مقدمه معرفی دستگاه معرفی پروب MLPA تکنیک MLPA بررسی جهش های نقطه ای توسط MLPA توضیح پروتکل MLPA بررسی متیلاسیون توسط MLPA مزیت های MLPA معایب MLPA معرفی کیت MLPA محصولات MLPA برنامه های آینده MLPA

2. •‫مقدمه‬
•‫دستگاه‬ ‫معرفی‬
•‫پروب‬ ‫معرفی‬MLPA
•‫تکنیک‬MLPA
•‫توسط‬ ‫ای‬ ‫نقطه‬ ‫های‬ ‫جهش‬ ‫بررسی‬MLPA
•‫پروتکل‬ ‫توضیح‬MLPA
•‫توسط‬ ‫متیلسیون‬ ‫بررسی‬MLPA
•‫های‬ ‫مزیت‬MLPA
•‫معایب‬MLPA
•‫کیت‬ ‫معرفی‬MLPA
•‫محصولت‬MLPA
•‫آینده‬ ‫های‬ ‫برنامه‬MLPA

3. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification
(MLPA)
•‫سال‬ ‫در‬ ‫بار‬ ‫اولین‬2002‫توسط‬Schoten.JP‫همکارانش‬ ‫و‬
. ‫شد‬ ‫داده‬ ‫شرح‬
•‫های‬ ‫توالی‬40‫یابی‬ ‫توالی‬ ‫روش‬ ‫این‬ ‫توسط‬ ‫نوکلئوتیدی‬ ‫اسید‬
‫شوند‬ ‫می‬
•‫از‬ ‫بیش‬150‫از‬ ‫استفاده‬ ‫با‬ ‫مختلف‬ ‫موضوعات‬ ‫در‬ ‫مقاله‬
MLPA‫است‬ ‫شده‬ ‫منتشر‬
•‫از‬ ‫بیش‬ ‫در‬ ‫دنیا‬ ‫در‬ ‫معمول‬ ‫شکل‬ ‫به‬00‫این‬ ‫از‬ ‫آزمایشگاه‬ ‫د‬
‫میشود‬ ‫استفاده‬ ‫تکنیک‬

4. MLPA‫دستگاه‬
• 1 : Thermocycler
• 2 : Sequence type electrophoresis

5. Probs

6. MLPA technique
• Denaturation
• Hybridization
• Ligation
• Amplification

7. Hybridysation
•1-‫میکس‬ ‫پروب‬MLPA‫به‬DNA‫شده‬ ‫دناتوره‬ ‫ژنومی‬
‫شود‬ ‫می‬ ‫اضافه‬
•2-‫مجاور‬ ‫هدف‬ ‫توالی‬ ‫به‬ ‫پروب‬ ‫هر‬ ‫از‬ ‫بخش‬ ‫دو‬
‫میشوند‬ ‫هیبریداز‬

8. Ligation
•‫متصل‬ ‫بهم‬ ‫حرارت‬ ‫به‬ ‫مقاوم‬ ‫لیگاز‬ ‫توسط‬ ‫ها‬ ‫پروب‬
‫میشوند‬

9. Hybridization and Ligation

10. Amplification
•‫برای‬ ‫جهانی‬ ‫پرایمر‬ ‫جفت‬ ‫یک‬ ‫از‬Amplify‫همه‬ ‫کردن‬
‫های‬ ‫پروب‬Ligated. ‫شود‬ ‫می‬ ‫استفاده‬ ‫شده‬
•‫محصول‬Amplification‫منحصر‬ ‫طول‬ ‫پروب‬ ‫هر‬
‫دارد‬ ‫بفردی‬
•)130‫الی‬480bp(

11. Separation and quantification by
capillary electrophoresis
‫محصول‬ ‫قله‬ ‫هر‬
‫یک‬ ‫تکثیر‬Probe
‫است‬ ‫خاص‬
‫اوج‬ ‫ارتفاع‬ ‫در‬ ‫تفاوت‬
‫اوج‬ ‫منطقه‬ ‫یا‬ ‫و‬ ‫نسبی‬
‫در‬ ‫تغییر‬ ‫دهنده‬ ‫نشان‬
‫توالی‬ ‫از‬ ‫کپی‬ ‫تعداد‬
‫است‬ ‫هدف‬

12. Detection of Chr X copy number

13. Homozygous deletion

14. Heterozygotes deletion

15. Many variables have only a small influence
on MLPA results

16. DNA Amount of DNA used has little influence
on MLPA results

17. Detection of point mutations
•‫کامل‬ ‫که‬ ‫زمانی‬ ‫ها‬ ‫پروب‬‫متصل‬ ‫بهم‬ ‫شدند‬ ‫همسان‬
.‫میشوند‬
•‫و‬ ‫مشترک‬ ‫های‬ ‫جهش‬ ‫برای‬ ‫ها‬ ‫پروب‬SNP`s‫بکار‬ ‫ها‬
.‫میروند‬
•‫خواهد‬ ‫وجود‬ ‫سیگنال‬ ‫باشد‬ ‫داده‬ ‫رخ‬ ‫جهشی‬ ‫که‬ ‫زمانی‬
‫داشت‬.

18. MLPA discriminates sequences that differ in only a single
nucleotide & can be used to detect known point mutations

19. MLPA protocol
DNA DENATURATION-1
‫حرارت‬20-500ng DNA‫دمای‬ ‫در‬98oC‫بمدت‬5‫دقیقه‬
HYBRIDIZATION-2
‫پروب‬ ‫افزودن‬MLPA‫بافر‬ ‫و‬MLPA
‫بمدت‬ ‫کردن‬ ‫انکوبه‬1‫دمای‬ ‫در‬ ‫دقیقه‬95oC‫دمای‬ ‫در‬ ‫هیبریداسون‬ ‫و‬60
oC‫بمدت‬16‫ساعت‬
LIGATION-3
‫لیگاز‬ ‫افزودن‬65‫دمای‬ ‫در‬ ‫کردن‬ ‫انکوبه‬ ‫و‬ ‫بافر‬ ‫لیگاز‬ ‫و‬54oC‫بمدت‬15
‫دقیقه‬
‫دمای‬ ‫تا‬ ‫دادن‬ ‫حرارت‬98oC‫بمدت‬ ‫لیگاز‬ ‫آنزیم‬ ‫کردن‬ ‫فعال‬ ‫غیر‬ ‫برای‬5‫دقیقه‬

20. •4-PCR
•Primers
‫افزودن‬dNTPs‫شروع‬ ‫و‬
PCR
Polymerase
•5-CAPILLARY
ELECTROPHORESIS
•‫قله‬ ‫اوج‬ ‫و‬ ‫طول‬ ‫صدور‬
•‫الکتروفورز‬ ‫محصولت‬ ‫آنالیز‬

21. Methylation detection
Epigenetics
•‫نوکلئوتیدهای‬ ‫متیلسیون‬ ‫به‬ ‫توجه‬ ‫با‬ ‫ژن‬ ‫رونویسی‬ ‫تنظیم‬CPG
‫پروموتور‬ ‫در‬ ‫واقع‬
Imprinting
‫محافظت‬ ‫صورت‬ ‫به‬ ‫آنها‬ ‫متیلسیون‬ ‫الگوهای‬ ‫که‬ ‫ژنوم‬ ‫از‬ ‫مناطقی‬
‫است‬ ‫رسیده‬ ‫ارث‬ ‫به‬ ‫مادر‬ ‫و‬ ‫پدر‬ ‫از‬ ‫شده‬

22. Methylation specific MLPA (MS MLPA)

23. Methylation changes in imprinted regions

24. Advantages of MLPA
•1) :‫تا‬ ‫هدف‬ ‫توالی‬ ‫چندین‬ ‫بررسی‬45(‫طور‬ ‫به‬ ‫توالی‬
‫واکنش‬ ‫یک‬ ‫در‬ ‫همزمان‬
•2:‫و‬ ‫شدن‬ ‫متیله‬ ، ‫ای‬ ‫نقطه‬ ‫های‬ ‫جهش‬ ‫بررسی‬ ‫امکان‬
‫آنالیز‬ ‫یک‬ ‫در‬ ‫نسخه‬ ‫تعداد‬
•3:‫اندک‬ ‫مقدار‬ ‫به‬ ‫نیاز‬DNA (20-100 ng(
•4:‫کامل‬ ‫سلول‬ ‫به‬ ‫نیاز‬ ‫عدم‬
•5:‫پرایمر‬ ‫جفت‬ ‫یک‬ ‫تنها‬ ‫از‬ ‫استفاده‬
•6:‫قابلیت‬ ‫با‬ ‫آسان‬ ‫و‬ ‫قوی‬ ، ‫ارزان‬ ‫نسبتا‬ ، ‫کمی‬ ‫روش‬
‫طبی‬ ‫تشخیص‬ ‫آزمایشگاههای‬ ‫برای‬ ‫مناسب‬ ‫خودکاری‬
•7:‫ها‬ ‫حذف‬ ‫ریز‬ ‫تشخیص‬ ‫به‬ ‫قادر‬

25. Disadvantages of MLPA
1:‫ها‬ ‫پروب‬ ‫تهیه‬ ‫بالی‬ ‫های‬ ‫هزینه‬ ‫و‬ ‫بودن‬ ‫پیچیده‬ ، ‫گیر‬ ‫وقت‬
2) :‫روش‬ ‫برخلف‬ ‫انفرادی‬ ‫شکل‬ ‫به‬ ‫را‬ ‫ها‬ ‫سلول‬ ‫بررسی‬ ‫توانایی‬ ‫عدم‬FISH(
3:‫و‬ ‫سالم‬ ‫های‬ ‫سلول‬ ‫با‬ ‫تومور‬ ‫نمونه‬ ‫آلودگی‬ ‫دلیل‬ ‫به‬ ‫درست‬ ‫تشخیص‬ ‫عدم‬
‫ژنتیکی‬ ‫ناهنجاری‬ ‫دارای‬ ‫های‬ ‫سلول‬ ‫کم‬ ‫درصد‬ ‫نیز‬
4:‫تومورها‬ ‫مطالعه‬ ‫هنگام‬ ‫در‬ ‫ویژه‬ ‫به‬ ‫مناسب‬ ‫مرجع‬ ‫های‬ ‫نمونه‬ ‫کمبود‬
5:‫های‬ ‫پروب‬ ‫طراحی‬ ‫ضرورت‬ ‫و‬ ‫ها‬ ‫واژگونی‬ ‫و‬ ‫ها‬ ‫جابجایی‬ ‫تشخیص‬ ‫عدم‬
‫منظور‬ ‫این‬ ‫برای‬ ‫ویژه‬
6:‫تریپلوئیدی‬ ‫از‬ ‫دیپلوئیدی‬ ‫تمایز‬ ‫عدم‬
7:‫طراحی‬ ‫آنها‬ ‫برای‬ ‫پروب‬ ‫که‬ ‫مکانهایی‬ ‫در‬ ‫ژنومی‬ ‫تغییرات‬ ‫شناسایی‬ ‫عدم‬
‫است‬ ‫نشده‬
8:‫به‬ ‫نیاز‬DNA‫آن‬ ‫مانند‬ ‫و‬ ‫فنل‬ ، ‫نمک‬ ‫آلودگی‬ ‫فاقد‬ ‫و‬ ‫مناسب‬ ‫کیفیت‬ ‫با‬
9:‫تنها‬ ‫تغییرات‬ ‫این‬ ‫که‬ ‫زمانی‬ ‫ویژه‬ ‫به‬ ‫شده‬ ‫شناخته‬ ‫های‬ ‫جهش‬ ‫تایید‬ ‫به‬ ‫نیاز‬
‫پشت‬ ‫ژنومی‬ ‫های‬ ‫مکان‬ ‫به‬ ‫مربوط‬ ‫های‬ ‫پروب‬ ‫در‬ ‫یا‬ ‫و‬ ‫شده‬ ‫شامل‬ ‫را‬ ‫پروب‬ ‫یک‬
‫ندهند‬ ‫رخ‬ ‫هم‬ ‫سر‬

26. MLPA kits
•‫حداقل‬ ‫برای‬ ‫هرکدام‬ ‫که‬ ‫میکس‬ ‫پروب‬ ‫سه‬ ‫با‬ ‫مخلوط‬ ‫یک‬20
‫است‬ ‫استفاده‬ ‫مورد‬ ‫واکنش‬
•‫برای‬ ‫ها‬ ‫کیت‬ ‫از‬ ‫برخی‬MLPA‫و‬MS-MLPA‫هستند‬ ‫یکسان‬
•RNA MLPA Kits‫هستند‬‫مستلزم‬
•‫آنزیم‬Hhal‫کیت‬ ‫شامل‬ME-MLPA‫نمیباشد‬
•‫های‬ ‫کیت‬ ‫های‬ ‫آنزیم‬MLPA‫میباشند‬ ‫پایدار‬ ‫بسیار‬

27. MLPA products
•‫های‬ ‫کروموزوم‬ ‫آنیوپلوئیدی‬ ‫بررسی‬, ,13 18 21,X,Y
•‫دوتاشدگی‬ ‫و‬ ‫کروموزومی‬ ‫بزرگ‬ ‫های‬ ‫حذف‬ ‫تشخیص‬
‫ها‬
:‫آتروفی‬ ،‫ویلیامز‬ ، ‫جرج‬ ‫دی‬ ‫سندرم‬ ‫مثال‬
‫نخاعی‬ ‫عضلنی‬SMA،‫ساب‬ ‫مناطق‬
‫غیره‬ ‫و‬ ‫تلومریک‬
•‫سرطانی‬ ‫بافت‬ ‫در‬ ‫ژن‬ ‫کاهش‬ ‫یا‬ ‫افزایش‬ ‫بررسی‬
•‫اگزونی‬ ‫یا‬ ‫و‬ ‫ژنی‬ ‫تک‬ ‫های‬ ‫دوتاشدگی‬ ‫یا‬ ‫حذف‬ ‫بررسی‬
•‫های‬ ‫اگزون‬ ‫تمام‬ ‫از‬ ‫نامبر‬ ‫کپی‬CFTR
•‫تمام‬ ‫از‬ ‫نامبر‬ ‫کپی‬79‫اگزون‬DMD‫واکنش‬ ‫دو‬ ‫در‬
MLPA
•‫های‬ ‫کیت‬MS-MLPA

28. Future applications MLPA
•‫روش‬ ‫حساسیت‬ ‫افزایش‬MLPA
•SC MLPA
‫بدست‬ ‫جنینی‬ ‫تک‬ ‫های‬ ‫سلول‬ ‫از‬ ‫تریزومی‬ ‫تشخیص‬
‫مادر‬ ‫پلسمای‬ ‫از‬ ‫آمده‬
•‫تومورها‬ ‫تشخیص‬ ‫برای‬ ‫میکس‬ ‫پروب‬ ‫تهیه‬
•‫جزایر‬ ‫در‬ ‫نابجا‬ ‫متیلسیون‬ ‫تشخیص‬ ‫برای‬ ‫میکس‬ ‫پروب‬ ‫تهیه‬
CPG

29. ‫پیمان‬ ‫دکتر‬ ‫آقای‬ ‫از‬ ‫تشکر‬ ‫با‬
‫های‬ ‫حمایت‬ ‫جهت‬ ‫زاده‬ ‫قریشی‬
‫سمینار‬ ‫این‬ ‫اجرای‬ ‫در‬ ‫لزم‬