Karaciğer Fibrozisinde Gallik asit uygulamasının etkisi

1. Gallik Asitin Hepatik Stellat
Hücrelerindeki Antifibrotik
Etkisinin İn Vitro & İn Vivo
Olarak İncelenmesi
Danışman: Prof. Dr. Alpaslan GÖKÇİMEN
Hande Nesrin ÇETİN
Histoloji ve Embriyoloji ABD

2. Gallik Asitin Hepatik Stellat Hücrelerindeki Antifibrotik Etkisinin İn Vitro & İn
Vivo Olarak İncelenmesi

3. Abstract
• HSC-T6 hücre hattına ve
primer hepatosit hücre
kültürüne uygulanmıştır.
Tiyoasetamid indüklü Karaciğer
Fibrozisi oluşturulan Sprague Dawley
Sıçanlara uygulanmıştır.
Gallik Asitin (GA) Hepatik Hücrelere Etkisi

4. AMAÇ
Proliferasyon
/aktivasyon
Morfolojisi
apoptozis
Gallik asit uygulamasının HSCs ve
hepatositler üzerindeki etkisinin
araştırılmasıdır.

5. Hasarlı bölgeye göç eden inflamatuar
hücreler çeşitli sitokinler salğılarlar:
TGFβ1
PDGF
CTGF
VEGFα
TNF α
+ ROS Aktifleşmiş Fibroblastlar
Miyofibroblastlar
Yara Onarım Süreci
Kronik Hasar/Yaralanma
Aşırı ECM
sentezi
FİBROZİS

6. GİRİŞ
•Kronik hepatit,
•Otoimmün hastalıklar,
•Alkol tüketimi
•NASH gibi kronik hasara
yanıt olarak verilen aşırı
uyarılmış yara onarım
cevabıdır.
KARACİĞER FİBROZİSİ

8. Giriş
• Hepatik fibrozis tedavisinde
antifibrotik ilaç geliştirilmesinde klinik
bir başarı sağlanmamıştır.
•Fibrozis tedavisinde yüksek biyolojik
aktiviteye sahip bileşenler içermesi
ve daha az yan etkisi olması
sebebiyle doğal ürünlere yönelim
artmıştır.

9. • GA(3,4,5-trihidroksibenzoik asit)
Anti-
inflamatuar
Antikanser Antioksidan
•CCl4 indüklü karaciğer hasarına karşı
koruyucu etkisi,
•tümör hücrelerinde apoptozu
indükleyici etkisi belirlenmiştir.
Punica granatum L.
Nar kabukları ve
meyvesi yüksek
miktarda Gallik asit
içermektedir.

10. Materyal Metod
Primer Hepatosit İzolasyonu-Kültürü
portal kolajenaz perfüzyonu ile taze izole edilen hücreler
DMEM +%10 FBS 100U/ml penisislin 100ug/ml streptomisin 37C
HSC-T6 Hücre Hattı Kültürü
DMEM +%10 FBS 100U/ml penisislin 100ug/ml streptomisin 37C
Gallik Asit İzolasyonu
Nar kabukları+Metanol=Homojenizasyon -Filtrasyon

11. HSCs Aktiasyon Analizi
aSMA ekspresyonu ölçümü ile değerlendirilmiştir.
HSC Proliferasyon/Morfoloji ve Hepatosit Sitotoksitite Analizi
(0-300ug/ml) gallik asit 24 h ve 48 h süresince uygulanmıştır.(MTT analizi)

12. • I. Grup= Kontrol
• II.Grup=TAA-Fibrotik
• III.Grup=TAA-silymarin
• IV. Grup=TAA-GA
TAA 200mg/kg 12 hafta x2 i.p.
32 Sprague Dawley Sıçan n=8
TAA 200mg/kg 12 hafta x2 ip.
TAA 200mg/kg 12 hafta x2 i.p.
5 hafta sonra 50mg/kg silymarin gavaj
5 hafta sonra 50mg/kg GA oral gavaj
Materyal-Metod
Karaciğer Fibrozisi Oluşturma Deney Tasarımı
200mg/kg SF

13. • 12. haftanın
sonunda anestezi
altında deney
hayvanları disekte
edilmiştir.
Biyokimyasal Analizler
GSH, MDA analizi, ALT/AST Ölçümü
KARACİĞER
%10 luk formole alınarak
Histopatolojik ve İHC inceleme
-80C fibrotik ve oksidatif stres
belirteçleri ölçümü
Kan örnekleri toplanmıştır.
Serum ALT/AST seviyelerinin ölçümü

14. Sonuçlar
• GA in HSCs proliferasyonu, morfolojisi ve hepatosit canlılığına etkisi
0-300ug/ml GA
HSCs etkisi (A)
0-300ug/ml GA
Hepatositlere etkisi (B)
IC50 24 h için=
45ug/ml 48 h
için=19ug/ml
GA toksisitesi HSCs lere özgüdür.
Hepatositlere yüksek dozda verilen
(300ug/ml) GA uygulaması hücre
canlılığını etkilememiştir.

15. • HSCs
iğsi+sitoplazmasında
birçok yağ damlası
içermektedir. FigA
Faz kontras mikroskop x400
kontrol
20ug/ml 48h GA
uygulaması
GA Uygulamasının HSCs Morfolojisine Etkisi
•HSCs sişkinlik ve
parçalanma FigB
a-SMA

16. GA Karaciğer Fonksiyonlarına & HepatiK Oksidatif Strese Etkisi
ANOVA test - farklılıklar p<0.05 olduğunda anlamlı kabul edilmiştir.

17. GA karaciğer fibrozis belirteçleri ve HP içeriğine etkisi
silymarin TGF-β1 seviyesini düşürürken GA
normalize etmiştir.

18. GA karaciğer fibrozis belirteçleri ve HP içeriğine etkisi

19. Gallik Asitin Karaciğer Histolojisine Etkisi
• Yapılan pilot çalışmada GA in toksik etkisi olmadığı belirlenmiştir. (n=6)
• 50mg/kg GA gavaj/ 8haftax2
HE a-SMA
X400
Siyah ok=safra kanalı
Kırmızı ok=kan damarı
X400
Safra kanalı çevresindeki ve damar
duvarındaki fibroblastlar pozitif
boyanmıştır

20. sentrolobüler nekrozis
hepatik lobüllerin etrafında(periportal
alanlarda) kolajen fiberleri birikimi
kalın fibröz septumlar S4 Fibrozis
Normal lobüler yapı
Normal hepatik kordonlar
Normal sentral ven
Lobüler yapıda iyileşme
kolajen fibril birikiminde azalma
gözlenmiştir.
 Daha ince fibröz bantlar
gözlenmektedir. S2 fibrozis
x200

21. kolajen birikiminde silimarin
uygulanan gruba kıyasla anlamlı
p<.05 azalma gözlenmiştir.
S1fibrozis
sentrolobüler nekrozis
hepatik lobüllerin etrafında(periportal
alanlarda) kolajen fiberleri birikimi
kalın fibröz septumlar S4 Fibrozis
Lobüler yapıda iyileşme
kolajen fibril birikiminde azalma
gözlenmiştir.
 Daha ince fibröz bantlar
gözlenmektedir. S2 fibrozis
x200

22. GA HSCs Aktivasyonunu Engellemedeki
Etkisi
HSCs aktivasyonu tayini için a-SMA
antikoru ile İHC yapılmıştır.
Sadece kan damarlarındaki
hepatik vasküler düz kas hücreleri
tarafından sentez edilmektedir.
Periportal alanda, lobül
içerisinde eksp. Artmıştır.
a-SMA eksp.
azalma
a-SMA eksp.
azalma
x200

23. GA Apoptozisi İndüklemedeki
Etkisi
NormalTAASilymarinGA
Apoptotik hücreler
caspase-3 antikoru ile pozitif
boyanmıştır.
Az sayıda
Orta derece
yükselme
Fibrotik gruba
kıyaslı anlamlı artış
Fibrotik gruba
kıyaslı anlamlı artış
x400

24. GA Hepatosit Proliferasyonuna Etkisi
NormalTAASilymarinGA
x400
PCNA (proliferating cellular nuclear
antigen) antikoru ile İHC yapılmıştır.
Pozitif boyanan hc
sayısında artış
Pozitif boyanan hc
sayısında azalma
Pozitif boyanan hc
sayısında azalma
Nadir Pozitif
Boyanma

25. Sonuç
• Gallik asitin antifibrotik etkisi
in vitro
HSCs proliferasyon ve
aktivasyonunun inhibisyonu
Sessiz qHSC morfolojisini yeniden
kazanım (a-SMA ekspresyonu azalımı morfoloji
değişimi ilişkili olabilir)
in vivo
HSCs aktivasyonunu, proliferasyonunu
baskılar.
Hasarlı hepatositlerin apoptozisi artar.
Hepatik fibrozis için geliştirilen antifibrotik tedavilerin major hedefi HSCs
aktivasyonu,proliferasyonunu baskılamak ve apoptozisini indüklemektir.

26. • Dinlediğiniz için teşekkür ederim…