2. İÇERİK
1. Gen, DNA, RNA ve
Transkripsiyon kavramları
2. Gen Espresyonu nedir?
3. PCR nedir?
4. PCR çeşitleri
5. PCR ın Kullanım alanları
6. Real Time PCR da Gen
ekpresyonun gösterilmesi
2
6. EKSON: TAC kodonundan itibaren sağa doğru polimeraz
enziminin mRNA'yı sentezlediği ve genetik bilgilerin anlamlı
DNA'dan mRNA'ya aktarıldığı bölgedir.
İNTRON: DNAnın okunmadan atlanan bu bölümüne intron adı
verilir. Intronlar, mRNA ve protein kodlamasına katılmazlar.
Genlerin kodlamaya katılmayan bu bölümü, toplam insan
genomunun yaklaşık %97'lik bir kısmını oluşturur. 6
25. REAL TİME PCR
• Birçok isimlendirilme
yapılan bu teknoloji
yabancı yayınlarda “kinetik
PCR”, “homojen PCR”,
“kantitatif Real-time PCR”
gibi çeşitli adlarla da
isimlendirilmektedir.
25
26. *Gen Anlatımının Kantitatif Analizi "Real-Time PCR"
QUANTITATIVE ANALYSIS OF GENE EXPRESSION "REAL-TIME PCR": SCIENTIFIC LETTER
*Ticari olarak satılan birçok
"real-time" cihazı vardır. Birbirleri
arasındaki temel farklılıklar
"eksitasyon" ve "emisyon" dalga
boyları, hızı ve aynı anda paralel
gidebilen reaksiyon
kapasiteleridir. Gen
ekspresyonunda daha hassas,
verimli, hızlı ve daha üretken
olması tercih edilmesinin
sebebidir.
REAL TİME PCR
(Turkiye Klinikleri J Med Sci 2007;27(5):76
26
27. Bu yöntem tipik olarak floresan
ışıma değişiminin ölçülmesi esasına
dayanır. DNA boyaları ya da diziye özgül
problardan elde edilen floresans değişimi
PCR‟nin her döngüsünde izlenebilir.
REAL TİME PCR
27
28. Bugün birçok araştırma ve tanı
laboratuvarlarında kullanılan real-time PCR
cihazları mevcuttur. Bu cihazlar
birbirlerinden reaksiyon sayısı kapasiteleri,
eksitasyon-emisyon dalga boylarındaki
farklılıkları, hızları ve kanal sayıları ile
ayrılırlar. Ticari olarak satılanlar;
“Stratagene M x 3000p, M x 3005p ve M x
4000”, “Applied Biosystems 7300 ve 7500”,
“Chromo4”, “Smart Cycler”, “RotorGene”,
“LightCycler” en fazla kullanılanlardır
REAL TİME PCR
28
32. ÖZGÜL OLMAYAN BELİRLEME SİSTEMİ
SYBR Green I Spesifik olmayan çift
zincirli DNA’nın çoğaltımında “SYBR Green I”
yöntemi kullanılır. Bu yöntemde kullanılan
floresan boya sadece çift zincirli DNA’ya
bağlandığından çoğalan DNA miktarındaki
artışa paralel olarak “real-time” PCR
cihazında okunan floresanın miktarı da eş
zamanlı olarak artar.
“SYBR Green I” en fazla
kullanılan boya
çeşitidir
32
34. Özgül Belirleme Sistemi
DNA parçasının çoğaltılmak istenilen
bölgesi özel bir bölge ise bu bölgenin
saptanmasında floresan işaretli problar
kullanılır. Bu tekniklerin başında “TaqMan”
prob, “Molecular beacon”, “Light-up” prob,
hibridizasyon prob ve “Scorpion” primer
gibi floresan işaretli problar kullanılarak
yapılanlardır
34
35. “TaqMan® Probe” Yöntemi
“TagMan® probe” yöntemi “Double-Dye
Oligonucleotide”, “dual labeled probe”
veya “5' nuclease probe” olarak da
adlandırılmaktadır. “TagMan® probe”
yöntemi çoğaltılmak istenilen DNA’ya
komplementer olan ve floresan
işaretlenmiş tek zincirli bir prob içerir.
35
37. Moleküler Boncuk Yöntemi
Moleküler boncuk yöntemi hem
yapısı hem de çalışma prensibi ile
“TagMan® probe” ve “SYBR Green I”
yönteminden çok farklıdır. Saç tokası
şeklindeki yapının yuvarlak uç kısmı
çoğaltılacak DNA ile komplementer tek
zincirli DNA dizisini içerir.
37
39. Hibridizasyon Prob Yöntemi
Bu yöntem Roche tarafından
“LightCycler®” PCR cihazında kullanılmak
üzere geliştirilmiştir. Farklı prob dizayn
edilmiştir. 3’ ucunda floresans işaretli boya
(donor), 5' ucunda alıcı boya (acceptor)
bulunmaktadır. PCR reaksiyonu sırasında bu
iki prob hedef nükleik asit dizisine bağlanıp
birbirine yaklaştığında bir enerji yayılımı olur
(FRET: Fluorescence Resonance Energy
Transfer). Enerji “donor” boyadan “acceptor”
boyaya transfer olur. Bu enerji transferi
sonucunda oluşan floresans
miktarı PCR süresince oluşan
ürün miktarı ile doğru
olarak artar
39
41. PCR NUMUNESİ
Moleküler genetik laboratuvarında
yapılan testlerde incelenen materyal
DNA ya da RNA’dır.
Yapılan incelemeler niteliksel ya da
niceliksel özellikte olabilir.
• DNA ve RNA‟yı inceleyebilmek için
bu molekülleri hücrenin diğer
bileşenlerinden ayırarak analize
hazır hale getirmek gerekir.
• Bu hazırlık aşamaları aşağıdaki gibi
sıralanabilir.
1.DNA ya da RNA izolasyonu
2.PCR (Polimeraz Zincir
Reaksiyonu)
3.Elektroforez Yöntemleri
41
44. Hücre Parçalama Çözeltisi
155 mM NH4Cl
10 mM KHCO3
0.1 mM EDTA
Çekirdek Parçalama Çözeltisi (pH: 8.2)
10 mM Tris-HCl
400 mM NaCl
2 mM EDTA
SDS: %10 gr/ml stok olarak hazırlanır.
Proteinaz K: 20 mg/ml stok olarak hazırlanır.
TE Çözeltisi
10 Mm Tris-Cl pH:7,4
0,1 mM EDTA
DNA İZOLASYON
SOLÜSYONLARI
44
45. *Enzimler(RNase) RNA’yı yok etmek için,
*Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı
olarak bulunan proteinleri yok etmek için,
*İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin
çöktürülmesinde,
*Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin
çöktürülmesinde,
*Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını
bozmada,
***İzole edilen DNA -20°C’da uzun süre
saklanabilir.
DNA İZOLASYON
SOLÜSYONLARI
45
46. Elde edilen DNA’nın saflık ve miktar
belirlenmesi nasıl yapılmaktadır?
DNA' nın miktar ve saflığı,
spektrofotometrede 260 ve 280 nm
dalga boylarında elde edilen
değerlerden belirlenmektedir. çift
iplikli DNA için miktar tayininde
aşağıdaki formülden
yararlanılmaktadır;
DNA (μg/ml)
=260 nm'deki OD
(Absorbans değeri) x
sulandırma oranı x
50
47. DNA’nın temizliği için Absorbsiyon (260
/280) ve Abs. (260 /230) değerlerine
bakılmaktadır. Çünkü DNA 260, protein
280 ve karbonhidratlar da 230 nm
dalga boylarında pik (en yüksek değer)
yapmaktadır. Temiz bir DNA’ da A (260
/280) oranı 1.80 ile 2.00 arasında
olmalıdır.
Elde edilen DNA’nın saflık ve miktar
belirlenmesi nasıl yapılmaktadır?
55. Real Time PCR Mix hazırlama;
• 10 µl Blue master mix ( dNTP,Taq polimeraz,MgCl2 )
• 0.5 µl Forward primer
• 0.5 µl Revers Primer
• 2 µl 5x Syber Geen I boyası
• 5 µl bidistie su
• 2 µl cDNA
Tek bir numune için toplam 20 µl hacimde mix hazırlanır.
55
57. PCR’nin Verimi
PCR’nin verimini etkileyen
önemli bir faktör, DNA polimeraz
enzimidir. Normalde enzim
miktarı, 25-30 PCR döngüsü
sonucunda hedef dizi artışı ve
termal denatürasyon nedeniyle
sınırlayıcı bir etken haline gelir.
Verimliliği azaltan bir diğer
faktör de konsantrasyonu artan
hedef dizilerin primer ile
bağlanma yarışıdır.
60. Melt Curve Analysis/Erime
Eğrisi Analizi nedir?
Erime eğrisi analizi, SYBR-Green vb floresan
boyaların kullanıldığı analizlerde, çoğalan
DNA’nın hedef bölge olduğunu kesinleştirmek
amacıyla kullanılır. Erime eğrisi analizinde, ikili
sarmal DNA örneğinin sıcaklığı yavaş yavaş
artırılarak floresan sinyalin sıcaklığa bağlı
değişimini gösteren bir grafik oluşturulur.
Floresan sinyalin ani düşüşünden kaynaklanan
tepecikler aracılığıyla, DNA iplikçiklerinin
birbirlerinden ayrılmaları gözlemlenir.
67. ÖZET
1. Real Time PCR kullanım alanları
2. Real Time PCR analizinde
kullanılacak numune izolasyonu
3. Uygun kit, prob ve protokoller
kullanılmalı ve teknik olarak bilgi
sahibi olunmalı
4. ReaL Time PCR cihazında ilgili
genin protokolu oluşturulmalı
5. Çalışmalar Real Time PCR
cihazına göre optimize edilmeli
