2. DNA çift sarmal şeklinde birbirine sarılan
İki zincirden oluşur.
İki zincir antiparaleldir. (3’-5’ ve 5’-3’)
DNA zincirleri birbirini tamamlayıcıdır.
A=T ve G=C şeklinde bağlanma yapar
3. - Nükleik asitler 3 temel bileşen içerir
• 5 karbonlu Şeker ; Riboz, Deoksiriboz
5. Sarmal yapı insan için 4 bazın (harf) yan yana dizilerek 3.2 milyar bazdan oluşan 46 ciltlik bir
kitap serisi oluşturur. Bu seri bireyi oluşturan bilginin yazıldığı alfabeyi içerir.
10. - DNA jel elektroforez ile boyutlarına göre ayrılabilmektedir
11. DNA İzolasyonu
DNA izolasyonu dokudan dokuya ve türden türe göre çok fazla değişiklik gösterse de genel
itibari ile izolasyon aşamalarını 6 kısma ayırmak mümkündür.
1. Dokuların ve hücrelerin parçalanması
2. Ezilmiş hücrelerin extraksyion tamponunda lisiz edilmesi
3. Hücresel atıkların (Hücre zarı, çeperi vb) nükleik asitlerden uzaklaştırılması
4. Proteinlerin ve lipitlerin uzaklaştırılması
5. DNA’nın yoğunlaştırılması ve tekrar çözünür hale getirilmesi
6. DNA miktar ve kalite tayininin yapılması
12. DNA İzolasyonu
1. Dokuların ve hücrelerin parçalanarak lizis edilmesi
Bitkisel, bakteriyel ve sert dokulardan DNA izolasyonu için ilk önce hücrelerin
tamamen parçalanması gereklidir. Mortar ve pestle (havan) bu işlem için en çok kullanılan
cihazların başında gelir.
• Eğer DNA izolasyonu hemen başlanacaksa örneklerin doğrudan lizis tamponu içerisinde
ezilmesi uygundur.
• Örnekler -80’de saklanacaksa sıvı azot içerisinde ezilerek saklanması daha uygundur.
13. DNA İzolasyonu
2. Ezilmiş hücrelerin extraksyion tamponunda ısıtılması ( 60 Dak)
Ekstraksiyon Tamponu:
%2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide)
1.42 M NaCl,
5mM Askorbik Asit,
20 mM EDTA
Tris-HCl (pH:8)
%0.2 PVP 40.
1-2 damla β-merkaptoetanol
Isıtma işlemi hücrelerin
tamamen lisiz edilerek
proteinlerin parçalanmasını
,yağların çözünür hale
getirilmesini ve daha çok
DNA’nın serbest kalmasını sağlar
CTAB: katyonik bir deterjan olup , polisakkarit ve
polifenollerin DNA’dan ayrılmasını sağlar.
NaCl: Nükleik asit çöktürmesinde kullanılan değerli
katyondur.
PVP (polyvinlyprolidone): Nükleik asitlerin proteinler,
lipitler ve ekstraksiyonda istenmeyen diğer moleküllerden
arındırılmasına yardımcı olur.
β-merkaptoetanol: Nükleik asitleri nükleaz aktivitesinden
koruyan ve proteinleri
denature eden ajandır.
EDTA: DNazların kofaktörü olan Mg+2’ a bağlanarak, DNaz
enzimini inhibe eder.
Tris-HCl: Ortam pH’ sını tamponlamak amacıyla kullanılır.
14. DNA İzolasyonu
3. Hücresel atıkların DNA’dan ayrılması (santrifügasyon)
Santrifüj işlemi yüksek devirde
hücresel atıkların dibe çökmesini ve
DNA -RNA nın ise süpernatant adı
verilen solüsyonda kalmasını sağlar.
Santrifüje tüp koyarken dengeye
dikkat edilmeli
15. DNA İzolasyonu
4. Organik fazın ayrıştırılması (protein-lipit ayrıştırılması)
Süpernatant üzerine fenol/kloroform/ isoamil alkol eklenir.
Fenol: solusyondaki proteinlerin denatüre edilerek organik fazda çökertilmesini sağlar.
Ph değişimine göre DNA ve RNA izolasyonunda kullanılır
Kloroform: yağların çözülerek, ara bir fazda hapsedilmesine ve faz ayrımına yardımcı olur
İzoamil alkol: DNA’nın içinde bulunduğu bir üstfaz oluşmasına sağlar, köpüklenmeyi önler
16. DNA İzolasyonu
5- DNA’nın alkol ile çöktürülmesi
Fenol-klorofom evresinden sonra süpernetant üzerine soğuk etanol
yada tuz eklenerek -20’de DNA görülene kadar bekletilir.
• Etanol su molekülleri ile hidrojen bağı kurduğundan suda çözünen
DNA’nın sudan ayrılarak çökelmesini sağlar
• Tuz ise suyun fosfat yükünden kaynaklı yükünü nötralize ederek,
sulu fazdan DNA’nın ayrılmasını sağlar
17. DNA İzolasyonu
6- DNA miktar ve kalitesinin ölçülmesi
• Spektrofotometreler, temel olarak sıvı örneğe belli bir dalga boyunda ışık gönderdikten
sonra bunun ne kadarının sıvı içerisinde absorbe edilmeden geçip gittiğini ölçer.
• Sıvının içindeki madde ne kadar fazla ise soğurulan ışığın miktarı o kadar fazla olur.
Gönderilen ve geçen ışık miktarının oranından, absorbans adı verilen optik yoğunluk
değeri (OD) ölçülür.
Nükleik asitler bir çok dalga boyunda absorbans gösterse de, maksimum soğurma yaptığı ışık
260 nm dalga boyundadır.
18. DNA İzolasyonu
6- DNA miktar ve kalitesinin ölçülmesi
• Nükleik Asit (DNA, RNA) örnekleri 260nm, Proteinler 280 nm dalga boylarında maksimum
absorbansa sahiptir.
• Bu iki dalga boyunda elde edilen absorbansların oranı bize ‘saflık’ derecesini verir.
• Benzer şekilde 230nm dalga boyunda elde edilen absorbanslar ‘Kontaminasyon’ olarak
kabul edilir.
• Nükleik Asitler için saflık değerini 260/280 oranı verir. Beklenen saflık değeri; DNA
ölçümleri için : ~ 1,8 RNA ölçümleri için : ~ 2,0 kabul edilir.
• "Saf" bir nükleik asit için 260/230 değerleri genellikle 1.8 - 2.2’dir.
19. DNA İzolasyonu
6- DNA miktar ve kalitesinin ölçülmesi
• Nükleik Asit (DNA, RNA) örnekleri 260nm, Proteinler 280 nm dalga boylarında maksimum
absorbansa sahiptir.
• Bu iki dalga boyunda elde edilen absorbansların oranı bize ‘saflık’ derecesini verir.
• Benzer şekilde 230nm dalga boyunda elde edilen absorbanslar ‘Kontaminasyon’ olarak
kabul edilir.
• Nükleik Asitler için saflık değerini 260/280 oranı verir. Beklenen saflık değeri; DNA
ölçümleri için : ~ 1,8 RNA ölçümleri için : ~ 2,0 kabul edilir.
• "Saf" bir nükleik asit için 260/230 değerleri genellikle 1.8 - 2.2’dir.
20. Kolon temelli DNA izolasyonu
• Hazır kit sistemleri parçalanmış hücrelerin silika jel içeren bir tüpten
geçirilmesine dayanmaktadır. Bu jel DNA’ya yapışarak katı fazlı bir
extrasksiyon yapar.
• Kit sistemleri pahalı olup, her durumda çalışma garantisi vermez.
Ayrıca elde edilen DNA miktar olarakaz ancak kalite olarak yüksektir.
• Kitlerin en büyük avantajı, DNA izolasyonunun birkaç saat içerisinde
sonuçlandırmasıdır.
