belirlenmesi • DNA, RNA ve genetik bilginin akışı
- 76. Rekombinant teknoloji var…proteini izole etmeye ne gerek var? • DNA baz dizileri yardımıyla proteinin primer yapısı aydınlatılabilse bile yine de proteinleri izole etmeye gerek duyulur. • DNA baz dizisi ile elde edilen dizi sadece ham proteinin aa dizisini belirlememizi sağlayabilir. Halbuki protein hücrede sentezlenirken uygun katlama işlemi ile tersiyer yapısına kavuşmuştur. • Protein sentezi takip eden bazı translasyonu izleyen (ing: posttranslational) modifikasyonlar sayesinde biyolojik işlevini / aktivitesini kazanabilecek forma kavuşur: • Pek çok protein sentez işlemleri sırasında kırpılır • veya çok daha büyük polipeptid zincirlerinin uygun şekilde kesilmesiyle oluşturulur • Bazı proteinlerde sistein kalıntıları kside edilerek kükürt bağları oluşturulur • Bazı proteinlerde bulunan bbelirli yan zincirler modifiye edilir • Dolayısıyla genomik ve proteomik analizler birbirini tamamlayıcı şekilde bir arada yürütülmelidir.
- 77. İmmünolojik Analizler • İmmün ~ bağışıklık • Etiketlenmiş antikorlar (ing: “antibodies”) kullanılarak hedef protein izole edilebilir, miktarı belirlenebilir ve gözlenebilir. Antikor ile etiketlenmiş hücrelerin floresan ışıma görüntüsü
- 78. antikor - antijen • İmmünolojik yöntemler belirli bir proteine duyarlı antikorların (diğer bir deyişle immünoglobulinlerin; kısaca Ig) sentezlenmesi ile başlar. • Antikor, antijen adı verilen yabancı bir maddenin varlığına duyarlılık göstererek hayvan bünyesinde sentezlenen proteindir. Sentezlenmelerinin nedeni hayvanın bünyesini enfeksiyondan korumaktır. • Antikorların snetezlenmelerine sebep olan antijenlerine karşı çok yüksek bir afiniteleri (bağlanma meyilleri) vardır. • Proteinler, polisakaritler veya nükleik asitler etkin antijenler olabilmektedir.
- 79. • Antikorlar antijen üzerindeki belirli bir grubu veya aa kümesini tanıyabilirler. tanımayı sağlayan bu bölgeye antijen determinantı veya epitop (ing: epitope) denir. • Sentetik polipeptid zincirleri de antikor sentezini tetikleyebilir, yeter ki küçük molekül makromoleküler bir taşıyıcı üzerinde yer alsın ve tanınan bir epitopa sahip olsun. • Bu durumda kücük yabancı moleküle “hapten” adı verilir.
- 80. • Hayvanlarda antikor sentezleyebilme kapasitesine sahip çok fazla sayıda hücre bulunmaktadır. Bunlardan herbiri belirli bir antijene duyarlı antikoru üretebilir. • Canlıya verilen antijenin etkisi bu antijene spesifik antikoru üreten az sayıda hücrenin aniden çoğalmasıyla ve sayısının artmasıyla ortaya çıkar. Böylece bol miktarda antikor sentezlenir.
- 81. • IgG antikorları disülfit bağları ile birbirine bağlanmış 2 ağır (mavi) 2 hafif (kırmızı) olmak üzere 4 zincirden oluşmuştur. • Hafif ve ağır zincirler biraraya gelerek uçlarında antijen bağlama noktalarının bulunduğu Fab bölgelerini (Fab domains) oluşturur. • İki ağır zincir biraraya gelerek Fc bölgesini oluşturur. Fab bölgeleri esnek bağlayıcılar ile Fc bölgesine bağlanmıştır.
- 82. antijen antikor Bir protein antijen (bu örnekte lizozim) bir Fab bölgesinin ucuna bağlanır. Antikorun ucu ve protenin birbirine uyumlu yüzeyleri vardır, bağlanma sırasında önemli bir yüzey alanında kenetlenme olur.
- 83. Antikorlar heterojendir - poliklonal • Bir tavşana 3 hafta arayla belirli bir antijen enjekte edilir, haftalar sonra artık tavşanın kanında bu antijene karşı oluşturduğu antikorlar dolaşmaktadır. • Bu antikorlar verilen antijenin antikor üreten hücrelerin üremesini sağlamıştır. • Antikorlar incelendiğinde görülür ki bu antikorların antijene afinitesi farklı seviyelerdedir…birden fazla sayıda (türde) antijen oluşmuştur. • Bunun sebebi tavşanda antijenin farklı tarafını (epitop) tanıyabilen çeşitli antikorların mevcut olmasıdır. Diğer bir deyişle antijende birden fazla epitop vardır.
- 84. • Poliklonal antikorlar heterojen antikor karışımlarıdır ve bunlar belirli bir antijende farklı epitoplar üzerinden bağlanabilir. • Bu heterojenlik araştırmalarda antikorların kullanımını kısıtlayıcıdır. • Monoklonal antikorlar birbirilerinin kopyasıdır. Bunlar belirli bir antikoru üreten tek tip hücre tarafından üretilirler. • Monoklonal antikorlar antijende sadece belirli bir epitopa duyarlıdır. • Monoklonal antikorların sentezlenebilmesi immünolojik yöntemlerde antikorların kullanımını büyük ölçüde arttıran bir gelişme olmuştur.
- 85. • Hibridoma hücreleri antikor üreten hücreler ile miyelom hücrelerinin birleştirilmesiyle oluşturulur. • Seçici besiyerinde geliştirilen hibridoma hücrelerinin çoğalması sağlanır. • Hücreler, arzu edilen özellikte (spesifisite) antikor üretimi yapan hücrenin seçimi için taranır.
- 86. Floresans mikroskopisi • Belirli bir proteine duyarlı floresan etiketler monoklonal antikor ilgi Gelişmekte olan Drosophila (meyve sineği) embriyosunun floresan mikrografı
- 87. Proteinler enzim ilintili immün testi (ELISA) ile teşhis ve tayin edilebilir • ELISA yönteminde: renksiz birsubstrat ile renkli bir ürün oluşturan belirli bir enzim belirli bir antijene duyarlı antikora kovalent bağ ile bağlanmıştır. • Eğer antijen ortamda mevcutsa, antikor antijene bağlanır, enzim katalizi ile gerçekleşen tepkime ile de renk oluşur • Dolayısıyla rengin oluştuğu yerde antijen mevcuttur • Bu analiz çabuk ve spesifiktir. Nanogram miktarlarda antikor bu yöntemle analiz edilebilir. • ELISA analizlerinde monoklonalantikorların kullanımı daha güvenilir sonuçlar vermektedir.
- 88. Birkaç tip ELISA yöntemi vardır • Dolaylı ELISA: – Antijenin olup olmadığı belirlenir – HIV testi bu temele göre gerçekleştirilir – Antijen (viral proteinler) bir kuycuğun dibine yerleştirilir/sabitlenir, insan kanı kuyucuğa alınır, insanda antikor varsa antijene bağlanır, bağlanmamış antikorlar ve kan yıkanarak uzaklaştırılır, insan antikorlarına duyarlı enzim etiketli antijen eklenir
- 89. Birkaç tip ELISA yöntemi vardır • Sandviç ELISA – Antikor kuyunun dibine sabitlenir, antijeni içeren kan (veya sıvı) kuyu içine alınır, antijen antikora bağlanır, antijene duyarlı ikinci ve ilkinden farklı bir antikor ilave edilir, – enzim etiketi sayesinde çok etkili şekilde miktar belirlemek mümkün olur
- 90. Bir sonraki derste • Western blot tekniği • Floresan etiketleme • Peptidlerin sentezi • Proteinlerin NMR ve X-ışını ile 3 boyutlu yapılarının belirlenmesi • DNA, RNA ve genetik bilginin akışı