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2019年度 第2回バイオインフォマティクス実習
- 3. Tophatによるマッピング • Johns Hopkins University Center for Computational Biology • http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml • Transcriptome解析用マッピングツール Bowtie2を呼び出してマッピング スプライスジャンクションを予測する
- 4. • htseq-countコマンド htseq-count マッピング後のsamファイル名 アノテーション用gtfファイル名 ＞ 出力ファイル名 Cygwin X $htseq-count SRR3939298.sam GRCh38.gtf > SRR3939298_count.txt Htseqによるカウント計測
- 6. GSE123860_BT549_counts.txt.gz GSE123860のデータを取得 課題配布フォルダからGSE123860_BT549_counts.txtを各自のデスクトップにコピー
- 7. X > Sys.setenv(http_proxy=“http://proxy.med.yokohama-cu.ac.jp:8080”) > source(“http://bioconductor.org/biocLite.R”) > biocLite(“edgeR”) > library(edgeR) R console edgeRパッケージのインストールとロード
- 8. X > x <- read.table(“GSE123860_BT549_count.txt”, header = T, sep = “t”) > rownames(x) <- x$Gene_ID > x <- x[,-1] R console データの読み込みと整形 ファイルメニューから“ディレクトリの変更”を選択して、デスクトップに移動
- 9. X > d <- DGEList(counts = x, group = c(rep(“V”, 3), rep(“S”, 3))) > d <- calcNormFactors(d) > d <- estimateCommonDisp(d) > d <- estimateTagwiseDisp(d) > result <- exactTest(d) R console edgeR packageの実行
- 10. X > result.table <- topTags(result, nrow(x))@.Data[[1]] > result.sig <- subset(result.table, result.table$FDR < 0.05) > result.sig.up <- subset(result.sig, result.sig$logFC > 0) > result.sig.down <- subset(result.sig, result.sig$logFC < 0) > write.table(result.sig, “result.sig.txt”, quote=F, sep=“t”) > plotSmear(result) R console 結果の出力
- 11. • GO term 遺伝子の機能や構造を記述するための、生物種に非依存的な統一された用語。 • GO解析 遺伝子リストの中に特定のGOタームを持つ遺伝子が高頻度に存在しているか 判定して、その機能を推定する。 GO解析
- 12. 性質1 性質2 A群 a b B群 c d 2×2 クロス集計表 !!!!! !!!! dcban hgfe C CC p gn cfae a e f g h n … … 赤玉 20 白玉 80 10個 赤 ：4 白 ：6 取った 残り 赤 4 16 白 6 74 20 80 10010 90 p=0.0841073計100個 ある集団のある変数に出現頻度の偏りがあるか判定する方法 Fisher’s の正確確率検定
- 13. 発現変動遺伝子 GOタームAを持つ遺伝子 80 20 1480 全遺伝子 20000 発現変動遺伝子 残り GOタームAを持つ遺伝子 20 1480 その他の遺伝子 80 18420 全遺伝子 : 20000 GOタームAを持つ遺伝子 : 1500 発現変動遺伝子 : 100 1500 2000018500100 19900 p-value = 0.00004509 クロス集計表
- 14. 発現変動遺 伝子 その他 GOタームBを 持つ遺伝子 5 95 その他 95 19805 100 20000 19900 100 19900 p-value = 0.0001461 発現変動遺 伝子 その他 GOタームAを 持つ遺伝子 10 1490 その他 90 18410 1500 20000 18500 100 19900 p-value = 0.3379 全遺伝子 : 20000 GOタームBを持つ遺伝子 : 100 発現変動遺伝子 : 100 全遺伝子 : 20000 GOタームAを持つ遺伝子 : 1500 発現変動遺伝子 : 100 クロス集計表
- 16. • cytoscapeのホームページからインストーラーをダウンロード • インストールして実行 • プロクシの設定 • APPをインストール CytoscapeにAPP をインストール
- 18. cytoscape preference editorウインドウの proxy server に“proxy.med.yokohama-cu.ac.jp” proxy server port に“8080” proxy server typeに”http” を入力してModifyをクリック Proxyの設定
- 22. X > result.sig.up <- result.sig.up[order(result.sig.up$logFC, decreasing = T),] > write(as.character(rownames(result.sig.up))[1:200], “clipboard”) > result.sig.down <- result.sig.down[order(result.sig.down$logFC),] > write(as.character(rownames(result.sig.down))[1:200], “clipboard”) R console
- 23. BiNGO settingsウィンドウの Cluster Nameに適当な名前を入力 Paste Gene from Textにチェック 入力欄に遺伝子名を入力 生物種を選択 Start BiNGOをクリック BiNGOの実行
- 24. • 特定の遺伝子セットと発現比の間に相関があるか調べる 24 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) KO/WT gene set {Otx2,Msx1,Rbp1,…} 発現比ランキングの 上位に偏って存在する 遺伝子セットと発現に相関あり 発現比ランキングの下位に偏って存在する 遺伝子セットと発現に逆相関あり 発現比ランキングによる偏り無し 遺伝子セットと発現に相関なし
- 27. • 課題配布フォルダからgsea-3.0.jarを各自のデスクトップにコピー • gsea-3.0.jarをダブルクリック 27 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
- 28. 28 GSEA
- 29. • 必要なファイルは3つ • 発現プロファイル gctファイル • 遺伝子セット grpファイル • カテゴリー clsファイル 29 データのロード
- 30. #1.2 21530 6 NAME Description V1 V2 V3 S1 S2 S3 Ctss NA 1730.1 1681.1 1653.2 10.5 10.9 13.2 Ahnak NA 1650.3 1510.1 1701.3 14.2 15.1 11.3 … … … … … … 遺伝子数 サンプル数 遺伝子名 大文字、小文字の区別に注意 常に必要 常に必要 ファイル名の拡張子はgct 30 gctのファイル：発現プロファイル
- 32. #gene symbol Evi1 Myct1 … grpファイル 遺伝子名の羅列 gctファイルと大文字、小文字を一致させる ファイル名の拡張子はgrp clsファイル 6 2 1 #V S V V V S S S サンプル数 クラス数 常に必要 clsファイルはスペース区切りのテキストファイル 拡張子はcls 32 grpファイル：gene set clsファイル：カテゴリーの記述
- 33. • 課題配布フォルダから • GSE123860_BT549_GSEA.gct • GSE123860_BT549.cls • 各ファイルを各自のデスクトップフォルダへコピー 33
- 37. enrichment result in htmlをクリック 37 結果の表示
- 41. • バイオインフォマティクスフォーラム https://163.212.171.228/bioinformaticsforum バイオインフォマティクス実習に関する質問、バイオインフォマティクス全般に関する質問など投稿し てください。 • 実習の資料について 「先端研 バイオインフォマティクス解析室」ホームページにslide shareのURLを掲載しています。 https://www.yokohama-cu.ac.jp/amedrc/section/support/bioinfomatics2.html 2018年度以前のパスワード：bijishu 2019年度のパスワード：実習後にお知らせします。 • アンケートにご協力ください。 「先端研 バイオインフォマティクス解析室」ホームページまたは QRコードにアクセスし回答ください。 https://www.yokohama-cu.ac.jp/amedrc/section/support/bioinfomatics2.html お知らせ