1. Introduction
有研究指出纖維連接蛋白(Fibronectin)和癌細胞的轉移有相關性，為了抑制癌細胞轉移找尋潛在的機制則為必要性。
在我們團隊之前的實驗發現Firbronectin assembly在具有STAT3蛋白表達的肺癌細胞株(AS2-S3C)比不具有STAT3蛋白表達
的肺癌細胞株(AS2)反應明顯。在證明STAT3(分子量為91kD)和Firbronectin之間的關係，利用phospho-STAT3Antibody發現
在120kD 有特異的結果。我們猜測可能原因其一為過度磷酸化影響蛋白質結構改變；其二為有一結構與STAT3結構類似
的蛋白質也會與phospho-STAT3 Antibody反應。為了證實我們的假設，利用tyrosine phosphotase去除過度磷酸化的現象，
結果發現在120kD依然有特異的結果。因此再利用質譜儀分析發現到膜上特定蛋白位於120kD，且在我們團隊之前的研究
發現此蛋白和Firbronectin 結合反應成正比。因此我們將探討此蛋白是否會影響Fibronectin assembly。
Method
細胞培養
培養會表達STAT3蛋白的肺癌細胞株(AS2-S3C cell)，利用lentivirus system將一部分的AS2-S3C cell 的膜上特定蛋白 knock
down並培養單一clone。用含有10%FBS DMEM (glutamine+ pyruvate)培養於10㎝２petri dish。
收集lysate
用10XTrypsin將細胞收集至15ml離心管，離心後去掉上清液加入含有20%FBS DMEM (glutamine+ pyruvate) 置於37℃培養
箱內培養2小時，使細胞恢復。4℃離心機離心，在冰上進行，依照pellet多寡加入lysis buffer(PMSF 1:200 ; lenpptn 1:1000 ;
Na3VO4 3mM)破細胞膜。於4℃下摩天輪反應一小時，用超高速離心方法（4℃下以13200 rpm之速度，離心15分鐘）；丟棄
沉澱物，留下上清液。以BIO-RAD protein assay定量蛋白質含量後，將經校訂後取等體積與等蛋白質總量之標本，置入
sample collecting tubes內，再加入同體積的Tricine SDS sample buffer，於95℃下加熱5分鐘後，離心，等待應用loading在
SDS-PAGE gel上。
Western blotting（西方墨點法）的免疫檢驗方法
(1) 將蛋白質混合物置於SDS-polyacrylamide膠體上，電泳分離，接著是blotting：解析的蛋白質在電場中，從膠體轉移到
Polyvinylidine Fluoride membrane。
(2) 將transfer membrane浸於含有標的蛋白質的抗體（primary antibody）溶液中，形成抗原-抗體複合體。
(3) 藉由對primary antibody具專一性的enzyme-linked抗體（secondary antibody），來漂洗此membrane，再加入受質，產生
有色物質，而偵測得知感興趣蛋白質帶。
免疫轉漬法（immunoblotting）
轉印完成後，將PVDF paper置於5﹪milk 中，用迴旋振盪器振盪Overnight blocking。加入初級抗體，用迴旋振盪器振盪作用
一小時。以TTBS（Tris-Tween buffer saline）洗六次~十二次，每次五~十分鐘，約一小時，用迴旋振盪器振盪。再加入次級
抗體（1：1000 anti-rabbit IgG ，anti-mouse IgG ），作用60分鐘。再以TTBS洗六次~十二次，每次五~十分鐘，約一小時，用
迴旋振盪器振盪。再將transfer membrane夾起，置入chemiluminescence reagents（PerkinElmer Life Science；Western
Lightning：Enhanced luminol reagent 0.5ml配上Oxidizing reagent 0.5ml）作用1分鐘反應螢光。最後以Kodak之X-ray壓片，洗
片後觀察結果。
Results
在實驗中我們嘗試了不同的antibody species 來測試，最後發現到mouse這隻抗體的專一性較為來的好，但由於其訊號太
強烈，所以我們也做了用不同抗體濃度的測試。而以下是這兩個月中較好的結果。
(左圖a)同樣的lysate量15ug以此蛋白 (mouse) 1:150000;1:200000做測試。我們的
結果顯示，在1:1500000和1:200000的濃度之下發現在100kD上方約120kD的位子
AS2-S3C siRNA(C)及As2-S3C siRNA(D)兩個單一細胞株都有knock down的現象。
這代表說我們有成功的此蛋白 knock down。
(左圖b)而在phospho-STAT3也有我們預期的結果
使用phospho-STAT3 (rbt) antibody，S為對照組C
和D分別為As2-S3C siRNA(C)和As2-S3C siRNA(D)。
可以明顯的看出C和D比起S有差異。
Discussion
接下來就是繼續做測試及三重複，使我們的結果從偶然變成必
然。並且開始做RT-PCR確認我們有knock down 此特定蛋白成
功，之後就可以去做和Fibronectin的相關性實驗，例如免疫螢
光染色等等，來證明此蛋白是會影響Firbronectin assembly，也
或許可以做動物實驗做測試，就可以藉由這樣的結果去了解，
可能有另一條使得癌細胞轉移的路徑，在未來可以找尋是否可
以利用此路徑來抑制癌細胞轉移的方法。
誌謝
感謝指導教授鄭宏祺教授的教導，讓我得以在科學的領域上看到更廣大的天空，了解這
領域的深奧，而不是做為井底之蛙。並且在討論時不時指點我正確的思考方向，使我受
益良多。對於學問的嚴謹態度更是值得我學習的典範。
亦感謝指導我的黃馨慧學姊，不辭辛勞的耐心教導以及不厭其煩的指出我的缺失，利用
簡單的道理讓我了解其中的深奧，不中飽私囊的教導我，讓我在研究的態度上可以更加
積極努力，因為有學姊的幫忙和教誨，使的本報告更加完整。
感謝張明敏、郭錦雲、陳馨怡、楊依珊學姊和林宥全、郭子瑋、李明澤、林宗成、楊承
翰學長的幫忙，總能不厭其煩的在我迷惘時候為我解惑，也感謝和我一同學習的同輩們
給我的幫助，你們的幫忙和實驗室的喜怒哀樂，是我無法遺忘的，誠摯的感謝。
最後感謝王世融老師的協助，我才能在如此優秀了環境學習。
長榮大學生物科技學系 100學年度專題實習
實習單位:國立成功大學醫學院生物化學兼分子生物學研究所
指導老師:鄭宏祺老師
指導學長：黃馨慧學姊
報告者：黃乙玄
參考文獻
Huang L, Cheng HC, Isom R, Chen CS, Levine RA, Pauli BU. (2008) Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 2008 Mar 21;283(12):7616-27.
Epub 2008 Jan 8.
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