Pvr99 vd
•Download as PPT, PDF•
0 likes•313 views
Hop latnet viroid infection in Slovenian varieties of hops (Humulus lupulus), Knapič, Vlasta. B. Javornik
Recommended
More Related Content
Viewers also liked
More from Slovenian Plant Protection
More from Slovenian Plant Protection (20)
Pvr99 vd
- 1. Vlasta KNAPIČ 1, Branka JAVORNIK 2 a1 Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Žalec a2 BF, Center za žlahtnjenje in rastlinsko biotehnologijo OKUŽENOST HMELJA (Humulus lupulus L.) Z VIROIDI
- 2. Viroidi a So najmanjši rastlinski patogeni, ki se v rastlinski celici sami razmnožujejo. a Na hmelju: • latentna bolezen hmelja - HLVd • zkrnelost hmelja - HSVd a Viroid = gola, infekciozna nukleinska kislina
- 3. Zgradba viroidov - ss RNA CC CCG G G G GG CC U C Terminalna cona 1 Konzervirani center Terminalna cona 2 Cona patogenosti Cona variabilnosti Viroidna RNA = nosilka dednih informacij = nosilka strukture viroida
- 4. Detekcija viroidov a Niso vidni z elektronskim mikroskopom a Serološki testi niso mogoči Določljivi so z molekularnimi tehnikami: • elektroforeza na PAGE • Molekularna hibridizacija z obeleženo sondo • prepis z reverzno transkriptazo in PCR namnožitev
- 6. Ekstrakcija viroidne RNA iz celice a TESSM ekstrakcijski pufer • razbije celico, homogeizira vzorec, inhibira RNAze a 3 x fenolna ekstrakcija > odstrani beljakovine a Na acetat + izopropanol > precipitira NK iz supernatanta a (razgradnja NK z DNAzo I ) a čiščenje NK z LiCl • viroidna RNA topna v 0,8 M LiCl • druge RNA in DNA se precipitirajo v skupek • po centrifugiranju je viroidna RNA v supernatantu £ po vsakem koraku sledi centrifugiranje pri 10 do 15000 obr/min za 15 do 20 minut
- 7. R-PAGE - povratna elektroforeza Return Polyacrylamid Gel Electrophoresis a Gel deluje kot molekularno sito a Skozenj potujejo negativno nabite molekule NK a Lažje molekule potujejo hitreje a ds RNA potuje hitreje kot dsDNA a viroidna ssRNA (250 - 375 nt) potuje še hitreje, je pri 7% PAGE med a barvili ksilen-cianol in bromfenol modro
- 8. R-PAGE - izbira gela a Gostoto gela daje: • razmerje akrilaamid : bisakrilamid od 29 : 1 do 30 : 1 • koncentracija gela 6%-8% a Gostejši ko je gel • bolje loči majhne molekule • dlje traja elektroforeza a 7 % PAGE traja 2,5 - 3 ure • R-PAGE pa še 1,5 ure
- 9. R-PAGE - Priprava elektroforeze a Med stekleni plošči (16x18 cm) vlijemo gel a Raztopljene NK nanesemo v žepke gela • 15 ali 20 vzorcev na 1 gel a Gel vstavimo v posodo s pufrom • Trizma base, borova kislina, EDTA a Priključimo električni tok • 88 mA, napetost do 10 V/cm poti • gele hladimo, saj med EF narste upornost in tok pada
- 10. R-PAGE - Potek elektroforeze a Navzdol potuje viroid v linearni obliki a Preden tok obrnemo, ga denaturiramo • segrejemo pufer na 70 °C • 5% TBE pufer zamenjamo z 1,25% TBE a Vzorci in gel so med EF brezbarvni a Gel barvamo s srebrom, da zaznamo črte nukleinskih kislin a meja 5 ng viroida v črti na gelu (10 ng/g rastlinskega tkiva)
- 11. Denaturacija viroidov Spremembe oblik: CC CCG G GG GGCC U paličasti okvir 50°C lopar 70°C kolobar 90°C ravna vijačnica
- 12. R-PAGE - Viroidno črto v gelu zaznamo, če je: a dovolj viroida v hmelju – storžki / mladi polno razviti listi a uspešna ekstrakcija – kontaminacija z RNAzami a uspešno čiščenje – brez beljakovin, polisaharidov, polifenolov – odstranjene DNK in velike RNK a uspešno barvanje – fiksiranje RNA v ocetni kislini – barvanje s AgNO3, razvijanje z Na2CO3 + Na2S2O3
- 13. R-PAGE - Viroidne črte v gelu 1 2 3 4 1 - krompir 1 2 3 4 F/TE/F/voda 1 2 3 4 2, 3 - AU TE pufer formamid 4 - apolon 15¸.12.98
- 14. 7 % PAGE - Primerjava čiščenja z LiCl A B C D E A - supernatanti po precipitaciji z LiCl (1x) B - v vodi raztopljeni skupki NK po 1. LiCl C - brez LiCl, z DNAzo tretirani skupki v TE D - supernatant po 2. precipitaciji z LiCl (2x) 18.01.99, PAGE 7% (AA:bisAA=29:1) A,B,C,E ekstrakcija iz 1,5 g v 30 ml PA E - 2 x LiCl skupki NK D ekstrakcija iz 1 g v 4x 2 ml epf. 3,7, 11, 16, 20 - Storžki magnuma 4, 8, 13, 17 - list aurore
- 15. 6 % PAGE - Primerjava čiščenja z LiCl M - marker M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 M 1 - AUR Log 2 - AUR Log 3 - AUR kretenska 4 - H. japonicus 5 - APO Koroška/s. List 6 - MAG 7 - PL kontrola 298 234 8 - SG št. 332 220 9 - 12>PL kontrola 154 6.11.97, PAGE I (AA:bisAA=30:0,75)
- 16. 6 % R-PAGE - Hmeljev latentni viroid M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 M M - marker - 1 H. japonicus +2 AUR Log - 3 H. japonicus +4 APO Koroška/s. +5 SG št. 332 brez LiCl +6 MAG/simptomi +7 SG št. 332 / LiCl +8 MAG/simptomi /LiCl +9 - 11 PL kontrola 6.11.97, R-PAGE II (AA:bisAA=30:0,75)
- 17. M - marker 6 % R-PAGE - HLVd 1 - AUR Log 4 2 - AUR Log 1 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 3 - AUR kretenska 4 - H. japonicus 5 - APO Koroška/s. 6 - MAG Radlje 7 - AUR Log 4 8 - AUR Log 1 9 - AUR kretenska 10 - H. japonicus Brez LiCl Čiščenje z LiCl 11 - APO Koroška/s. 12 - MAG Radlje 13, 14>PL kontrola 24.10.97, R-PAGE 6% (AA:bisAA=30:0,75)
- 18. 7 % PAGE - Viroidni pas viden že v prvi smeri ¢ 1 - magnum (storžki) ¢ 2 - negativna kontrola M ¢ 3 - aurora (storžki) ¢ 4 - aurora ¢ 5 - aurora BFB ¢ 6, 7 - neg. PSTVd iz gomolja ¢ 8, 9 - savinjski golding ¢ 10 - aurora (listi) ¢ 11, 12 - apolon 09.12.98 XCY raztapljanje NK v formamidu (denaturant )
- 19. HLVd pozitivni vzorci hmelja M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ¢ 1 - Marker ¢ 2 - aurora ‘93 list ¢ 3 - aurora ‘96/list/BV ¢ 4 - 7 aurora 89/storžki ¢ 8 - savinjski golding ¢ 9 - apolon ‘93 ¢ 13, 14 - magnum 97
- 20. Rezultati analize HLVd v hmelju a Vsi pregledani vzorci hmelja so bili HLVd pozitivni a Vzorci : zreli celi storžki a Fenolna ekstrakcija z LICl obarjanjem a Detekcijo motijo polifenoli in polisaharidi a Na 7% PAG še dovolj dobro ločimo viroidno RNA od rastlinskih
- 21. Hmeljev stunt viroid a Je karantenski organizem na Japonskem a močno znižuje pridelek, rastlina odmre a v letih 1996, 1997 in 1998 smo opazili simptome: • zaostajanja v rasti v juniju (aurora) • deformacija polnorazvitih listov (aurora, magnum) • odklanjanje rastnih vršičkov (apolon, aurora) • razbarvanje mlajših listov (aurora) a simptomatične rastline so rastle v vrstah ali krogih
- 22. Analiza Hop stunt viroida (Sano, 1998) Univerza Hirosaki, Faculty of Agriculture and Life Science, Japonska) ¢ Ekstrakcija RNA/ 2M LiCl ¢ 20 µ l vzorca na 7,5% poliakrilamidni gel PAGE ¢ povratna elektroforeza ¢ “recover” pasu s HSVd iz gela R-PAGE ¢ ponovna elektroforeza na 7,5% denaturacijskem gelu (8M urea) ¢ barvanje s srebrovim nitratom PAGE/d
- 23. Northern blot za HSVd (Sano, 1998) 1 2 3 4 5 6 7 8 Ekstrakcija RNA/ 2M LiCl C 20 µl vzorca na 7,5% R-PAGE “recover” HSVd iz gela ponovna elektroforeza na 7,5% L denaturacijskem gelu (8M urea) ² prenos z gela na naylon membrano 1, 2, 3 - AURORA - 89 ² hibridizacija z DIG označeno 4, 5 - APOLON - 93 cRNA sondo 6, 7 - MAGNUM - 97 8 - HSVd pozitivno
- 24. Dot-blot za HSVd (Sano, 1998) RNA Ekstrakcija RNA/ 2M LiCl Označena ² 5 µ l vzorca denaturira sonda DIG ( v 20 µ l denat. Raztopine Anti_DIG ( pri 68°C za 15 min antibody ² točkovno nakaplja na pozitivno nabito naylon Hranilni membrano pufer ² hibridizacija z DIG Alkalna označeno HSVd cRNA fosfataza sondo Sevanje svetlobe ² Vsi vzorci slov. kultivarjev DETEKCIJA so bili na HSVd negativni
- 25. 2D-PAGE za HSVd (Sano, 1998) ² po molekulski teži razporejene NK izpostavimo toku v pravokotni smeri v denaturacijskih razmerah ² viroid pri tem zaradi krožne oblike potuje počasneje - ga prepoznamo ² Vsi vzorci so bili na HSVd negativni ² ta metoda bi pokazala tudi druge - viroidom podobne povzročitelje
- 26. Zaključki ² Povratna elektroforeza na poliakrilamidnem gelu je primerna metoda za serijsko določanje viroidov v hmelju ² Je sorazmerno poceni ² V enem postopku lahko analiziramo 40 vzorcev ²priprava vzorcev traja 2 dni ²elektroforeza in barvanje 1 dan ² Je sorazmerno natančna
- 27. Zaključki ² Različne elektroforetske metode so ovrgle sum, da je hmelj okužen s HSVd ² Pravilno določitev sta potrdili Northern- blot in dot blot metoda hibridizacije: ² Pregledani kultivarji, ki so kazali simptome zakrnele rasti, niso okuženi s HSVd : ²aurora, apolon in magnum ² Niso okuženi z drugimi znanimi subviralnimi povzročitelji
- 28. Zaključki ² Z R-PAGE smo dokazali HLVd ² S hmeljevim latentnim viroidom so okuženi pregledani kultivarji: ² aurora ²apolon ²savinjski golding ²magnum
- 29. a Ali HLVd v stresnih razmerah povzroča simptome?
Editor's Notes
- Podobno kot veèina virusov imajo viroidi RNA, le da so brez proteinske ovojnice. RNA je krožna enolinijska (single-strained) in jo sestavalja 246 do 375 baz, ki so znotraj organizirane v nukleotidnei pare, kar daje viroidu v naravnem stanju obliko palièastega okvirja (rod-like shape). Sekvenca baz teži k homolgnosti Molekula RNA tipiènega viroida je sestavljena iz veè delov, kar je pomembno pri replikaciji: 1. Kotaleèi obroè, ki pobira gradnike iz gostiteljske celice 2. Linerani stadij RNA, ki ima veè funkcionalnih podroèij: Pravi viroidi se razmnožujejo v centralnem delu RNA, na terminalnih pa se spajajo z drugimi molekulami. Replicirajo se po sistemu kotaleèega obroèa, ki rabi celiène nukleoproteide in RNA polimerazo.
- Že virusi nimajo več lastnega metabolizma. Razmnožujejo se lahko le v živi celici s pomočjo njenih mehanizmov in njenih osnovnih gradnikov. Vendarle so zaključeni organizmi, ki jih sestavlja nukleinska kislina (DNA ali RNA) in beljakovinski plašč. Ta omogoča serološke teste, specifične za posamezne viruse in zaradi njega se virusi pri termoterapiji uničijo. Te metode pa pri satelitnih RNA in pri viroidih ne pridejo v poštev, saj so povzročitelji infekciozne nukleinske kisline (so premajhni) in ker proteinskega dela nimajo, niso imunogeni.
- Prva diagnostika viroidov je temeljila na simptomih gostiteljskih in testnih rastlin ter na analizi primarnih metabolitov gostiteljskih rastlin. Nato so poskusili izolirati povzročitelja z ekstrakcijo s fenolom in različnimi pufri ter s sedimentacijo (Sasaki and Shikata, 1977). Ker je viroidna RNA v rastlinskem materialu v zelo nizkih koncentracijah, jo je zelo težko izolirati. Ekstracija RNA iz tkiva hmelja ali vinske trte, ki je bogato s polifenoli in polisaharidi, je še težja (Hanold, 1993). Poleg tega je RNA zelo občutljiva na encimatsko razgradnjo, še posebej, ker je enolinijska (ss), zato je potrebno paziti že pri nabiranju in shranjevanju vzorcev ter zagotoviti sterilne pogoje pri ekstrakciji in določanju viroidne RNA, da ne pride do kontaminacije (Sambrook et al. , 1989).
- Prva diagnostika viroidov je temeljila na simptomih gostiteljskih in testnih rastlin ter na analizi primarnih metabolitov gostiteljskih rastlin. Nato so poskusili izolirati povzročitelja z ekstrakcijo s fenolom in različnimi pufri ter s sedimentacijo (Sasaki and Shikata, 1977). Ker je viroidna RNA v rastlinskem materialu v zelo nizkih koncentracijah, jo je zelo težko izolirati. Ekstracija RNA iz tkiva hmelja ali vinske trte, ki je bogato s polifenoli in polisaharidi, je še težja (Hanold, 1993). Poleg tega je RNA zelo občutljiva na encimatsko razgradnjo, še posebej, ker je enolinijska (ss), zato je potrebno paziti že pri nabiranju in shranjevanju vzorcev ter zagotoviti sterilne pogoje pri ekstrakciji in določanju viroidne RNA, da ne pride do kontaminacije (Sambrook et al. , 1989). Za določanje viroidov v rastlinskem materialu je znanih več metod, vse pa zaradi strukture viroidov temeljijo na identifikaciji in karakterizaciji ribonukleinskih kislin.
- Za detekcijo viroidov je dovolj učinkovita metoda povratna elektroforeza na poliakridnem gelu (R-PAGE - return polyacrylamid gel electrophoresis). Gel pri elektroforezi deluje kot molekularno sito, skozi katerega potujejo velike molekule počasneje kot manjše in se v gelu razporedijo po molekularni teži. Hitrost potovanja je odvisna od naboja molekule oziroma od jakosti električnega toka. R-PAGE izkorišča sekundarno strukturo viroida (dsRNA), ki je v naravnem stanju paličaste oblike, v denaturacijskih razmerah, ki povzročijo pretrganje vezi med komplementarnimi baznimi pari, pa nastane krožna molekula RNA. Vzorce RNA torej najprej analiziramo v gelu pod naravnimi pogoji. Ko viroidna RNA, ki v gelu potuje skupaj z ostalimi, gostiteljskimi RNA molekulami, doseže dno gela, zamenjamo obstoječi pufer s pufrom, segretim na 70C, obrnemo polarnost elektrod in tako izvedemo ponovno elektroforetsko ločitev pri denaturacijskih razmerah. Pri visoki temperaturi se notranje sparjena molekula RNA odpre, nastala cirkularna molekula RNA pa v gelu potuje počasneje od linearnih. Po barvanju gela z srebrovim nitratom lahko viroidno RNA zasledimo na gelu že, če je vsaj 5 ng viroidne RNA v črti.
- Za detekcijo viroidov je dovolj učinkovita metoda povratna elektroforeza na poliakridnem gelu (R-PAGE - return polyacrylamid gel electrophoresis). Gel pri elektroforezi deluje kot molekularno sito, skozi katerega potujejo velike molekule počasneje kot manjše in se v gelu razporedijo po molekularni teži. Hitrost potovanja je odvisna od naboja molekule oziroma od jakosti električnega toka. R-PAGE izkorišča sekundarno strukturo viroida (dsRNA), ki je v naravnem stanju paličaste oblike, v denaturacijskih razmerah, ki povzročijo pretrganje vezi med komplementarnimi baznimi pari, pa nastane krožna molekula RNA. Vzorce RNA torej najprej analiziramo v gelu pod naravnimi pogoji. Ko viroidna RNA, ki v gelu potuje skupaj z ostalimi, gostiteljskimi RNA molekulami, doseže dno gela, zamenjamo obstoječi pufer s pufrom, segretim na 70C, obrnemo polarnost elektrod in tako izvedemo ponovno elektroforetsko ločitev pri denaturacijskih razmerah. Pri visoki temperaturi se notranje sparjena molekula RNA odpre, nastala cirkularna molekula RNA pa v gelu potuje počasneje od linearnih. Po barvanju gela z srebrovim nitratom lahko viroidno RNA zasledimo na gelu že, če je vsaj 5 ng viroidne RNA v črti.
- Za detekcijo viroidov je dovolj učinkovita metoda povratna elektroforeza na poliakridnem gelu (R-PAGE - return polyacrylamid gel electrophoresis). Gel pri elektroforezi deluje kot molekularno sito, skozi katerega potujejo velike molekule počasneje kot manjše in se v gelu razporedijo po molekularni teži. Hitrost potovanja je odvisna od naboja molekule oziroma od jakosti električnega toka. R-PAGE izkorišča sekundarno strukturo viroida (dsRNA), ki je v naravnem stanju paličaste oblike, v denaturacijskih razmerah, ki povzročijo pretrganje vezi med komplementarnimi baznimi pari, pa nastane krožna molekula RNA. Vzorce RNA torej najprej analiziramo v gelu pod naravnimi pogoji. Ko viroidna RNA, ki v gelu potuje skupaj z ostalimi, gostiteljskimi RNA molekulami, doseže dno gela, zamenjamo obstoječi pufer s pufrom, segretim na 70C, obrnemo polarnost elektrod in tako izvedemo ponovno elektroforetsko ločitev pri denaturacijskih razmerah. Pri visoki temperaturi se notranje sparjena molekula RNA odpre, nastala cirkularna molekula RNA pa v gelu potuje počasneje od linearnih. Po barvanju gela z srebrovim nitratom lahko viroidno RNA zasledimo na gelu že, če je vsaj 5 ng viroidne RNA v črti.
- Za detekcijo viroidov je dovolj učinkovita metoda povratna elektroforeza na poliakridnem gelu (R-PAGE - return polyacrylamid gel electrophoresis). Gel pri elektroforezi deluje kot molekularno sito, skozi katerega potujejo velike molekule počasneje kot manjše in se v gelu razporedijo po molekularni teži. Hitrost potovanja je odvisna od naboja molekule oziroma od jakosti električnega toka. R-PAGE izkorišča sekundarno strukturo viroida (dsRNA), ki je v naravnem stanju paličaste oblike, v denaturacijskih razmerah, ki povzročijo pretrganje vezi med komplementarnimi baznimi pari, pa nastane krožna molekula RNA. Vzorce RNA torej najprej analiziramo v gelu pod naravnimi pogoji. Ko viroidna RNA, ki v gelu potuje skupaj z ostalimi, gostiteljskimi RNA molekulami, doseže dno gela, zamenjamo obstoječi pufer s pufrom, segretim na 70C, obrnemo polarnost elektrod in tako izvedemo ponovno elektroforetsko ločitev pri denaturacijskih razmerah. Pri visoki temperaturi se notranje sparjena molekula RNA odpre, nastala cirkularna molekula RNA pa v gelu potuje počasneje od linearnih. Po barvanju gela z srebrovim nitratom lahko viroidno RNA zasledimo na gelu že, če je vsaj 5 ng viroidne RNA v črti.
- Čeprav so viroidi termično stabilni, z večanjem temperature disociacirajo vodikove vezi med večina baznimi pari in sprva nastane pri 50°C petina novih baznih parov iz komplementarnih segmentov, ki so bili v naravni strukturi sicer bolj oddaljeni - običajno nastanejo kot vmesna stopnja tri stabilne dvojne vijačnice Pri višji temperaturi pa tudi te vijačnice denaturirajo in nastane popolnoma denaturirana krožna molekula, ki se lahko tudi odpre v popolnoma denaturirano linearno molekulo.