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Presentazione I anno Federica Campana

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  • Poiché la struttura lipidica della membrana regola le interazioni con le proteine G, ho studiato gli effetti di PA, MA e GG sulla struttura dei lipidi di membrana e sull’interazione delle proteine G con membrane modello. Partendo dal presupposto che ogni proteina G può contemporaneamente legare una molecola di MA, PA e GG, è concepibile pensare che molti lipidi ad esse associati possono trovarsi in microdomini di membrana ricchi di GPCR. Questi lipidi regolano pertanto le proprietà biofisiche delle membrane, che a loro volta modulano l'interazione e l'attività delle proteine G.
  • Le membrane cellulari sono strutture estremamente complesse costituite da centinaia di molecole di diversa natura. Lo stato fisico, determinato dalla loro composizione, dalla temperatura e dalle condizioni esterne, interviene nel regolare l’attività di tutte le proteine che vi sono immerse e, conseguentemente, anche l’espressione di alcuni geni coinvolti nelle risposte da stress. Le membrane lipidiche partecipano pertanto al “signaling” cellulare, regolando in questo modo importanti funzioni. All’interno di questo"mare" lipidico sono immerse le proteine, distinte in due categorie principali in base alle caratteristiche della loro collocazione nella membrana: proteine integrali e periferiche.
  • I G Protein Coupled Receptor (GPCR) sono proteine di membrana con sette domini transmembrana e probabilmente sono la superfamiglia di proteine più eterogenea e una delle più rappresentate nel proteoma umano. I GPCR interagiscono con proteine G eterotrimeriche (cioè costituite da 3 diverse subunità chiamate α, β e γ). Le proteine G, che sono ancorate alla membrana, devono il loro nome al fatto che sono GTPasi, legano cioè GTP nella forma attiva e lo idrolizzano a GDP inattivandosi. Quando la molecola che porta l’informazione (ligando) lega il GPCR, viene promosso lo scambio di GDP con GTP nella subunità α della proteina G attivandola e permettendone l'interazione con un effettore (quale fosfolipasi C, canali ionici, guanilato ciclasi o adenilato ciclasi), spesso collocati in differenti domini di membrana, come i lipid raft. Dall’altro lato il dimero G  rimane in prossimità del recettore per reclutare GRK (che fosforila e inattiva GPCR) o per regolare altre proteine di segnalazione. Dopo un certo periodo di tempo, la molecola di GTP si idrolizza in GDP, inattivando la subunità α che può nuovamente ricongiungersi col complesso βγ. Il sistema, quindi, è organizzato in modo tale da auto-spegnersi dopo un certo periodo di tempo. La trasduzione del segnale mediata da GPCR attiva una vera e propria cascata di conduzione del segnale: è anche per questo che bastano bassissime concentrazioni di ligando per avere una risposta dall'organismo. Infatti una sola molecola di ligando (messaggero primario) lega un GPCR, che è in grado di attivare molte proteine G, ognuna delle quali, interagendo con opportuni effettori, porterà alla produzione di numerosi messaggeri secondari con una notevole amplificazione del segnale. Pertanto si possono trovare molte migliaia di proteine G nelle regioni di membrana ad alta densità di GPCR. In tali siti le interazioni proteina-lipide e lipide-lipide definiscono la struttura della membrana, il tipo di proteine che si posso trovare, l'attività dei GPCR e le relative proteine di segnalazione. Vari ligandi utilizzano i GPCR per stimolare dei target di membrana, citoplasmatici e nucleari. Il GPCR interagisce con le proteine G eterotrimeriche composte da….e che sono legate al GDP nello stato inattivo. Il legame all’agonista porta ad un cambio conformazionale nel recettore, che catalizza la dissociazione dalla subunità seguito da legame del GTP alla proteina G e dalla dissociazione di G in subunità. Le subunità delle proteine G sono divise in quattro grandi famiglie: G s , G i , G q e G 12 , e un singolo GPCR può legarsi a una o più famiglie di proteine G. ogni proteina G attiva alcuni effettori a valle. Generalmente la G s stimola l’adenilato ciclasi e aumenta I livelli di cAMP, mentre G i inibisce l’adenilato ciclasi e abbassa i livelli di cAMP, mentre i membri della famiglia G q attivano la PLC, che separa il PIP 2 in DAG e IP 3 . Le subunità Gb e Gg funzionano come un dimero per attivare molte molecole deputate al signaling, inclusa la fosfolipasi, I canali ionici e le chinasi lipidiche. as a dimer to activate many signalling molecules, including phospholipases, ion channels and lipid kinases. Lo spostamento di ogni subunità verso il giusto intorno lipidico dipende in gran parte dalla preferenza per alcuni lipidi, o strutture lipidiche, anche se ad oggi sono disponibili poche informazioni sulle interazioni proteina G - membrana. Come già detto, i GPCR sono raggruppati in regioni di membrana ben definite, dove le proteine G eterotrimeriche co-localizzano in eccesso molare. In queste regioni le proteine G interagiscono con lo strato citosolico della membrana plasmatica, aiutate da frazioni di MA e PA legate alla subunità G  e da frazioni di GG della subunità G  . L'effetto di questi lipidi sul bilayer, dovuto alla loro influenza sulla struttura fosfolipidica, non è stato ancora studiato.
  • Alcune proteine contengono delle molecole lipidiche legate in maniera covalente alla catena peptidica: esse sono utilizzate come ancore per inserirsi all’interno della membrana cellulare. Queste molecole comprendono: acidi grassi, palmitico (PA) e miristico (MA), isoprenoidi (farnesolo e geranilgeraniolo, GG) e glicosilfosfatidilinositolo (GPI, molecola complessa formata da fosfatidilinositolo e oligosaccaridi). Le proteine palmitoilate e miristoilate e quelle GPI-legate si distribuiscono di preferenza nei raft, in quanto le loro catene lipidiche sature hanno una conformazione particolarmente adatta ad essere accolta nei domini lipidici allo stato liquido-ordinato. Al contrario, le proteine isoprenilate, che hanno catene lipidiche ramificate e voluminose, non idonee per i domini allo stato liquido-ordinato, si distribuiscono di preferenza nelle regioni della membrana più fluide (stato liquido-cristallino).
  • La prima cosa di cui mi sono occupata è stata la realizzazione di membrane modello con composizione lipidica controllata, validate sulla base di parametri trovati in letteratura. In particolare si tratta di membrane sia pure, costituite cioè da un unico componente, che miste (da due a più componenti). La caratterizzazione e il controllo sono avvenuti in termini di area superficiale molecolare, spessore del bilayer, spessore delle code carboniose appartenenti ai fosfolipidi, lateral stress profile, density profile, energy evolution, order parameter, membrane physical state etc.
  • Una volta terminata la costruzione di tali membrane, mi sono occupata dello studio dell’interazione degli acidi grassi sopra citati con alcune di queste membrane, utilizzando una particolare tecnica di dinamica molecolare: la Steered molecular dynamics (SMD). La SMD permette di esplorare i processi biologici su scale di tempo accessibili alle simulazioni di dinamica molecolare. Per fare ciò vengono applicate al sistema forze esterne tempo-dipendenti e vengono poi analizzate le risposte del sistema stesso. Il tempo richiesto per l’incorporazione delle molecole considerate all’interno delle membrane è dell’ordine dei microsecondi. Poiché questo tempo preclude la possibilità di una completa investigazione con la dinamica molecolare convenzionale, la SMD è stato un utile mezzo per ottenere utili informazioni.
  • Le energie di binding di GG, MA e PA con le membrane di PC e PC-PE sono state calcolate dopo che l’inserzione degli acidi era completata. A questo proposito, le energie di legame delle ultime 30 strutture sono state calcolate e mediate rispetto al tempo. Le energie di binding di GG sulle membrane di PC e PC-PE (fig. 1) sono molto simili e hanno mostrato un lieve aumento durante la penetrazione delle membrane. Esse sono più basse di quelle di MA e PA con entrambi i tipi di membrana: molto probabilmente ciò è dovuto alla natura ramificata dell’isoprenoide. PA ha mostrato una marcata e significativa preferenza per le membrane affini alla fase lamellare, ricche cioè di PC (fig. 1). Ma ha mostrato uno sviluppo simile, non essendo molto marcata la differenza di energia di binding tra le membrane PC e PC-PE. Per questo MA, e in particolar modo PA, hanno mostrato una forte preferenza per i domini di membrana ricchi di PC: da ciò ne scaturisce che essi possono essere coinvolti nella segregazione della proteina G nelle differenti regioni della membrana. Quindi i lipidi legati alle proteine G regolano il signaling cellulare in modo bimodale, cioè attraverso il loro effetto sulla struttura della membrana e la loro preferenza per definiti intorni lipidici.
  • Il lateral stress profile è stato calcolato registrando la posizione e l’accelerazione di tutti gli atomi nelle membrane. Se da un lato l’inserzione di una molecola di MA, PA o GG provoca una netta riduzione del valore della pressione laterale, sia nelle membrane di PC che di PC-PE, nella zona interna (idrofobica) della membrana stessa (fig.2), dall’altro lato la pressione a livello dell’interfaccia acqua-lipidi non viene alterata in maniera marcata. In più l’effetto di MA, PA e GG sulle membrane di PC è maggiore di quello avuto sulle membrane PC-PE, anche se GG provoca un effetto maggiore rispetto agli acidi grassi sulle membrane di PC: probabilmente ciò è dovuto al maggiore volume dell’isoprenoide e al più stretto impaccamento della membrana di PC.
  • Quindi è possibile concludere dicendo che MA e PA legano membrane ricche di fosfatidilcolina (PC) in maniera più forte di GG, anche se quest'ultimo riduce maggiormente la pressione laterale delle membrane PC rispetto agli altri acidi grassi. Tutto ciò non fa altro che confermare il fatto che: 1) le proteine Gαβγ e Gβγ preferiscono intorni lipidici propensi alla fase non-lamellare, il che può in parte spiegare il fatto che le proteine G si accumulano in zone ricche di GPCR, i cui domini transmembrana aumentano la propensione alla fase non-lamellare; 2) le subunità Gα preferiscono legare regioni della membrana propense alla fase lamellare, come i lipid raft, dando una spiegazione ragionale alla loro migrazione dal recettore ai domini effettori di membrana. Questi risultati dimostrano che modificazioni dei lipidi legati alle proteine G regolano la struttura delle membrane e ne influenzano le proprietà fisico-chimiche dei microdomini, il che in parte spiega le basi molecolari alla base dello smistamento delle subunità della proteina G nella membrana plasmatica.
  • In seguito a stress dovuti all’aumento di temperatura, vengono generati diversi mediatori lipidici dai pathway della fosfolipasi C, diacilglicerolo lipasi e monoacilglicerolo lipasi. Il riarrangiamento specifico dei microdomini di membrana (raft) potrebbe aiutare il funzionamento della piattaforma dello stress signaling. I composti interagenti con i lipidi di membrana modulano l’espressione di Hsp senza indurre l’unfolding delle proteine. Il Bimoclomol, un co-induttore di Hsp interagente con la membrana, prolunga l’attivazione dell’integratore della risposta da stress, l’heat shock factor-1 (HSF1). HSF1 è soggetto a complesse modificazioni post-traslazionali come l’acetilazione, la fosforilazione e la sumoilazione. L’attivazione prolungata di HSF1 è mediata dalla deacetilasi SIRT1. Obiettivi: avere una visione del meccanismo della modulazione della fase lipidica dovuto al co-induttore BGP15, un miglioramento del Bimoclomol. Mediante studi di dinamica molecolare (MD) ho analizzato il binding, la permeazione e l’accumulo di molecole biologiche rilevanti sulle membrane cellulari. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare il legame alla membrana e il comportamento di ripartizione su modelli di membrana di sfingomielina (SM)-colesterolo (CHOL).
  • Mediante studi di dinamica molecolare (MD) ho analizzato il binding, la permeazione e l’accumulo di molecole biologiche rilevanti sulle membrane cellulari. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare il legame alla membrana e il comportamento di ripartizione su modelli di memnbrana di sfingomielina (SM)-colesterolo (CHOL). I sistemi studiati consistono di membrane asimmetriche fatte di sfingomielina e colesterolo con il BGP-15 a differenti valori di pH o senza BGP-15 (controllo). Come modello di membrana è stato utilizzato un bilayer all-atom il cui strato interno è costituito da 22 molecole di SM e 14 di CHOL, mentre lo strato esterno è formato da 17 molecole di SM e 19 di CHOL. Sullo strato interno sono state aggiunte 4 molecole di BGP-15, mentre sul lato esterno ne sono state aggiunte 6. Le simulazioni sono state effettuate a differenti valori di pH (7 e 10), bilanciando le cariche con l’aggiunta di ioni Na + e Cl - . Le dimensioni del box di simulazione sono X=94.84Å, Y=42.22Å e Z=42.02 Å. Sono state aggiunte 3060 molecole di acqua per raggiungere la densità di 0.997g/mL Per studiare la distribuzione e la posizione favorevole del BGP-15 sulla membrana lipidica, ho applicato simulazioni MD atomistiche senza vincoli, basate sulla distribuzione passiva delle molecole sonda lo strato d’acqua e il doppio strato SM-CHOL. Le 10 molecole di BGP-15 sono state disposte in maniera e orientamento casuali, all’interno dello strato acquoso, a una distanza di 5-8Å dalla superficie del doppio strato. Il sistema è stato equilibrato in condizioni NPT per 1 ns. Il sistema di SM-CHOL-BGP-15-acqua è stato monitorato durante tutta la simulazione in termini di parametri strutturali e fisici.
  • La localizzazione del BGP-15 e di qualsiasi altra molecola o atomo può essere facilmente definita mediando nello spazio la frequenza della molecola/atomo d’interesse. Figura 4 – Profilo di densità della membrana SM-CHOL sovrapposto all’immagine del bilayer. Nella figura sono mostrati il profilo di densità dell’acqua (linea azzurra), del colesterolo (verde) e della sfingomielina (blu). Per migliorare la visualizzazione, la densità dell’acqua è stata scalata di un fattore pari a 5. la distribuzione è mediata per l’ultimo ns della simulazione MD. Per una maggiore chiarezza di visualizzazione, all’immagine del bilayer è stata sovrapposta quella del profilo di densità. I profili di densità permettono di monitorare facilmente la posizione di ogni molecola durante la simulazione.
  • Nella figura sono mostrati il profile di densità iniziale e dopo 5 ns di simulazione. Per semplicità sono mostrate solo 3 curve: i lipidi totali, l’acqua e il BGP-15 colorato in verde. Poiché il bilayer non è simmetrico, si può osservare che il BGP-15 tende ad essere assorbito in maniera preferenziale dove il rapporto SM-CHOL è vicino a 1 (sulla destra del diagramma). L’asimmetria della membrana è più chiara ancora nella figura 6, dove i componenti Sm e CHOL sono rispettivamente raffigurati in blu e verde scuro.
  • Questo effetto può essere apprezzato ulteriormente monitorando l’allineamento delle molecole di SM (parametro d’ordine). Nella figura è calcolato l’ordine per 5 ns per ogni strato della membrana SM-CHOL. Poiché la composizione dei due strati è differente, ci sono sei plot. In tutte e tre le simulazioni l’ordine della SM è più basso nello strato con composizione di SM-CHOL in rapporto di 1:1 (strato esterno).la presenza di BGP-15 sulle teste di SM aumenta l’ordine. Il BGP-15 non altera nè l’organizzazione interna del colesterolo né il profilo di pressione in maniera significativa. Questo può essere un effetto visibile solo ad alte concentrazioni.
  • BGP-15 è una molecola attiva su membrana capace di riconoscere spontaneamente e di inserirsi nei domini SM-CHOL. Il BGP-15 non attraversa la membrana ma rimane vicino alla superficie a una distanza di 2-5 Å dall’ossigeno della sfingomielina e di 5-8 Å dallo strato acquoso. L’ipotesi immediata che il BGP-15 in forma neutra possa attraversare la membrana e raggiungere la parte più idrofobica che rappresenta il centro della membrana non sembra corretta. Probabilmente la presenza di molecole grandi e aromatiche al centro della membrana forzerebbe le catene aciliche dei lipidi ad adattarsi attorno al BGP-15. Questo ridurrebbe la mobilità della parte terminale delle catene (è stato osservato un leggero aumento della mobilità nella parte terminale delle catene visibile in fig. 8) e conseguentemente ridurrebbe l’entropia della membrana, che è altamente sfavorevole. Il BGP-15 induce un aumento dello spessore del bilayer e un migliore allineamento dei lipidi (fig. 10-11). È da notare la capacità del BGP-15 di discriminare tra le membrane di SM-CHOL con differente composizione. L’analisi del profilo di densità indica che la membrana SM-CHOL con una composizione di 1:1 sono più capaci di incorporare le molecole di BGP-15 (più rigide) rispetto a quella con una composizione non bilanciata. Il BGP-15 induce anche un aumento del disordine nella parte terminale delle catene. Le ultime due osservazioni sono in accordo con una possibile interazione favorevole tra il BGP-15 e le molecole di CHOL.

Transcript

  • 1.
        • Tutor: Dottoranda:
        • Prof. Stefano Piotto Piotto Federica Campana
        • Co-Tutor esterno:
        • Prof. Pablo V. Escribá
        • Department of Biology, University of the Balearic Islands
        • Spain
    Università degli Studi di Salerno Dottorato di Ricerca in Scienza e Tecnologie per l’Industria Chimica, Farmaceutica e Alimentare XI CICLO Studio di interazione di molecole attive su membrane cellulari mediante tecniche bioinformatiche e di dinamica molecolare
  • 2. Outline:
    • Objectives
    • The cell membrane
    • Project development
        • Role of protein lipidation in membrane anchoring
        • Mechanism of interaction of BGP-15 on membranes
    • Results
    • Conclusions
  • 3. Objectives:
    • Verify the capability of palmitic acid (PA), myristic acid (MA) and geranylgeraniol (GG) to discriminate different lipid rafts.
    • Study the effect of these lipids on membrane structure and G protein-membrane interactions.
    • Study the effect of some potent antitumoral molecules on membrane internal structure.
  • 4. The cell membrane:
  • 5. Dorsam and Gutkind Nature Reviews Cancer 7 , 79 – 94 (February 2007) | doi:10.1038/nrc2069
  • 6. Membrane anchored proteins: Myristic acid Palmitic acid G eranylgeraniol
  • 7. Model membranes:
    • NPT conditions
    • 310K
    • P = 1 atm.
    • Force field = AMBER03.
    • Cutoff = 7.86 Å.
    • Time step = 1.25 fs for intramolecular forces and 2.5 fs for intermolecular forces
    • Simulation time = 2ns
  • 8. Steered molecular dynamics (SMD): from
  • 9. Analysis: binding energy “ Effect of g protein lipids on membrane structure and g protein-membrane interactions” Jesús Casas 1 , Rafael Álvarez 1 , Silvia Terés 1 , Victoria Lladó 1 , Federica Campana 2 , Stefano P. Piotto 2 , and Pablo V. Escribá 1 1 Laboratory of Molecular Cell Biomedicine, Department of Biology, IUNICS, University of the Balearic Islands, E-07122 Palma de Mallorca, Spain. 2 Department of Pharmaceutical Sciences, University of Salerno, Via Ponte don Melillo, 84084 Fisciano (SA), Italy Submitted to the Biochemical Journal.
  • 10. Analysis: lateral pressure profile
  • 11. Conclusions (part I):
    • MA and PA interact strongly with PC membranes than GG.
    • The addition of GG decreases drastically the lateral pressure of POPC membranes than other fatty acids: this is possibly due to the greater volume of the isoprenoid and the tight packing of the GG-free PC membrane.
    • GG increases markedly the non-lamellar phase propensity.
    • G βγ and G αβγ prefer non-lamellar prone regions and G α lamellar membranes.
    • The regulatory effect of GG on the membrane may explain its influence on the binding of G proteins.
  • 12. BGP-15:
    • Preservation of the chemical architecture of a cell or of an organism under stressful conditions is termed homeostasis.
    • One of the best known mechanisms protecting cells from various stresses is the heat-shock response, which results in the induction of the synthesis of heat-shock proteins (HSPs or stress proteins).
    • BGP-15, interacting with lipid bilayers, promotes the formation of chaperone molecules in eukaryotic cells and induces the expression of heat-shock genes. 
  • 13. Simulation parameters:
    • Two asymmetric membranes made of sphingomyelin (SM) and cholesterol (CHOL) with BGP-15 at different pH values or without BGP-15 (control).
    • Inner leaflet composition:
      • 4 BGP-15
      • 22 SM
      • 14 CHOL
    • Outer leaflet composition:
      • 6 BGP-15
      • 17 SM
      • 19 CHOL
    • NPT conditions
    • 298K
    • P= 1 atm.
    • Force field = AMBER03.
    • Cutoff = 7.86 Å.
    • Time step = 1.25 fs for intramolecular forces and 2.5 fs for intermolecular forces
    • Simulation time = 5ns
  • 14. Density profile (1): Density profiles permit easily to monitor the position of any molecule during the simulation. In the figure are shown the density distribution of water (cyan line), cholesterol (green) and sphingomyelin OSF (blue).
  • 15. Density profile (2): In the figures are shown the initial densities distribution (on the left) and the situation after 5 ns (on the right). Since the bilayer was not symmetric, one can observe that BGP-15 tends to be preferentially absorbed where the ratio SM-CHOL is close to one (on the right of the diagram). (a) (b)
  • 16. Density profile (3): Density distribution for 12 atom types at t=0 (a) and after 5ns (b). The uptake of BGP-15 induce a swelling and an increase of disorder in the terminal carbons. (a) (b)
  • 17. Order parameter: BGP-15 enter the membrane without penetrating in the hydrophic core. The presence of BGP-15 among the SM headgroups increases the ordering. BGP-15 do not alter the internal organization of cholesterol and do not significantly alter the pressure profile.
  • 18. Conclusions (part II):
    • BGP-15 is a membrane active molecule capable to spontaneously recognize and insert SM-CHOL domains.
    • Density profile analysis indicate SM-CHOL layer with lipid ratio 1:1 to be more capable to incorporate BGP-15 molecules (more rigid) than SM-CHOL layer with unbalanced composition.
    • BGP-15 is also inducing more disorder in the chain ends. The last two observation are in agreement with a favorable interaction among BGP-15 and cholesterol molecules.