1. Dr. Güven Toksoy, PhD
İstanbul Üniversitesi
İstanbul Tıp Fakültesi
Tıbbi Genetik AD
Moleküler Dizileme Teknolojileri
31.10.2014 22:44 1
2. • Klasik dizileme
– Sanger dizileme
– Maxim Gilbert dizileme tekniği
• Yeni nesil dizileme teknolojileri
2. Nesil dizileme
Illumina (Reversible Dye Terminator)
Ion Torrent (native dNTP proton detection)
Roche (Pyrosequencing) (çekildi, teknoloji değişikliği ?)
Solid ABI (Ligation based) (çekildi)
3. Nesil dizileme (henüz rutinde yok 2-3 yıl)
PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor)
Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor)
Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor)
31.10.2014 22:44 2
3. Karşılaştırma
SANGER DİZİLEME YENİ NESİL DİZİLEME (2. nesil)
Sınırlı büyüklük Tüm genoma kadar
900-1000 bp 75-400 bp
Tüm dizi tek çıktı Her bir hedef için çok kopya
Mozaiklik için yetersiz Mozaiklik için uygun
Dizi başına ~5 USD (baz başına 5/1000USD) Exom ~500 USD (500/30x103USD)
Motiften bağımsız yüksek özgünlük Motife göre değişen özgünlük
Altyapı göreceli ucuz Altyapı pahalı
Run maliyeti ucuz* Run maliyeti pahalı*
31.10.2014 22:44 3
5. 3 ’ G A C T A G A T A C G A G C G T G A 5’Template DNA
5 ’ C T G A T C T A T G C T C G C A C T 3 ’
Elektroforez*
C T G A T C
҉
C T G A T C T
҉
C T G A T C T A
҉
C T G A T C T A T G
҉
C T G A T C T A T G C
҉
C T G A T C T A T G C T
҉
C T G A T C T A T G C T C
҉
C T G A T C T A T G C T C G
҉
C T G A T C T A T G C T C G C
҉
C T G A T C T A T G C T C G C A
҉
C T G A T C T A T G C T C G C A C
҉
C T G A T C T A T G C T C G C A C T
҉
z
a
m
a
n
C T G A T C T A T
҉
A G T C
T
C
A
C
G
C
T
C
G
T
A
T
C
O
K
U
M
A
Y
Ö
N
Ü
*işaretli nükleotid ile sonlanmış binlerce kopya içeren fragmanlar
Primer
dizisi
31.10.2014 22:44 5
6. Yeni Nesil Dizileme
• Next generation sequencing (Yeni nesil dizileme)
• Deep sequencing (Derin dizileme)
• Massivelly parallel sequencing (Masif paralel dizileme)
• High-throughput sequencing (Yüksek kapasiteli dizileme)
Second generation sequencing
Illumina (Reversible Dye Terminator)
Roche (Pyrosequencing) (??)
Solid ABI (Ligation based) (çekildi)
Ion Torrent (native dNTP proton detection)
Third generation sequencing
PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor)
Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor)
Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor)
31.10.2014 22:44 6
7. İş akışı
Dizileme
(Sequencing)
Kütüphane
hazırlanması
(Library preparation)
Veri analizi
(Data analysis)
DNA örnekleri fragmante edilir (ya da hedef fragmanlar
elde edilir), fragmanların ucuna platforma özgün
adaptörler takılır
PCR ile amplifiye edilir (platforma spesifik ortamda)
Yeni nesil dizilemede DNA sentezi ve okuma işlemi aynı
anda gerçekleşir ve eşzamanlı olarak bir çok dizileme yapılır
(Massively parallel sequencing)
(kısa okuma ve hatalı okumanın ana nedeni de bu işlem sırasındaki desenkronizasyondur)
RAW data analizi, dizilerin filtrelenmesi, assambling,
varyasyon analizi, biyoinformatik analiz
31.10.2014 22:44 7
8. • De novo sequencing
• Resequencing
• Targeted sequencing
• Shotgun Targeted sequencing
VERİ BÜYÜKLÜĞÜ
normal
Polimorfizm
Patolojik/
olası patolojik
Gri bölge
Terimler
• Whole genome sequencing
• Exom sequencing
• Targeted sequencing
• Sanger sequencing
31.10.2014 22:44 8
9. Yeni nesil dizileme ile
tanı
İşlem sonrası
Elde edilen bilgi
Sonuç
Lab iş
gücü
Nadir/de novo varyasyonlar
ya da etkisi bilinmeyen mutasyonlar
Polimorfizm
Normal diziler
Fenotip ilişkili mutasyon
Biyoinformatikçi31.10.2014 22:44 9
11. cfDNA ile anöplodi taraması
FİRMA-MARKA PLATFORM ANALİZ TEKNİĞİ ve ALGORİTMA
BGI:NIFTY Illumina Hiseq& İon proton MPSS
SEQUENOIM: Materni T21Plus Illumina Illumina Hiseq t-MPSS
Verinata Health: Verifi Prenatal test Illumina Hiseq S-MPSS
Integrated Genetics: Ariosa: Harmony Illumina Hiseq DANSR + FORTE (t-MPSS)
Natera:Panorama Illumina Hiseq Non kantatif - SNP tabanlı targeted
dizileme ~20.000 SNP
Premaitha healt: Iona test (2015 ocak) İon proton S-MPSS + Fetal fraksiyon düzeltmesi
MPSS:Massively parallel signature sequencing
FORTE:Fetal-fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation
NIFTY, Natera ve Sequanom Digeorge ve diğer mikro del/dup sendromları için sonuç veriyor.
31.10.2014 22:44 11
12. Sayılar
- 10 milyon adet 25-30 bp uzunlukta dizi elde edildiinde total genomun yaklaşık %4 ü dizilenmiş
oluyor. Bunlardan %50 si unique dizi. Chr13 için ~154.000, chr18 135.000 ve chr21 için 65.700
dizi haritalanabiliyor. (H. Christina Fan, PNAS, October 2008)
- Trizomi21 li fetus taşıyan gebelikte örnekten 10.800.000. okuma elde edililirken sadece bu
okunan dizilerden 21. kromozoma ait 32 000 tanesi (%0,3) anöploidi hesaplamasında
kullanılabiliyor (Chiu RW, Proc Natl Acad Sci USA 2008)
- Fetal plasental DNA fraksiyonu kromozomal dozun hesaplanmasında çok önemli ve spesifiteyi
arttırıyor.21. Kromozoma ait %4 oranında DNA taşıyorsa bunun trizomi durumunda %2 artış
beklenmelidir. Yüksek güvenilirlik için yaklaşık 93.000 adet 21. kromozoma ait dizinin elde
edilmesi gerekir. Bu da 21. kromozom DNA yükü total genomun % 1,5 olduğu için toplam
okunabilir dizi sayısının minimum 6.3 milyon, ortalama MPSS verimi %25 olduğundan yaklaşık
örnek başına toplam 25.000.000 okuma yapmak gerekmektedir. (Andrew B. Sparks, P APRIL American Journal of
Obstetrics & Gynecology, 2012)
- Targeted SNP çalışmalarında yaklaşık 25.000 yüksek polimorfizm gösteren SNP bölgesi taranıyor.
31.10.2014 22:44 12
13. cfDNA
Plazmada serbest DNA fragmanları ≤300bp
Köken: Plasenta sitotrofoblast ve sinsisyotrofoblast hücreleri
apoptosis ve yıkımı
Plasenta kökenli
DNA <%10
Maternal
DNA ≥%90
Eritrositler
Lenfositler
Plazma
- İnsan genomu ~3 milyar baz uzunluğunda
- Rastgele kırılmış halde milyonlarca küçük fragman
- chr13 %3,7; chr18 %2,5 chr21 %1.5’ ini oluşturuyor
- Plasental DNA parçacıkları total havuzda fraksiyon %10 ise
chr13 % 0,37; chr18 %0,25; chr21 %0,15
Perferik
kan
31.10.2014 22:44 13
14. cfDNA nın yeni nesil dizilemede kullanımı
Kantitatif: Amplifikasyon sonrası
karşılaştırmalı ürün artışının
saptanması
Kalitatif: Plasental DNA dan elde edilen
baba kökenli dizide anneden farklı baz
değişiminin gösterilmesi
Plasental DNA
Maternal lokus
Plasental DNA
Paternal lokus
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T C G T C A T T G C A T C G A
Plasental DNA Pat
Plasental DNA Mat
G A C T A G A A G C G T G T C G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
Maternal DNA
Maternal DNA
Plasental DNA
amplifikasyon
fark31.10.2014 22:44
14
15. cfDNA da plasental DNA nın saptanması
• Y kökenli dizilerin total DNA havuzuna oranı
• SNP farklılılarının saptanması
SNP : Genomda bulunan ve fenotipi etkilemeyen kısa baz değişiklikleridir. Toplumda değişik sıklıklarda
saptanan SNP ler vardır. Genomda şimdilik bilinen SNP sayısı >70.000.000
ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG
ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGATACAGTAG
GTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG
CTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGAT
GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG
GCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAG
ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG
TAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGG
GGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG
AGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATA
GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG
ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGC
TTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG
AGGAGGTGATTTCGCCAAT
.
.
.
ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCG
ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCA
ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGC
.
.
ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGAT
%92
%8
!!! Aynı yöntem nokta mutasyonları ve Rh analizlerinde de kullanılmaktadır.
31.10.2014 22:44 15
16. SNP tabanlı targeted dizileme (PANORAMA)
31.10.2014 22:44 16
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
ANNE SNP PROFİLİ
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G A A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T G A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T G A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T G A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G T G A T T G C A T C G A
cfDNA SNP PROFİLİ
G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A
T/A C/C
G/CT/G
17. Örnek alımı
• Maternal periferik kan ~10 ml
• standard EDTA içeren tüp (~8 saat)
• Özel CF DNA örnekleme tüpü (14 gün oda ısısı)
(Streck Cellfree DNA BCT CE)
31.10.2014 22:44 17
19. • Library preparation
Adaptör ve barkod eklenmesi
- Adaptör DNA nın tutunmasını sağlar ve amplifikasyon sırasında primer görevi yapar.
- Barkod aynı çalışmada çalışılan örneklerin birbirinden ayrılmasını sağlar
31.10.2014 22:44 19
22. Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil
dizileme ile
amplifikasyon
tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Anne ye ait
DNA fragmanları
Fetusa ait
DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL
Kromozom
18 13 21
Kromozom
18 13 21
1 : 1 : 1
Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom
23. Kantitatif Yöntem
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Chr 21 fragmanları Chr 21 fragmanları
Amplifikasyon öncesi DNA Havuzu
maternal
fetal
Aynı kromozomun
fragmanlarında farklı oranlarda
artış?
24. DNA baz dizilimi ve CG zenginliğine göre
amplifikasyon veriminin değişimi
• Mavi pikler CG zenginliği göz önüne
alınmadan elde edilen sonuç
• Kırmızı pikler CG zenginliği dikkate
alınarak normalizasyon yapılmış durum
H. Christina Fan, 2010
!!! Problem : Lokasyon (CNV varlığı) ve
motife (CG/AT oranı) dayalı
amplifikasyon farklılıkları dozun
değişmesine yol açar!!
Çözüm: CG zenginliği paralel dizilerin
kullanılarak normalizasyon yapılması ve
stabil bölgelerin analize alınması
31.10.2014 22:44 24
25. Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil
dizileme ile
amplifikasyon
tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Anne ye ait
DNA fragmanları
Fetusa ait
DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL
Kromozom
18 13 21
Kromozom
18 13 21
1 : 1 : 1
Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom
26. Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil
dizileme ile
amplifikasyon
21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış
Fetusa ait
DNA fragmanları
Anne ye ait
DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; Fetus TRİZOMİK
Kromozom
18 13 21
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Kromozom
18 13 21
9:1 ; 9/1 : 9/1,5
Anne 46 kromozom + fetus 47 kromozom (47,+21)
27. Kalitatif yYöntem :Targeted sequencing
Önceden belirlenmiş
hedef bölgeler için
tasarlanmış
oligolar
Amplifikasyon
DNA havuzundan istenen
bölgelerin ayıklanması
hedef bölgeler için
Havuzdaki miktarla orantılı elde
edilen oligolar
Veri analizi
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgatcatgg
atgagcatg
atgagcatg
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgtacgaa
cgttcgaa
cgttcgaa
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcatgca
ggcctgca
ggcctgca
31.10.2014 22:44 27
28. Targeted sequencing/ SNP sequencing/ MPSS/s-MPSS
MPSS SNP sequencing Targeted sequencing
Dizilenen
bölge sayısı
Yüksek sayıda
dizi elde edilir
Sınırlı sayıda okuma elde
edilir
Sınırlı sayıda okuma
elde edilir
Tekrar sayısı Yüksek Yüksek Yüksek
Akraba evliliğinde
hassasiyet
Yumurta
donasyonunda
Hassasiyet*
Değişmez Değişmez Değişmez
*Fetal plasental DNA nın fraksiyonunun hesaplanmasında ve SNP tabanlı
çalışmalarda analiz optimizasyonu gerektirir. Çalışan firmalar var (Harmony, Materni21),
çalışmayan (Panorama)
31.10.2014 22:44 28
29. Gelecekteki beklentiler
• Mikrodelesyon ve mikroduplikasyonların yüksek hassasiyetle ve
güvenilirlikle yapılması
• Tek gen hastalıklarının topluca taranabilmesi
• Tüm genom dizileme
Daha uzun dizilerin amplifikasyon olmadan okunabilmesi,
Maliyetlerin düşmesi
Teşekkürler
31.10.2014 22:44 29
