1. Статус гена TP53 у больных
диффузной В-крупноклеточной лимфомой
Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Воевода М.И.,
Максимов В.Н., Агеева Т.А.
ФГНБУ НИИ терапии и профилактической медицины,
ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России
Санкт-Петербург - 2016
2. АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
В настоящее время отсутствует комплексное описание изменчивости гена ТР53 при
диффузной В-крупноклеточной лимфоме (ДВККЛ).
Возможные молекулярные механизмы, на уровне молекулы ДНК приводящие к
дефициту ТР53, представлены в таблице 1.
Тип изменения Эффект
Мутации в кодирующей последовательности гена Потеря опухоль-супрессорных функций или
приобретение про-онкогенных свойств
Мутации в интронных последовательностях Нарушение альтернативного сплайсинга м-РНК
Мутации в 5/ и 3/-некодирующих
последовательностях
Снижение эффективности трансляции белка,
нарушение посттрансляционных модификаций
Потеря гетерозиготности Создание аллельного дисбаланса,
фенотипическая манифестация рецессивных
мутаций
Метилирование промотора Снижение экспрессии, вплоть до «выключения»
гена
Генетический полиморфизм Дефицит функции или стабильности белка
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Описать частоту гиперметилирования и потери гетерозиготности, а также
частоту, спектр и функциональную значимость мутаций в кодирующих и интронных
участках гена ТР53 у больных ДВККЛ г. Новосибирска.
Таблица 1
3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Группу обследования составили 74 пациента с ДВККЛ.
Геномная ДНК выделена из парафиновых блоков, срезы которых содержали не менее
80-90% опухолевых клеток.
Методом прямого секвенирования по Сэнгеру выполнен анализ кодирующей
последовательности гена ТР53 и примыкающих участков интронов, согласно IARC
protocol (2010 update). Прескрининг мутаций не проводился.
Анализ статуса метилирования промотора гена ТР53 проводился методом метил-
специфической ПЦР на бисульфит-конвертированной ДНК (рис. 1).
Оценка потери гетерозиготности в гене ТР53 проводилась по микросателлитному
локусу D17S796 методом ПЦР (рис. 2).
М НМ М НМ М НМ М НМ М НМ М
НМ
1 2 3 К 4 5
Рис. 1. Результаты метил-специфической ПЦР
М – ПЦР с праймерами, специфичными к метилир.
аллелю (166 п.н.),
НМ – ПЦР с праймерами, специфичными к неметил.
аллелю (170 п.н.).
1, 2, 4 – норма; 3, 5 – метилирование;
К – контрольные ДНК.
Рис. 2. Анализ микросателлитной нестабильности
в локусе D17S796 (144-174 п.н.)
К – ДНК крови,
О – ДНК опухолевой ткани.
К О К О К О
1 2 3
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Распределение мутаций, выявленных в группе обследования
3%
6%
3%
37%
33%
18%
сплайсинг
интронные
миссенс
сайлент
нонсенс
сдвиг рамки
Примечание: # - мутации, встреченные в группе обследования дважды
Гетерозигота по p.R213* Гомозигота по p.T155I Гетерозигота по IVS6-36G>C
Тип мутации
5. Тип замены
нуклеотида
Частота при ДВККЛ (%)
Значение
рВыборка
больных
IARC TP53
mutation
database
GC>AT в CpG 15,6 26
>0,05
GC>AT 34,4 25
GC>CG 3,1 8
GC>TA 9,4 10
AT>GC 12,5 13
AT>CG 12,5 5
AT>TA 12,5 8
Сравнение спектра выявленных мутаций
Множественные мутации в гене
ТР53 имели 4 пациента (6,8%).
«Hot-spot»
мутации в
выборке
«Hot-spot»
кодоны в IARC
TP53 mutation
database
p.W146R 248, 273, 175,
245, 281, 244,
305, 249 и 297
p.T155I
p.V272E
p.R213*
Гомозигота по p.A189Pfs
А - АК последовательность белка в норме,
В - АК последовательность белка при p.A189Pfs.
Сдвиг рамки считывания и формирование стоп-кодона
в результате p.A189Рfs в гене ТР53
6. Мутация
Биоинформационный прогноз Активность белка р53 в
экспериментах in vitro
(по данным литературы)PolyРhen-2 SIFT Mut_ass
p.L130F Probably damaging Deleterious High Не активен
p.W146R Benign Neutral Low Незначительно снижена
p.T155I Possibly damaging Deleterious Medium Не активен
p.R156C Benign Neutral Low Гиперактивен
p.R196Q Probably damaging Deleterious High Не активен
p.G244S Probably damaging Deleterious Medium Не активен
p.V272E Probably damaging Deleterious High Не активен
p.A276V Probably damaging Deleterious Medium Не активен
p.G293R Benign Neutral Medium Незначительно снижена
Функциональный анализ выявленных миссенс мутаций гена ТР53
p.W146Rp.T155I
Согласно прогнозу TP53 Mut_ass (release 1.00, 2012), сеймсенс мутация р.A307A
находится в сайте сплайсинга молекулы РНК.
7. Распределение мутаций в интронных и кодирующих участках гена ТР53
Анализ статуса метилирования промотора
и потери гетерозиготности в гене ТР53
Частота метилирования промотора гена ТР53 в группе обследования составила 5,8%
и значимо не различалась (р>0,5) в подгруппах с мутантной и нормальной структурой
гена (4,2% против 6,7%, соответственно) и данных Amara K. et al. (3,7%)*.
Частота ПГ в гене ТР53 составила 25%. В ходе секвенирования у этих больных были
выявлены мутации в 5-8 экзонах и интронах гена ТР53.
В единственном случае ПГ у больного ДВККЛ без мутаций в ТР53 обнаружено
метилирование промотора гена.
* K. Amara, M. Trimeche, S. Ziadi, A. Laatiri, M. Hachana, B. Sriha, M. Mokni, S. Korbi. Presence of simian virus 40 DNA sequences in diffuse large B-cell lymphomas in Tunisia
correlates with aberrant promoter hypermethylation of multiple tumor suppressor genes. // Int. J. Cancer: 121, 2693–2702 (2007).
9. ВЫВОДЫ
1. Полученные результаты свидетельствуют о функциональной селекции при
ДВККЛ мутации в 5-8 экзонах TP53, кодирующих ДНК-связывающий регион
гена.
2. Локализация «горячих точек» мутаций в обследованной выборке пациентов
с ДВККЛ отличалась от данных, представленных в IARC TP53 mutation
database.
3. Спектр однонуклеотидных замен в гене ТР53 в группе обследования
соответствовал спектру, описанному при ДВККЛ в IARC TP53 mutation
database.
4. Показано, наличие при ДВККЛ патогенетически значимых интронных и
сеймсенс замен, что свидетельствует о важности как анализа прилегающих к
экзонам некодирующих участков гена, так и биоинформационного анализа
выявленных синонимичных мутаций.
5. Комплексный анализ статуса ТР53 дает большее представление о
возможных механизмах участия изменчивости данного гена в патогенезе
ДВККЛ. Показано, что дефицит ТР53 при ДВККЛ может формироваться по
«двух-ударному» принципу.