Di truyền phân đoạn các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen, 9đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lại Phƣơng Liên
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7
CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7
CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Phạm Xuân Hội
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Hà Nội – Năm 2013

i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội và
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Nguyễn Duy Phƣơng, CN. Nguyễn
Hoàng Quang cùng các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật,
Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong
thời gian thực tập tại Bộ môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ môn
Di truyền học, khoa Sinh học , trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong một môi trƣờng học
tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm học.
Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè,những
ngƣời luôn đứng sau giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013
Học viên thực hiện

ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BVTV Bảo vệ thực vật
bp Base pair (Cặp bazơ)
cDNA complementary (DNA bổ sung)
ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate
DNA Axit deoxy ribonucleic
dNTP Deoxynucleotidetriphosphates
dsRNA Double stranded RNA (ARN sợi đôi)
FDV Fiji disease virus (Virus bệnh Fiji)
EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết
với enzyme)
EtBr Ethidium Bromide
IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế)
Kb Kilobase
LB Môi trƣờng Luria Bertani
LSĐPN Lùn sọc đen phƣơng Nam
MRCV Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto)
MRDV Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô)
NLRV Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens)
NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn
OD Optical Density (mật độ quang học)
ORF Open reading frame (Khung đọc mở)
OSDV Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yến mạch)
PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
RBSDV Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen)
RGSV Rice grassy stunt virus (Virus lúa cỏ)
RNA Axit ribonucleic
RRSV Rice ragged stunt virus (Virus lùn xoắn lá)

iii
RSV Rice stripe virus (Virus lúa sọc)
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp
phiên mã ngƣợc)
RTSV Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cầu)
RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dạng thẳng)
RDV Rice dwarf virus (Virus bệnh lúa lùn)
RGDV Rice gall dwarf virus (Virus vết u lùn lúa)
SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen phƣơng Nam)
TAE Tris base – Acetic - EDTA

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang
Bảng 1 Các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu. 22
Bảng 2 Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa 35
Bảng 3 Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và
RT-PCR một bƣớc
40
Bảng 4 Trình tự các mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng
RT-PCR
42
Bảng 5 So sánh mức đồng nhất trình tự phân đoạn S7 phân lập của các
mẫu Việt Nam và Trung Quốc
54

v
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang
Hình 1 Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 8
Hình 2 Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV 9
Hình 3 Cấu trúc phân tử các Fijivirus 11
Hình 4 Tổ chức bộ gen của các Fijivirus 11
Hình 5 Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 12
Hình 6 Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV
trên gel polyacrylamide 12,5%.
14
Hình 7 Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh
(rầy Sogatella furcifera) dƣới kính hiển vi điện tử
16
Hình 8 Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phƣơng pháp DOT-ELISA 17
Hình 9 Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các
enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM-T
32
Hình 10 Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam 37
Hình 11 Một số kết quả kiểm tra ELISA với các mẫu thu thập ở các tỉnh
Việt Nam
38
Hình 12 Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một
bƣớc của các mẫu lúa
39
Hình 13 Hình ảnh điện di genome của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu
lúa
40
Hình 14 Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập đƣợc của SRBSDV
trên gel agarose 1% (chủng Thái Bình-2)
42
Hình 15 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân
đoạn S7
43
Hình 16 Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch bằng bộ kit
GenJETTM
Gel Extraction trên gel agarose 1%
45
Hình 17 Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T 46
Hình 18 Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng 46

vi
DH5α
Hình 19 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel
agarose 1%
47
Hình 20 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng
cặp mồi S7-Fw/S7-Rv
48
Hình 21 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng
cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv
49
Hình 22 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp
pGEM-T/S7 bằng enzyme EcoRI
50
Hình 23 Một phần kết quả giải trình tự phân đoạn S7 của virus
SRBSDV (mẫu Nghệ An)
50
Hình 24 Trình tự amino acid suy diễn của 2 khung đọc mở nằm trên
phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An)
51
Hình 25 Một phần kết quả so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7
của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới
53
Hình 26 Một phần kết quả so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7
của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới
53
Hình 27 Hai cây phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự S7 (A) và trình tự
gen P7-1 (B)
55

vii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM............................3
1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa...............................................................................................3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam...............................................................3
1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV.......................................5
1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam.........................................................5
1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam....................................................5
1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam................................................................6
1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam..................................................7
1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết..........................................................................................................7
1.2.2.2. Vector truyền bệnh........................................................................................................8
1.2.3. Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV..........................................................................10
1.2.3.1. Phân loại.....................................................................................................................10
1.2.3.2. Đặc điểm hình thái của SRBSDV................................................................................12
1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV......................................................................12
1.2.3.4. Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV......................................14
1.2.3.5. Chuẩn đoán virus SRBSDV.........................................................................................16
1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam và virus SRBSDV ở Việt
Nam...........................................................................................................................................17
1.2.4.1. Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV ..........................................................17
1.2.4.2. Các nghiên cứu về quy trình chẩn đoán virus SRBSDV.............................................19
CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................21
2.1. VẬT LIỆU.........................................................................................................................21
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.....................................................................................................21
2.1.2. Hóa chất..........................................................................................................................21
2.1.3. Thiết bị............................................................................................................................22

viii
2.2. PHƢƠNG PHÁP..............................................................................................................22
2.2.1. Thu mẫu.........................................................................................................................22
2.2.2. Xét nghiệm mẫu............................................................................................................22
2.2.2.1. Phƣơng thức ELISA gắn đặc hiệu - "Sandwich ELISA".............................................23
2.2.2.2. RT-PCR một bƣớc.......................................................................................................25
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1%.............................................................................26
2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11..........................................................26
2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA...........................................................................................28
2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi...........................................................................................................28
2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1..................................................................................................28
2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR...............................................................29
2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas...............................30
2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning.................................31
2.2.5.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T.....................................................31
2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.colichủng DH5α..............................................32
2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM
Plasmid Miniprep...........33
2.2.7. Cắt enzyme giới hạn.......................................................................................................33
2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng.............................................................34
2.2.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7......................................................................35
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................36
3.1. Thu thập và bảo quản mẫu................................................................................................36
3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bƣớc......38
3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phƣơng pháp Sandwich- ELISA............................38
3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp RT-PCR 1 bƣớc....................................................39
3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV............................................................................39
3.4. Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV thu thập từ mẫu lúa bệnh......................................41
3.5. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR.......................................................43
3.5.1. Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân đoạn S7..43
3.5.2. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR....................................................43

ix
3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR phân đoạn S7 của virus SRBSDV............................................44
3.7. Nhân dòng phân đoạn S7 vào vector PGEM-T.................................................................45
3.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α...............45
3.7.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hợp............................................47
3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR. ..... 47
3.7.2.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hợp bằng cách xử lí với enzyme
cắt giới hạn EcoRI.................................................................................................................... 49
3.8. Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV.........................................................................50
3.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV...................................52
3.9.1. So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV
trên thế giới...............................................................................................................................52
3.9.2. Phân tích đặc điểm di truyền..........................................................................................55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 57
Kết luận .................................................................................................................................... 57
Kiến nghị..................................................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 57
PHỤ LỤC 1.............................................................................................................................. 62
PHỤ LỤC 2.............................................................................................................................. 68

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học
1
MỞ ĐẦU
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời
cũng là nguồn lƣơng thực chính cho một nửa dân số thế giới. Là nƣớc xuất khẩu gạo
đứng thứ 2 trên thế giới, lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp
xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính của 90 triệu dân số trong nƣớc.
Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo của Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều thách
thức nhƣ (1) điều kiện bất lợi của môi trƣờng do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi
khí hậu toàn câu và (2) dịch bệnh do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học
dẫn đến mất cân bằng sinh thái. Trong điều kiện thích hợp, các tác nhân gây bệnh trên
lúa có thể phát triển rất mạnh, làm giảm năng suất tới trên 85%, thậm chí mất trắng.
Đây là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất, dẫn đến sản lƣợng
nông nghiệp không ổn định và gây tình trạng mất an ninh lƣơng thực.
Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa, virus là mầm bệnh nguy hiểm nhất do
khả năng phát tán rất rộng, đồng thời rất khó kiểm soát. Ở Việt Nam, virus gây ra một
số bệnh rất nguy hiểm, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sản lƣợng lúa nhƣ bệnh vàng lùn,
bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen...Trong các năm từ 2009 đến 2010, dịch bệnh lúa
lùn sọc đen lần đầu tiên bùng phát và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng
diện tích nhiễm bệnh lên tới cả trăm ngàn ha, gây thiệt hại lớn cho sản suất Nông
nghiệp. Mặc dù, nguyên nhân gây bệnh bƣớc đầu đã đƣợc xác định là virus gây bệnh
lúa lùn sọc đen (SRBSDV) và dịch bệnh đến nay đã tạm thời lắng xuống nhƣng diễn
biến gây bệnh vẫn tồn tại trong sản suất lúa. Đặc biệt, virus SRBSDV là chủng vius
mới xuất hiện nên tất cả các nghiên cứu nhƣ: (1) nguyên nhân gây bệnh, (2) đặc trƣng
sinh học, (3) dịch tễ bệnh và (4) phòng chống bệnh cần phải đƣợc nghiên cứu. Thực tế
các nghiên cứu hiện tại vẫn đang tập trung vào việc hoàn thiện quy trình chẩn đoán, sau
đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt trung gian truyền bệnh,
trồng giống lúa kháng rầy, luân canh...; chƣa có các nghiên cứu chuyên sâu về bản chất
hệ gene, mức độ đa dạng di truyền, mức độ đột biến, nguy cơ phát sinh chủng mới. Vì
nguy cơ phát dịch trở lại của loại virus này vẫn tiềm ẩn.

2
Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi,
có kích thƣớc từ 1 đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào
kích thƣớc phân đoạn RNA sợi đôi. Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF
có chiều dài 1073 và 930 nucleotide. Trong đó, ORF 7-1 chứa gen 7-1 quy định protein
P7-1 liên quan đến tính tƣơng tác đặc hiệu với vector trung gian truyền bệnh là rầy
lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan trọng trong nghiên cứu tính đa
dạng di truyền và sự tiến hóa của virus.
Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đa
dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen” với
những mục tiêu chính nhƣ sau:
- Phân lập và giải trình tự phân đoạn S7 của vius SRBSDV trên các mẫu lúa
nhiễm bệnh thu thập tại 5 vùng sinh thái trồng lúa của Việt Nam.
- Phân tích tính đa dạng di truyền và so sánh mức độ tiến hóa của các chủng
SRBSDV ở Việt Nam với các chủng SRBSDV khác trên thế giới.

3
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM
1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa
Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân
chính làm sản lƣợng nông nghiệp không ổn định, gây ra tình trạng mất an ninh lƣơng
thực. Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ do
việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và
mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào
hết. Trong sản xuất nông nghiệp tổng cộng có 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1)
và khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp nhƣ
cây ngô, đậu tƣơng…Trong số các virus hại lúa ngoài Rice hoja blanca virus (một
Ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một Luteovirus, phân bố tại
châu Âu), Rice stripe necrosis virus (một Furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus
còn lại đều phát hiện thấy tại các nƣớc trồng lúa châu Á. Tuy nhiên có 5 bệnh virus gây
hại nghiệm trọng và phổ biến nhất là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn
lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời.[17,24,26,23,34]
1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam
Việt Nam hiện có 12/16 loại vius gây hại trên lúa, các bệnh do vius gây ra thành
các đợt dịch thƣờng nối tiếp nhau ở các vùng trồng lúa khác nhau trên cả nƣớc. Tuy
nhiên, cho đến nay mới ghi nhận 5 loại bệnh virus gây thành dịch, bao gồm bệnh vàng lá di
động, bệnh tungro, bệnh lúa cỏ, bệnh lúa lùn xoắn, bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam [15]. Hiện
nay, virus gây bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus – RYSV) đang gây hại tại Bắc giang
và đang có nguy cơ thành dịch [14].
Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó
áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng
giống kháng rầy, luân canh… Một số cơ quan nghiên cứu nhƣ Viện Bảo vệ Thực vật và
Trƣờng đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng

4
huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất đƣợc kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùn
xoăn lá, đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện RGSV, RRSV,
RBSDV, RSV, RTSV, SRBSDV [8, 13]. Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng
lùn và lùn xoăn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và
biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên
cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật [7]. Các nghiên cứu về virus hại lúa
tại Viện Di truyền Nông Nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các
nghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng Công nghệ
gen. Hiện Viện Di truyền Nông Nghiệp đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn
và lùn xoăn lá lúa ở ngân hàng gen NCBI, đã xác định đƣợc các gen quan trọng và các
đoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ),
đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận đƣợc
một số cây chuyển gen [5, 11]. Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâm
nghiên cứu Nông nghiệp quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã sản suất
đƣợc 7 bộ kit chẩn đoán 7 virus lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: RGSV,
RRSV, RBSDV, RSV, RTSV, RTBV, RDV và RGDV với số lƣợng đủ cho nghiên
cứu, hợp tác và chẩn đoán [5].
Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua là
đáng ghi nhận nhƣng vẫn chƣa thể đáp ứng đƣợc với diễn biến phức tạp của dịch virus
hiện nay. Vì vậy, chiến lƣợc nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cần
phải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hạn. Nghiên cứu
đối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản suất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đó
xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả, trong khi nghiên cứu dài hạn tập trung vào
khâu xác định bản chất hệ gen, mức độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến
để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác,
nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gây
bệnh dựa trên công nghệ gen.

5
1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV
1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam
1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam.
Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (Oryza sativa) tại
một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc. Cây lúa
nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần
nhỏ. Ban đầu, virus gây bệnh chỉ đƣợc coi nhƣ là một biến chủng của virus lùn sọc đen.
Mãi tới gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về môi giới truyền bệnh, cấu trúc và
bản chất hệ gen virus, các nhà khoa học Trung Quốc đã kết luận nguyên nhân gây bệnh
là do 1 chủng virus mới với tên gọi virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam. Nhóm virus
mới có môi giới truyền bệnh riêng biệt là rầy lƣng trắng – một đặc điểm quan trọng và
khá đặc trƣng cho các thành viên trong nhóm Fijivirus. Hình dạng, kích thƣớc và cấu
trúc đặc trƣng của các tiểu thể virus dƣới kính hiển vi điện tử có những đặc điểm rất
đặc trƣng. Toàn bộ trình tự gen của 2 biến chủng (Quảng Đông và Hải Nam) đã đƣợc
xác định. Các tính chất đặc trƣng ở mức phân tử cho thấy trình tự gen cũng nhƣ trình tự
axit amin của 2 biến chủng này có độ tƣơng đồng cao hơn hẳn so với sự sai khác giữa
các biến chủng của các thành viên khác trong nhóm Fijivirus và nằm trong khoảng sai
khác khi so sánh giữa các chủng với nhau. Mặt khác, những khác biệt này lại gần gũi
hơn với Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), Maize rough dwarf virus (MRDV)
và Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) – các thành viên trong phân nhóm Fijivirus-2 của
nhóm Fijivirus, so với các thành viên thuộc các phân nhóm khác. Do đó, có thể nói
chính xác hơn rằng SRBSDV là 1 thành viên mới thuộc nhân nhóm 2 – cùng với
RBSDV, MRCV, MRDV, trong nhóm Fijivius, họ Reoviridae. Việc đặt tên là lùn sọc
đen phƣơng Nam là do nhóm virus này có sự tƣơng đồng về triệu chứng bệnh trên cây
nhiễm, song virus lùn sọc đen tập trung chủ yếu ở phía Bắc Bán cầu trong khi virus
SRBSDV mới chỉ ghi nhận ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc [25,24,18]. Ngoài lúa và
ngô, virus SRBSDV cũng đƣợc xác định có thể nhiễm tƣ̣ nhiên trên 3 loài cỏ dại là cỏ

6
lồng vƣ̣c (Echinochloa crusgalli), cỏ đuôi voi (Pennisetum flaccidum) và Juncellus
serotinus có mặt trong hoặc xung quanh ruộng lúa nhiễm bệnh [7,42,22].
1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam
Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, một bê ̣nh la ̣ (bê ̣nh lùn lụi) đã xuất hiê ̣n
trên diê ̣n rộng trên lú a mùa với tổng diê ̣n tích nhiễm bê ̣nh lên tới 5.506 ha, trong đó
gần 3.510 ha bị mất trắng. Cây bê ̣nh bi ̣lùn ma ̣nh , lá xanh đậm , nhiều lá bi ̣xoắn vă ̣n ,
sau biến vàng, trỗ không thoát . Triê ̣u chƣ́ ng cây bê ̣nh khá giống với bê ̣nh lùn xoắn lá
tại miền Nam . Tất cả các giống gieo trồng ta ̣i Nghê ̣An (TH3-3, Nhị ƣu 838, Bio404,
Bắc thơm số 7, Khang dân 18 và Hƣơng thơm ) đều bị nhiễm bệnh [9]. Cho tới giƣ̃a
tháng 9, một số đi ̣a phƣơng ta ̣i miền Bắc nhƣ Nam Đi ̣nh , Thái Bình cũng thông báo
dịch bệnh tƣơng tự [2].
Báo cáo tại cuộc họp do bộNông Nghi ệp và Phát Triển Nông Thôn
(NN&PTNT) chủ trì ngày 23/9 cho biết từ ngày 16-19/9, Cục Bảo Vệ Thực Vật
(BVTV) đã kiểm tra và lấy mẫu tại một số tỉnh ở miền Bắc. Cục đã phát hiện 5 tỉnh có
diện tích lúa nhiễm bệnh gồm Ngh ệ An, Thanh Hóa, Nam Định, Thái Bình và Ninh
Bình với trên 13 nghìn ha lúa nhiễm bệnh, trong đó hơn 8 nghìn ha bị bệnh rất nặng, có
khả năng mất trắng [3].
Để làm rõ nguyên nhân gây bê ̣nh t ại Nghệ An, đặc biệt khi bệnh đang đƣợc
liên tục báo cáo xuất hiê ̣n ta ̣i nhiều tỉnh miền Bắc , ngày 4/9/2009, Bộ NN &PTNT đã
tổ chƣ́ c hội thảo khẩn cấp về nguyên nhân gây bê ̣nh ta ̣i Nghê ̣An do đích thân Bộ
trƣởng Cao Đƣ́ c Phát chủ trì với sƣ̣ tham gia của các chuyên gia đầu ngành cả nƣớc và
Tiến sĩ Rogelio, chuyên gia về bê ̣nh virus lúa của Viê ̣n nghiên c ứu lúa quốc tế (IRRI).
Dƣ̣a chủ yếu vào triê ̣u chƣ́ ng quan sát bê ̣nh trên thƣ̣c đi ̣a và ý kiến chuyên gia , hội nghi ̣
kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lụi ta ̣i Nghê ̣An là do 2 virus gây bê ̣nh vàng lùn / lùn xoắn lá
giống nhƣ ở miền Nam với vector truyền bê ̣nh là rầy nâu . Các kết quảxét nghi ệm
ELISA trên các mẫu rầy nâu thu thâ ̣p đƣợc thƣ̉ nghiê ̣m ta ̣i IRRI và Trung tâm BVTV
phía Nam, Bộ NN &PTNT và Cục BVTV v ẫn kết luâ ̣n nguyên nhân gây bê ̣nh lúa lùn
lụi ở miền Bắc là do 2 virus vàng lùn và lùn xoắn lá và do rầy nâu lan truyền [4].

7
Trong tháng 9, 10 năm 2009, các hoạt động nghiên cứu nhằm xác đin h tác nhân
gây bê ̣nh đã đƣợc thƣ̣c hiê ̣n tích cƣ̣c ta ̣i các cơ quan nhƣ Viê ̣n BVTV , Cục BVTV,
Trƣờng ĐHNN Hà Nội và Viê ̣n Nghiên c ứu lúa quốc tế (IRRI). Kết quả nghiên cứu đã
xác định tác nhân gây bê ̣nh lùn l ụi lúa tại Nghệ An và các tỉnh phía bắc trong vụ mùa
2009 là do SRBSDV [9]. Ngay sau khi tác nhân gây bệnh đƣợc xác định, Bộ
NN&PTNT đã thành lập ban chỉ đạo phòng chống dịch lùn sọc đen do thứ trƣởng Bùi
Bá Bổng làm trƣởng ban chỉ đạo.
Trong vụ mùa 2010, cũng theo thông báo của Cục BVTV, tính đến tháng 10,
bệnh lùn sọc đen cũng vẫn phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành tổng diện tích bị nhiễm
tính từ đầu vụ là 24.000 ha, trong đó diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và phải tiêu hủy
là 1.700 ha. Các tỉnh có xuất hiện bệnh lùn sọc đen bao gồm:
+ Bắc Bộ (19 tỉnh): Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Lạng Sơn, Sơn La,
Bắc Giang, Hải Dƣơng, Điện Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bắc Ninh; Hải Phòng, Hòa
Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Hƣng Yên, Cao Bằng và Hà Nam.
+ Bắc Trung Bộ (6 tỉnh): Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Quảng Trị,
Hà Tĩnh và Thanh Hóa.
+ Duyên Hải Nam Trung Bộ (3 tỉnh): Quảng Nam, Quảng Ngãi và Đà Nẵng.
Đến năm 2013, bệnh lùn sọc đen đã tạm thời lắng xuống, chỉ còn rải rác ở một
vài tỉnh thành. Tuy nhiên, bệnh vẫn chƣa đƣợc phòng trị hoàn toàn, có nhiều khả năng
tái bùng phát thành dịch.
1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam
1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết
Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm virus SRBSDV rất giống với biểu hiện của
bệnh lùn sọc đen do virus RBSDV gây ra. Triệu chứng chung của lúa nhiễm bệnh bao
gồm: cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách
mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt
sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân. Các u sáp này đƣợc hình thành do sự phát triển vƣợt trội

8
cả về số lƣợng và kích thƣớc của mô mạch dẫn nhựa. Khi cây còn non gân chính trên
bẹ lá cũng bị sƣng phồng. Từ giai đoạn làm đòng và khi có lóng, cây bị bệnh thƣờng
nảy chồi trên đốt thân và mọc nhiều rễ bất định. Trên bẹ và lóng thân xuất hiện nhiều u
sáp và sọc đen (rất dễ nhận thấy u sáp khi dùng tay vuốt nhẹ thân). Cây lúa bị bệnh
nặng không trổ bông đƣợc hoặc trổ bông không thoát, hạt thƣờng bị đen [11] (Hình 1).
Hình 1: Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam[11]
1.2.2.2. Vector truyền bệnh
Vector chính truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam là rầy lƣng trắng (Sogatella
furcifera). Cả rầy non và rầy trƣởng thành đều có khả năng truyền bệnh. Rầy lƣng
trắng sau khi đã chích hút nhựa cây bị bệnh mang virus có thể truyền virus gây bệnh
đến khi chết. Một nghiên cứu về phƣơng thức lan truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam
ở lúa đã đƣợc tiến hành nhằm đánh giá khả năng lan truyền virus SRBSDV qua vector
đã đƣợc thực hiện trên 3 loài rầy là rầy lƣng trắ ng (Sogatella furcifera), rầy nâu
(Nilaparavata lugenes) và rầy nâu nhỏ (Laodelphax striatellus). Kết quả cho thấy cả
rầy lƣng trắng và rầy nâu nhỏ đều có khả năng truyền SRBSDV tƣ̀ lúa sang lúa với
hiê ̣u quả truyền rất cao (100 % cây nhiễm bê ̣nh với chỉ 3 – 4 rầy/cây). Tuy nhiên, chỉ

9
có rầy lƣng trắng (Hình 2) mới có khả năng truyền SRBSDV tƣ̀ lúa sang ngô . Nghiên
cƣ́ u này cũng cho thấy rầy nâu không thể truyền đƣợc SRBSDV [36,38,39].
Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV[11]
Rầy lƣng trắng gây hại cùng với rầy nâu nhỏ, nhƣng trong cùng một lứa thì rầy
lƣng trắng phát sinh rộ sớm hơn. Rầy lƣng trắng thƣờng có mật độ cao, gây hại nặng
vào giai đoạn lúa làm đòng. Cũng nhƣ rầy nâu, rầy lƣng trắng thích hợp với điều kiện
khí hậu ấm nóng, ẩm độ cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở vùng Đồng bằng sông Hồng, một
năm có 6-7 lứa rầy, quan trọng nhất là lứa rầy vào tháng 4 (vụ xuân) và cuối tháng 8
đầu tháng 9 (vụ mùa). Vụ xuân thƣờng gây hại nặng hơn vụ mùa. Rầy lƣng trắng hại
nặng trên các giống lúa nhiễm rầy, lúa lai; nếu thâm canh cao, bón nhiều đạm, ruộng
lúa cấy dày, rậm rạp là điều kiện cho rầy lƣng trắng phát sinh, phát triển. Rầy lƣng
trắng phân bố rộng rãi trên khắp các vùng trồng lúa của Việt Nam và trên thế giới, có
khả năng du nhập và di chuyển rất cao [7].
Một nghiên cứu về đặc tính lây truyền SRBSDV của rầy lƣng trắng Sogatella
furcifera đã đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc thực hiện nhằm xác định các giai đoạn
phát triển của bệnh cũng nhƣ tìm phƣơng pháp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất. Bằng
phƣơng pháp RT-PCR, các nhà khoa học đã xác định đƣợc sự có mặt của virus
SRBSDV trong tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của S. furcifera, bao gồm cả
giai đoạn ấu trùng, rầy cánh dài và rầy cánh ngắn S. furcifera khi đã nhiễm virus
SRBSDV sẽ có khả năng truyền virus cho cây lúa trong suốt vòng đời còn lại. Tuy
nhiên, virus SRBSDV không truyền qua giai đoạn trứng. Mỗi cá thể rầy S. furcifera
mang virus SRBSDV trung bình có thể lây nhiễm cho 48-50 cây lúa, tối đa là 87-90
cây lúa. Thời gian tối thiểu và tối đa để rầy nâu lƣng trắng truyền virus cho cây lúa non
Rầy cánh dài Rầy cánh ngắn

10
tƣơng ứng là 5-7 phút và 10-12 phút, tùy theo từng giai đoạn phát triển của rầy. Kết
quả nghiên cứu cũng chứng tỏ giai đoạn lúa non là giai đoạn dễ bị nhiễm virus
SRBSDV từ rầy nâu lƣng trắng nhất[29].
Ngoài cây lúa, virus SRBSDV còn gây hại trên ngô, cỏ lồng vực, cỏ chát, cỏ
đuôi phụng, vì các cây này là vật chủ của rầy lƣng trắng và cũng là nguồn chứa virus
để rầy lƣng trắng truyền sang cây lúa. Bệnh cũng có thể lƣu tồn trên lúa chét của cây
lúa bị bệnh trƣớc đó. Virus gây bệnh tồn tại trong cơ thể rầy lƣng trắng sống qua mùa
đông hoặc di chuyển rất xa theo gió và bão để gây bệnh cho lúa và một số loài cây
khác ở các vùng khác hoặc vụ tiếp theo [29].
1.2.3. Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV
1.2.3.1. Phân loại
Dựa trên các phân tích phân tử, virus SRBSDV đƣợc xếp là một thành viên
mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc họReoviridae.
Họ Reoviridae: Các virus thuộc họ Reoviridae (đƣợc gọi chung là các Reovirus)
đƣợc đặc trƣng bởi có bộ gene RNA sợi kép (dsRNA), phân đoạn bao gồm 10 đến 12
phân tử RNA sợi kép mạch thẳng. Tất cả các phân tử RNA đều đƣợc lắp ráp trong cùng
một phân tử virus hình cầu. Họ Reoviridae là một họ đa dạng về ký chủ. Trong số 12
chi của họ, có tới 8 chi hại ngƣời và động vật, một chi hại nấm và 3 chi gây hại thực
vật là (1) Phytoreovirus (ví dụ virus lúa lùn RDV (Rice dwarf virus)), (2) Oryzavirus
(ví dụ virus lúa lùn xoắn lá RRSV (Rice ragged stunt virus), (3) Fijivirus (ví dụ virus
lúa lùn sọc đen RBSDV (Rice black streaked dwarf virus))[30].
Chi Fijivirus: Các virus thuộc chi Fijivirus đƣợc đặc trƣng bởi có phân tử virus
hình khối đa diện đối xứng 20 mặt (icosahedral) và nhìn dƣới kính hiển vi điện tử có
dạng hình cầu, kích thƣớc 65-70 nm. Phân tử virus có cấu trúc phức tạp, gồm 2 lớp vỏ
(với lớp vỏ ngoài có số tam giác T = 13 còn lớp vỏ trong có T = 2). Trên bề mặt phân
tử, ở mỗi lớp vỏ đều có 12 gai vỏ (Hình 3)
Tất cả các Fijivirus đã biết đều có b ộ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA sợi

11
kép, mạch thẳng. Các phân tử RNA này có kích thƣớc dao động tƣ̀ 1,4 kb đến 4,5 kb và
đƣợc đă ̣t tên lần lƣợt tƣ̀ S 1 đến S 10 theo tốc độdi chuyển khi đi ện di PAGE
(Polyacrylamide). Các phân tử RNA genome đều mã hóa cho 1 gen, ngoại trừ phân
đoạn 7 và 9 mã hóa 2 gen (Hình 4) [30].
Hình 3.Cấu trúc phân tử các Fijivirus [30]
Đối với các Fijivirus, phần lớn chức năng của các gen chƣa đƣợc nghiên cứu
ngoại trừ gen VP10 (trên phân đoạn S10) mã hóa protein tạo gai vỏ của virus và VP1
(trên phân đoạn S1) mã hóa cho protein tái bản của virus là RdRp (RNA dependent
RNA polymerase) [30].
Hình 4.Tổ chức bộ gen của các Fijivirus [30]

12
Chi Fijivirus là 1 trong 3 chi gây hại thực vật thuộc họ Reoviridae. Hiện nay, chi
Fijivirus đƣợc ghi nhận gồm 9 loài trong đó Fiji disease virus (FDV) là loài điển hình.
Ngoài ra, căn cứ vào mức đồng nhất của bộ gen, các Fijivirrus lại đƣợc chia thành 5
nhóm (phụ lục 2) [10].
Nhóm Fijjivirus-2 là nhóm lớn nhất trong chi Fijjivirus, gồm MRCV, PaSV,
RBSDV và SRBSDV (phụ lục 2), các thành viên của nhóm Fijjivirus-2 có nhiều đặc
điểm di truyền và sinh học tƣơng đồng hơn hẳn so với 5 nhóm còn lại trong chi
Fijjivirus.
1.2.3.2. Đặc điểm hình thái của SRBSDV
Virus SRBSDV có hình thái điển hình của chi Fijivirus là dạng hình cầu đa diện đối
xứng icosahedral [38] Đƣờng kính lớp vỏ ngoài là ~ 70 nm, trên bề mặt vỏ ngoài có 12
gai ngắn gắn trên 12 đỉnh của hình đa diện icosahedra kiểu T=13. Hình đa diện
icosahedra T=13 cấu tạo từ 60 mặt tam giác, mỗi mặt tam giác là 13 phân tử protein,
tạo thành 12 pentamer tƣơng đƣơng với 120 capsomer lục giác (Hình 5) [15].
Hình 5:Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 [41]
1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV
Theo một nghiên cứu về SRBSDV gây bệnh ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc, virus
SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc họ Reoviridae. Hệ

13
gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến
4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn RNA
sợi đôi (Hình 6). Phân đoạn S1 có chiều dài 4500 bp, mã hóa một polypeptide (chứa
các vùng chức năng của enzym RNA polymerase) có trọng lƣợng phân tử 169 kDa.
Phân doạn S2 có chiều dài 3815 bp, chứa một ORF mã hóa một protein vỏ virus có
trọng lƣợng phân tử 141 kDa (chƣa xác định rõ chức năng). Phân đoạn S3 có chiều dài
3618 bp, chứa một ORF mã hóa một protein có trọng lƣợng phân tử 141 kDa (chƣa xác
định rõ chức năng) và có điểm đẳng điện Pi là 5,96. Phân đoạn S4 có chiều dài 3618
bp, chứa một ORF mã hóa một protein có vùng trình tự từ acid amin 608 – 786 tƣơng
đồng 22 – 25% với các thành viên khác của reovirus. Phân đoạn S5 có chiều dài 3167
bp, chứa một ORF chính và một ORF mã hóa một protein (chƣa xác định rõ chức
năng) trọng lƣợng phân tử 24 kDa chồng lên ORF chính. Phân đoạn S6 có chiều dài
2651 bp, mã hóa một protein có trọng lƣợng phân tử 90 kDa và có điểm đẳng điện
4,89. Đây là phân đoạn có sự khác biệt lớn nhất về trình tự nucleotide so với các thành
viên trong phân nhóm Fijivirus-2 (70,6% tƣơng đồng so với RBSDV và 62,4% tƣơng
đồng so với MRCV). Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF có chiều dài
1073 và 930 nucleotide mã hóa hai protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 40,5
kDa và 36,4 kDa. Phân đoạn S8 có chiều dài 1928 bp, chứa một ORF có chiều dài
1776 nucleotide mã hóa protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 67.9 kDa. Phân
đoạn S9 có chiều dài 1899 bp, chứa hai ORF có chiều dài 1044 và 630 bp, mã hóa hai
protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 39,9 kDa và 24,2 kDa. Phân đoạn S10 có
chiều dài 1797 bp, chứa một ORF có chiều dài 1674 nucleotide mã hóa protein hình
thành lớp vỏ ngoài của phân tử virus có tr ọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 62,6 kDa và
36,4 kDa. [37,22]. Trong một nghiên cứu khác, hệ gen virus SRBSDV gây bệnh trên
lúa ở tỉnh Hải Nam Trung Quốc đã đƣợc phân lập và giải trình tự. Kết quả là trình tự
nucleotide của hai phân đoạn S9 và S10 có độ tƣơng đồng 98-99% so với chủng Quảng
Đông [22]. Nếu so sánh toàn bộ hệ gen thì hai chủng virus SRBSDV ở Quảng Đông và
Hải Nam có độ tƣơng đồng >97%. Nếu so sánh với các thành viên của phân nhóm

14
Fijivirus-2, hai chủng virus này chỉ có độ tƣơng đồng ở mức độ amino acid là 77-78%
so với RBSDV, 65% so với MRCV và 44% so với Fiji disease virus (FDV) [23]. Nhƣ
vậy sau 25 năm kể từ khi dịch virus lùn sọc đen bùng phát lần cuối cùng tại Trung
Quốc vào năm 1975, trình tự nucleotid của hệ gen virus lùn sọc đen đã thay đổi hơn
20%.
Hình 6: Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV trên gel
polyacrylamide 12,5%[37].
1.2.3.4. Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV
SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc họ Reoviridae.
Hệ gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8
đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn
RNA sợi đôi [17]. Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF không chồng gối
lên nhau: ORF 7-1 có chiều dài 1073 và ORF 7-2 có chiều dài 930 nucleotide lần lƣợt
mã hóa hai protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 40,5 kDa và 36,4 kDa [33].
Phân đoạn S7 có phần không dịch mã ở đầu 5„ dài 40bp, phần không dịch mã ở
đầu 3„ dài 81bp và vùng intron dài 51bp, trình tự bảo thủ ở hai đầu S7 là 5‟-
AAGTTTTT và CAGCTGATGTC-3„. Ngoài ra, SRBSDV tồn tại đặc điểm đặc trƣng

15
cho chi Fijivirus, sát những vùng bảo thủ này tồn tại những đoạn lặp lại liền kề, ở phân
đoạn S7 chúng tồn tại ở những trình tự 5′-TTTCGACCT……AGGTCGA AA-3′
[36,38,39].
Một nghiên cứu về các chủng SRBSDV đƣợc phát hiện trên các mẫu bệnh ở
Sơn Đông, Quảng Đông và Hải Nam, Trung Quốc cho thấy có sự tƣơng đồng lớn giữa
hai ORF của phân đoạn S7 ở SRBSDV với phân đoạn tƣơng ứng của FDV, OSDV,
NLRV, MRCV, MRDV và RBSDV. Đặc biệt, ORF 7-1 của phân đoạn S7 ở SRBSDV
có mức độ tƣơng đồng trung bình với các virus trên lớn hơn hẳn so với bất kì phân
đoạn nào còn lại, lớn nhất là 81% amino acid tƣơng đồng với RBSDV [34,36,37]. Điều
này cho thấy có sự liên hệ giữa phân đoạn S7, đặc biệt là ORF 7-1 với khả năng tiến
hóa của SRBSDV [33].
Trong hai gen của phân đoạn S7, một nghiên cứu gần đây cho thấy, gen 7-1 mã
hóa cho protein P7-1 chịu trách nhiệm tạo thành các cấu trúc ống (tubular) cho phép
virus di chuyển qua tế bào biểu mô ruột của vector truyền bệnh (rầy Sogatella
furcifera) [25,28]. Các protein P7-1 đƣợc tìm thấy dày đặc trong các cấu trúc ống ở bề
mặt tế bào Sogatella furcifera mang virus và gen 7-1 cũng có chức năng giúp các
protein này tự lắp ráp tạo thành các cấu trúc ống (tubular) [34] (Hình 7). Điều này cho
thấy gen 7-1 mã hóa cho protein P7-1 liên quan đến tính tƣơng tác đặc hiệu với vector
trung gian truyền bệnh là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan
trọng trong sự tiến hóa của virus.
Hiện nay, chức năng của gen 7-2 ở SRBSDV chƣa đƣợc công bố. Tuy nhiên, một
nghiên cứu về RBSDV, họ hàng gần với SRBSDV, trên vật chủ là cây ngô (Zea mays)
cho thấy gen 7-2 quy định protein P7-2 có khả năng tƣơng tác với một tiểu đơn vị lõi
của SCF ubiquitin ligase trong phức hợp SCF [32], có chức năng quan trọng trong chu
trình tế bào và chịu trách nhiệm chỉ định tiêu hủy nhiều loại protein [31]. Chức năng
này ở SRBSDV cần đƣợc nghiên cứu xa hơn để làm rõ vai trò của gen trong sự tiến
hóa của virus.

16
Hình 7: Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh
(rầy Sogatella furcifera) dưới kính hiển vi điện tử [34]
1.2.3.4. Chuẩn đoán virus SRBSDV.
Việc phát hiện bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam khi gieo trồng lúa không quá khó
khăn do cây lúa bệnh có biểu hiện khá rõ. Tuy nhiên, việc phân biệt bệnh do virus
SRBSDV và bệnh do RBSDV rất khó thực hiện bằng cách quan sát hình thái bên
ngoài, do cả 2 bệnh đều có chung những đặc điểm về triệu chứng bệnh. Cho đến nay,
công tác chẩn đoán bê ̣nh virus trên lúa nhìn chung v ẫn khá phƣ́ c ta ̣p . Hiê ̣n nay , kỹ

17
thuâ ̣t chẩn đoán bê ̣nh virus phổ biến nhất vẫn là phƣơng pháp ELISA và phản ƣ́ ng
trùng hợp chuỗi (RT-PCR và PCR).
Theo công bố mới nhất năm 2012, Zhenchao Wang và cộng sự đã phát triển một
phƣơng pháp phát hiện nhanh virus SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh, sử sụng kĩ
thuật DOT-ELISA. Phƣơng pháp của Z.Wang sử dụng loại kháng thể đa dòng đặc hiệu
cho protein vỏ của viurs SRBSDV (mã hóa bởi phân đoạn S10) để phát hiện sự có mặt
của SRBSDV trong mẫu lúa bệnh. Kết quả xét nghiệm trên 100 mẫu lúa bằng phƣơng
pháp này cho kết quả tƣơng đồng với kết quả xét nghiệm bằng phƣơng pháp RT-PCR
(Hình 8). Phƣơng pháp DOT-ELISA này khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm của
phƣơng pháp xét nghiệm truyền thống bằng RT-PCR, đồng thời vẫn có độ chính xác
cao, cho phép phát hiện sớm virus SRBSDV [11].
Hình 8: Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phương pháp DOT-ELISA[11]
1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam và virus SRBSDV ở
Việt Nam
1.2.4.1. Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV
Ngày 27/9/2009, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (ĐH Nông Nghiệp Hà Nội) đã
nhâ ̣n đƣợc yêu cầu của Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu 2 (thuộc Cục BVTV) yêu
cầu thƣ̉ các mẫu lúa thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣An (60 mẫu). Các thử nghiệm ELISA với kháng

18
huyết thanh do Trung tâm sản xuất cũng nhƣ RT -PCR với mồi đă ̣c hiê ̣u do Trung tâm
thiết kế đã cho thấy các mẫu lúa bệnh thu tại Nghệ An không bị nhiễm 2 virus gây bê ̣nh
VL/LXL nhƣ ở miền Nam.
Tuy nhiên khi chuẩn bi ̣mẫu bê ̣nh cho kiểm tra ELISA , nhóm nghiên cứu đã
quan sát thấy 2 đă ̣c điểm không bình thƣờng (ngoài các đặc điểm giống nhƣ cây bi ̣
bê ̣nh lùn xoắn lá lá bi ̣nhiễm bởi virus Rice ragged stunt virus (RRSV) ở miền Nam
nhƣ cây lùn, lá xanh đậm, ngọn lá xoắn vặn):
(1) Cây bê ̣nh không biểu hiê ̣n triê ̣u chƣ́ ng táp và biến vàng ta ̣i một bên của mép lá
ở các lá bi ̣xoắn vă ̣n . Đây là một triê ̣u chƣ́ ng luôn đƣợc quan sát thấy trên cây bi ̣bê ̣nh
lùn xoắn lá bị nhiễm bởi virus RRSV.
(2) Có nhiều nốt phồng nhỏ màu trắng tới nâu chạy dọc gân của thân cây lúa sau khi
bóc lớp bẹ bên ngoài. Các nốt phồng này đặc biệt nhiều ở phần lóng sát gốc.
Các mẫu đƣợc thu thập tiếp theo tại Nam Định , Thanh Hóa, Sơn La cũng đều có
triê ̣u chƣ́ ng tƣơng tƣ̣ mẫu Nghê ̣An.
Dƣ̣a trên 2 triê ̣u chƣ́ ng trên , đă ̣c biê ̣t là triê ̣u chƣ́ ng thƣ́ 2, tác nhân gây bệnh đã
đƣợc dƣ̣ đoán là do một reovirus (họ Reoviridae) gây ra . Các triệu chứng này khá
giống với 2 reovirus là Rice black streaked dwarf virus (RBSDV) và Southern rice
black streaked dwarf virus (SRBSDV) = Rice black streaked dwarf virus 2 (RBSDV2).
Để kiểm tra liê ̣u mẫu lúa bê ̣nh miền Bắc có bi ̣nhiễm RBSDV và SRBSDV hay không ,
một că ̣p mồi cho phép phát hi ện đồng thời cả 2 virus này đã đƣợc thiết kế dƣ̣a trên
vùng bảo thủ gene S10 của tất cả các chủng sẵn có của 2 virus trên Ngân hàng gen.
Kết quả kiểm tra RT-PCR cho thấy các mẫu bê ̣nh thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣An và một số
đi ̣a phƣơng miền Bắc nhƣ Thanh Hóa , Nam Đi ̣nh, Sơn La đều cho phản ƣ́ ng RT -PCR
dƣơng đối với mồi đă ̣c hiê ̣u RBSDV và SRBSDV nhƣng không phản ƣ́ ng với mồi đă ̣c
hiê ̣u virus lùn xoắn lá (RRSV).
Bốn sản phẩm RT -PCR đa ̣i diê ̣n cho Nghê ̣An , Nam Đi ̣nh, Thanh Hóa và Sơn
La đã đƣợc giải trình tƣ̣ trƣ̣c tiếp . Kết quả phân tích trình tƣ̣ và ph ả hệ cho thấy cả 4
mẫu này đều là virus lùn s ọc đen phƣơng Nam (SRBSDV). Ngoài ra, nghiên cứu hiển

19
vi điện tử cũng phát hiện thấy phân tử virus và thể vùi của virus trong mô cây lúa bị
bệnh.Dƣ̣a trên kết quả nghiên cứu này, Trung tâm đã bƣớc đầu kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lụi
tại miền Bắc là do virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV) gây ra [18,25,19,17].
Trong cùng thời gian, các nghiên cứu tƣơng tự cũng đƣợc tích cực thực hiện tại
Viện Bảo Vệ thực vật (BVTV). Nhóm nghiên cứu Viện Bảo Vệ thực vật cũng hợp tác
chặt chẽ với chuyên gia Trung Quốc và Pháp để xác định tác nhân gây bệnh dựa trên
RT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR và hiển vi điện tử .
Căn cứ vào đặc điểm triệu chứng bệnh trên cây, đặc điểm hình thái, kích thƣớc
tiểu thể virus trên kính hiển vi điện tử và kết quả lây bệnh nhân tạo nhằm khẳng định
nguyên tắc Koch, cũng nhƣ giải trình tự sản phẩm PCR trên phân đoạn S10 và S3 của
hệ gene virus, nhóm nghiên cứu Viện BVTV cũng xác định tác nhân gây bệnh là virus
lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV)[10].
Ngoài ra, các nghiên cứu lan truyền thực hiện tại Viện Bảo vệ Thực vật cũng
xác định đƣợc môi giới truyền bệnh là rầy lƣng trắng giống nhƣ nghiên cứu của các tác
giả Trung Quốc.
Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại
Việt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phƣơng
Nam (SRBSDV).
1.2.4.2. Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV
Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình chẩn đoán
SRBSDV bằng phƣơng pháp PCR/RT-PCR. Quy trình bao gồm các bƣớc: Giải trình tự
sản phẩm PCR vùng gen bảo thủ có chiều dài 600 bp và phân tích trình tự gen sử dụng
chức năng BLAST trong ngân hàng gen để xác định độ tƣơng đồng với tất cả các trình
tự nucleic acid hiện có trong ngân hàng gen. Sau đó, gia phả trình tự gene thu đƣợc
đƣợc phân tích bằng phần mềm MEGA-4.1 với trình tự gen tƣơng ứng của các virus có
độ tƣơng đồng cao nhất cũng nhƣ các virus có cùng nhóm hoặc cùng phân nhóm và các
virus thuộc nhóm hay phân nhóm khác cùng họ[6].

20
Từ năm 2012 đến nay, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật - Viện Di truyền
Nông nghiệp và Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã phân
lập và giải trình tự toàn bộ phân đoạn S7, S9 và S10 của 13 chủng SRBSDV đại diện
cho các vùng sinh thái trồng lúa từ miền Trung trở ra. Trên cơ sở phân tích trình tự hệ
gene phân đoạn S10 của các chủng vius đã thiến kế cặp mồi đặc hiệu cho chủng
SRBSDV ở Việt nam và phát triển quy trình chẩn đoán dựa trên kỹ thuật RT-PCR.
Nghiên cứu đã tối ƣu hóa đƣợc phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số, thiết kế đƣợc cặp
mồi đặc hiệu dùng trong chẩn đoán SRBSDV, tối ƣu đƣợc loại mẫu và vị trí xét
nghiệm, tối ƣu loại phản ứng RT-PCR dùng trong xét nghiệm SRBSDV và thời gian
RT-PCR tƣơng ứng [5,12]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã nghiên cứu cơ sở khoa
học của việc chẩn đoán SRBSDV bằng kỹ thuật kháng nghuyên kháng thể và đã (1) tạo
mẫu nhiễm bệnh, tinh sạch phân tử virus từ mẫu nhiễm bệnh và tạo thành công kháng
thể đa dòng SRBSDV và (2) tinh sạch và biểu hiện thành công protein vỏ P10, 2
polypeptide P1 và P2 trên protein P10 phục vụ cho việc tạo kháng thể đặc hiệu [5].

21
CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Mẫu lúa
Tổng số 51 mẫu lúa bệnh có những đặc điểm nhiễm bệnh điển hình của bệnh lúa
lùn sọc đen nhƣ cây lúa lùn, lá vặn xoắn, gốc thân có nốt, vết sần mầu trắng đến đen...
đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau của Việt Nam nhƣ: (1) đồng bằng
Bắc bộ, (2) Hà Nội và các tỉnh vùng ven, (3) Trung du và miền núi phía Bắc, (4) các
tỉnh Bắc Trung bộ và (5) các tỉnh Duyên hải Miền Trung đƣợc thu thậpphục vun cho
nghiên cứu.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm có:
- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng PCR nhân bản trình
tự S7 của SRBSDV do Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông
nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) thiết kế dựa trên trình tự S7 đã đƣợc
công bố trên Ngân hàng gen Thế giới (mã số EU 784841).
- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng RT-PCR một bƣớc
nhằm xét nghiệm sự có mặt của SRBSDV đƣợc thiết kế theo nghiên cứu của Zhou và
cs (2008) là SRBSDVS10F3/R3 (525bp) [39].
- Các bộ kít dùng trong nghiên cứu gồm: pGEM®-T Easy Vector (Promega);
GenJETTM
Gel Extraction (Thermo Scientific); RevertAidTM
First Strand cDNA
Synthessis (Thermo Scientific); kít ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV,
RGSV, RTBV, RTSV, RGDV và RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông
nghiệp Nhật Bản chuyển giao; kit Read-to-go của GE healthcare cho phản ứng RT-PCR
1 bƣớc; pJet1.2 cloning kit và first strand cDNA kit của Fermentas...
- Các enzyme dùng trong nghiên cứu gồm: Dream Taq DNA polymerase, T4
DNA ligase (Thermo Scientific)…

22
Bảng 1:Trình tự các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu.
Tên mồi Trình tự mồi
T7-Fw 5‟-AATACGACTCACTATAG-3‟
SP6-Rv 5‟-TATTTAGGTGACACTATAG-3‟
SRBSDVS10F3 5-TATTCAAAGTTATTTCCGT-3‟
SRBSDVS10R3 5-ACATGAATAGTTTCAAGT-3′
- Các hóa chất và d ụng cụ tiêu hao khác dùng trong nghiên cứu: bột cellulose
CF11, SDS , Phenol, ống PCR 0,2 ml, đầu tip 2, 20, 200 và 1000 µl, chày cối sứ ... đạt
tiêu chuẩn cho Sinh học Phân tử.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu gồm: Máy PCR 9700 của hãng Applied
Biosystem, hệ thống điện di DNA của hãng Biorad, máy ly tâm Universal 30RF của
hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus, máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader
của hãng UVItec, máy giải trình tự ABI 3100, .
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Thu mẫu
Những mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh đặc trƣng (nhƣ cây lùn, lá xanh đậm,
xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các
đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân) đƣợc thu thập trên đồng ruộng tại các
tỉnh thành miền Bắc và miền Trung.
2.2.2. Xét nghiệm mẫu
2.2.2.1. Phương pháp Sandwich ELISA
Nguyên tắc:
Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp
thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa

23
trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn
với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate)
vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu
chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua
cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ
peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi
khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay). Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta
xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So
với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và
an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. ELISA đƣợc dùng để xác định
nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh...
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng
thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng
oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của
hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Tiến hành:
- Mẫu khi lấy về trữ ở -20o
C, chọn những lá vừa không non cũng không già,
phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn chỉ
thấy dạng dung dịch. Sau đó đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận.
- Mẫu sau đó đƣợc đem ly tâm tốc độ 5000vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt
độ 4o
C, dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và
cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng) và giữ ở 4o
C.
Sử dụng bộ kit ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV, RGSV, RBTV,
RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản chuyển giao, quy trình
ELISA đƣợc tiến hành nhƣ sau:

24
- Đĩa và sơ đồ bố trí đƣợc chuẩn bị. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối
chứng dƣơng. Pha loãng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer). Trên
mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng
là 30ml, do đó phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha loãng 140µl kháng thể
vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trƣớc khi dùng. Hút 100µl
dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37o
C
trong 2 giờ.
- Hỗn hợp đƣợc rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi
lần 3 phút. Sau đó, mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hoà tan với 1ml nƣớc cất, hút
100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các
giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4o
C qua đêm.
- Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút. Sau đó, pha kháng thể
có gắn enzyme vào dung dịch đệm (tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2). Hút 100µl
dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau
đó đem ủ ở 37o
C trong 2 giờ.
- Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút. Sau đó, hoà tan pNPP
trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP, chờ 5 phút
để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100µl hỗn hợp cho vào mỗi giếng,
dán băng keo lại. Ủ hỗn hợp ở 37o
C trong 30 phút.
- Kết quả đƣợc đọc bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ
+ Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu dƣơng tính với
kháng nguyên.
+ Những giếng không màu: giếng chứa mẫu âm tính với kháng nguyên.
Các mẫu cho kết quả âm tính với kháng nguyên của RRSV, RGSV, RBTV,
RBSDV sẽ đƣợc phân loại riêng để tiếp tục phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.

25
2.2.2.2. RT-PCR một bước
Nguyên tắc
cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA dƣới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngƣợc
(reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn
mRNA. Sợi kép RNA/DNA sẽ tách nhau ra dƣới tác động của nhiệt độ cao, giải phóng
sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi đơn cDNA thứ hai
để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh.
Tiến hành:
Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành
tổng hợp cDNA sợi đôi từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm
bệnh lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau:
Thành phần phản ứng:
Mồi xuôi 10 pmol : 1 µl
Mồi ngƣợc 10 pmol : 1 µl
RNA sợi đôi : 0.3 µl
Đệm 10X : 1.5 µl
dNTP 10 mM : 1.5 µl
Reverse transcriptase (200u/µl) : 0.5 µl
Taq DNA polymerase (5u/ µl) : 0.2 µl
RiboLockTM
RNase Inhibitor (20u/µl) : 0.3 µl
ddH2O : 8.7 µl
Tổng thể tích : 15µl
Phản ứng RT-PCR một bƣớc đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau:

26
Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC
cho đến phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel
agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1%
Nguyên tắc:
Điện di là một quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch
dƣới tác dụng của điện trƣờng. DNA là phân tử tích điện âm nên trong môi trƣờng
trung tính hoặc kiềm, dƣới tác dụng của điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển theo chiều từ
cực âm sang cực dƣơng. Các phân tử DNA sẽ chuyển động với vận tốc khác nhau phụ
thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thƣớc của chúng. Do vậy phƣơng pháp điện di
đƣợc sử dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc, hình dạng khác nhau.
Tiến hành:
Sau khi gel agarose 1% đƣợc chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 l mẫu DNA
đƣợc trộn với 1 l loading dye 6X có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu
bromophenol xanh, xylene cyanol và ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 g/ml và
tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến
khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel
đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel (Firereader-UVITEC),
các đoạn DNA gắn với EtBr đƣợc biểu hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel
màu đen.
Các mẫu điện di lên băng dƣơng tính với SRBSDV đƣợc giữ lại để tiếp tục tiến
hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11
Nguyên lý:
Các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) có đặc tính bám vào cột CF-11 trong điều
kiện môi trƣờng đệm STE có chứa 16.5% EtOH và mất khả năng bám cột trong môi

27
trƣờng đệm STE không chứa EtOH. Vì vậy hệ gen virus đƣợc tách ra khỏi hệ gen và
RNA của lúa bằng phƣơng pháp chạy qua cột CF-11.
Tiến hành:
Quy trình phân lập hệ gen của SRBSDV đƣợc thực hiện theo những bƣớc sau:
- Nghiền nhỏ khoảng 1g mẫu lúa, chuyển mẫu đã đƣợc nghiền sang ống falcol
sạch, bổ sung 10-20ml STE 2X vào mẫu để làm đệm cho phản ứng. Tiếp tục bổ sung
vào hỗn hợp 2ml SDS 10% và lắc đều. Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp 10ml phenol đã
bão hòa, lắc nhẹ trong khoảng 45 phút.
- Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, chuyển dịch nổi sang ống
mới, thêm vào H2O đến thể tích 20ml. Sau đó, bổ sung 4ml EtOH tuyệt đối vào dung
dịch, tạo điều kiện để phân tử dsRNA bám vào cột (~16.5%EtOH)
- Cân 2g bột CF-11 vào cốc đong, bổ sung 10ml dung dịch STE 1X chứa 16.5%
EtOH. Sau đó, đƣa hỗn hợp lên cột và tiếp tục bão hòa cột bằng 10x10ml STE1X chứa
16.5% EtOH. Quá trình gắn cột xảy ra khi hỗn hợp mẫu (đã chuẩn bị) chảy từ từ qua
cột đã đƣợc bão hòa.
- Sau khi gắn cột, rửa cột bằng cách cho chảy từ từ qua cột 10x10ml STE 1X
chứa 16.5% EtOH
- Cột sau khi rửa, đẩy cột bằng cách cho chảy từ từ 10ml STE 1X không chứa
EtOH qua cột, làm mất khả năng bám cột của các phân tử dsRNA, thu dịch đẩy vào
ống Falcol sạch. Sau đó, tách hoàn toàn dsRNA bằng cách thêm 0,6V Isopropanol vào
dịch đẩy cột, lắc đều hỗn hợp, ủ ở -20o
C ít nhất 4h.
- Ly tâm dịch trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Rửa
cặn 2 lần bằng EtOh 70% để làm tan các muối. Sau đó, cặn đƣợc phơi trong không khí
đến khi khô và tiếp tục đƣợc hòa tan bằng 50µl H2O (cất 2 lần). Sản phẩm thu đƣợc
đƣợc giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.

28
2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA
2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi
Các phân đoạn S7 của các chủng SRBSDV trên thế giới có trên GeneBank đƣợc
tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tƣơng đồng bằng phần mềm MEGA5. Vùng bảo
thủ của các phân đoạn này sẽ đƣợc lựa chọn và sử dụng để thiết kế các cặp mồi đặc
hiệu cho phép nhân bản phân đoạn S7. Các cặp mồi có sẵn trình tự sẽ đƣợc chúng tôi
đặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma.
2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1
Nguyên tắc:
cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA dƣới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngƣợc
(reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn
mRNA. Sợi kép RNA/DNA đƣợc xử lý với kiềm hoặc ribonuclease (phân hủy sợi
khuôn RNA) để tạo thành sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, DNA polymerase I tổng hợp sợi
đơn cDNA thứ hai để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh.
Tiến hành:
Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành
tổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnh
lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau:
Thành phần phản ứng:
Mồi xuôi 10 pmol : 1 µl
Mồi ngƣợc 10 pmol: 1 µl
RNA sợi đôi : 1 µl
Đệm 5X : 4 µl
dNTP 10 mM : 2 µl
Reverse transcriptase (200u/µl): 1 µl
H2O : 10 µl
Tổng thể tích : 20µl

29
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 42o
C trong 60 phút. Sản phẩm phản ứng sau đó
đƣợc sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại các đoạn trình tự
đặc hiệu.
2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc Karl Mullis cùng cộng sự
phát minh năm 1985 và đƣợc tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất
enzyme DNA polymerase bền nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số loài
vi khuẩn khác.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả
năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase trong môi trƣờng thích hợp có dƣ
các dNTPs và cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng nhiều
triệu lần so với ban đầu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ đều có ba giai đoạn cơ bản:
 Giai đoạn biến tính (Denaturing): Tách DNA mạch kép thành dạng mạch
đơn ở nhiệt độ cao (94-95°C) trong thời gian ngắn.
 Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp với mạch
khuôn theo nguyên tắc bổ sung bằng cách hạ nhiệt độ xuống khoảng 30-65°C.
 Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extending): Nhờ hoạt tính của enzyme DNA
polymerase các dNTP đƣợc lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch
DNA khuôn bắt đầu từ đoạn mồi. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ 68-72°C. Thời
gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào kích thƣớc đoạn gen cần nhân bản.
Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC
cho đến khi phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên
gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.

30
Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi nhân trình tự phân đoạn S7 nhƣ sau:
Thành phần Thể tích
dd H2O 9,8 l
Đệm Taq DNA polymerase 10X 1,5 l
Taq DNA polymerase (5u/ µl) 0,5 l
dNTPs 2mM 1,5 l
Mồi xuôi 10 pmol 0,6 l
Mồi ngƣợc 10 pmol 0,6l
cDNA khuôn 0,5 l
Tổng thể tích 15 l
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau:
2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas
Bộ kit GenJETTM
Gel Extraction đƣợc thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA
từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn.
Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thƣớc từ 25 bp đến 20 kb, hiệu
suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb. Quy trình đƣợc
thực hiện ở nhiệt độ phòng nhƣ sau:
Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác bằng lƣỡi dao sạch từ gel agaros và
đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (binding buffer) đƣợc bổ sung vào với 1 thể
tích bằng khối lƣợng miếng gel (1 µl:1 mg) và ủ ở 0° trong 60°C trong khoảng 10
phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột
tinh sạch và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng đƣợc

31
gạn bỏ. 500 µ đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ly tâm 1 phút với vận
tốc 10.000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ. Lặp lại bƣớc này một lần
nữa. Cột tinh sạch có chứa DNA đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới và bổ
sung 100 µl Elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột. Ly tâm 1 phút với
tốc độ 10.000 vòng phút để thu DNA. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20° để sử
dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning
2.2.5.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T
Phân đoạn S7 đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq polymerase,
do đó sản phẩm tạo ra là các đoạn DNA có sẵn đầu A. Các đoạn DNA này dễ dàng
ghép nối vào vector pGEMT có đầu T nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng
gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT đầu T đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo
của bộ kit, với các thành phần nhƣ sau:
Thành phần Thể tích (µl)
Đệm phản ứng 2X 10 µl
Sản phẩm PCR 3 µl
Vector đầu T pGEMT-T 1 µl
T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl
H2O cất khử ion vô trùng 5 µl
Tổng thể tích 20 µl
Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm.
Plasmid pGEM-T có kích thƣớc khoảng 3kb có chứa trình tự mã hóa của
gen kháng chất kháng sinh ampicillin (Hình 9), nhờ đó các tế bào mang vector có
thể sinh trƣởng bình thƣờng ở môi trƣờng có chứa ampicillin với nồng độ ức chế
tối thiểu.

32
Hình 9: Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các enzyme cắt
giới hạn trên vector pGEM-T
Ngoài ra, vector này đƣợc thiết kế có gắn operon Lac chuyển hóa đƣờng lactose.
Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này và gen cấu trúc lacZ mã hóa cho
enzyme -galactosidase có vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (Hình 9).
Thiết kế này cho phép phân biệt đƣợc tế bào nào mang plasmid nguyên bản
(không gắn thêm sản phẩm PCR) và tế bào nào mang plasmid tái tổ hợp có gắn thêm
sản phẩm PCR. Đối với tế bào mang plasmid nguyên bản, gen lacZ hoạt động bình
thƣờng để tổng hợp enzyme -galactosidase nên khi bổ sung cơ chất X-gal và chất
cảm ứng IPTG vào môi trƣờng, enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm màu
xanh trong môi trƣờng có oxy. Đối với tế bào mang plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA lạ
xen vào giữa Lac-promoter và gen lacZ làm cho enzyme -galactosidase không đƣợc
tổng hợp nên khi có mặt X-gal và IPTG, quá trình chuyển hóa cơ chất không xảy ra và
không tạo ra sản phẩm màu xanh.
2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.coli chủng DH5α
Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) đƣợc làm tan
trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, 10 µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector
pGEM-T đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo
điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển
sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó đƣợc chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút.
Tiếp theo, 450µl LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C

33
trong vòng 20 phút trƣớc khi đƣợc nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong thời gian 30
phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ sung
ampicillin 100 µg/ml và ủ ở 37°C qua đêm.
2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM
Plasmid
Miniprep
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM
Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lắc trong 5ml môi trƣờng LB lỏng có bổ
sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế
bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4o
C. Tế bào
đƣợc hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme
RNase . Sau đó, 250 µl đệm P2 (lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào và đảo
nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Tiếp theo,
hỗn hợp đƣợc trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6 lần.
Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc
13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh
sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp
màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. Tiếp theo, 500 µl đệm rửa (Wash buffer)
đƣợc bổ sung và ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại
một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
50 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở
nhiệt độ phòng 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000
vòng/phút trong 1 phút.
Lƣợng plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.7. Cắt enzyme giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính sẽ đƣợc nuôi cấy để tách
chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.

34
Enzym cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử là những
enzyme endonuclease có khả năng nhận biết vị trí đặc hiệu trên DNA và phân hủy
liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi tại đó mà không gây tổn hại đến
bazơ nucleotide. Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn đƣợc cấu tạo từ 4 đến 6 đôi
bazơ và có cấu trúc đối xứng nghịch đảo. Enzym cắt giới hạn có thể cắt ngay chính
giữa trình tự nhận biết để tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng hoặc có thể cắt lệch tâm để
tạo ra hai đoạn DNA có kiểu đầu dính.
Phản ứng cắt giới hạn với EcoRI để kiểm tra sự có mặt của phân đoạn S7 trong
plasmid tái tổ hợp có thành phần nhƣ sau:
Thành phần Thể tích
pGEM-T/S7 3,0 µl
Đệm Fast Digest 10X 0,5 µl
Enzyme EcoRI (10u/µl) 0,5 µl
H2O khử ion vô trùng 1,0 µl
Tổng thể tích 5,0 µl
2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng
Nguyên tắc:Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi đƣợc nhân dòng vào vector
pGEM-T sẽ đƣợc đọc trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3100. Cụ thể, phản ứng PCR
đƣợc tiến hành qua 2 bƣớc: bƣớc PCR thông thƣờng để khuếch đại đoạn trình tự cần
đọc và bƣớc PCR cho xác định trình tự. Trong đó, phản ứng PCR thông thƣờng sử
dụng khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T mang đoạn gene đặc hiệu với cặp mồi T7-
Fw/SP6-Rv của vector. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch, pha loãng ở nồng độ
thích hợp và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR xác định trình tự. Về cơ bản, phản
ứng PCR này có các thành phần giống nhƣ PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác
biệt là sự có mặt của ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc).
Các ddNTP khác với các dNTP là thiếu một nhóm 3‟-OH nên khi đƣợc enzyme DNA
polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể hình thành liên
kết phosphodiester với nucleotide đƣợc đƣa vào kế tiếp và khiến cho quá trình kéo dài

35
chuỗi bị ngừng lại. Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới đƣợc đánh
dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ đƣợc tổng hợp và các sợi này có độ dài khác
biệt nhau một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp đƣợc phân tách trên gel điện di
acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đƣa ra
trình tự đoạn DNA gốc.Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống máy giải
trình tự ABI 3100. Kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh với các đoạn gene tƣơng ứng đã
đƣợc đăng ký trong ngân hàng gen để biết đƣợc mức độ tƣơng đồng giữa chúng.
2.2.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7
Từ các trình tự thu đƣợc của các phân đoạn S7 của các mẫu bệnh thu đƣợc tại
Việt Nam, chúng tôi tiến hành tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tƣơng đồng với
các trình tự tƣơng ứng của các chủng SRBSDV khác trên GeneBank. Từ đó, chúng tôi
xây dựng cây phân loại và phân tích các đặc điểm di truyền học cũng nhƣ mối quan hệ
của chủng virus thu đƣợc tại mẫu bệnh ở Việt Nam với các chủng gây bệnh lúa lùn sọc
đen trên thế giới (hiện nay bệnh mới chỉ đƣợc phát hiện tại Trung Quốc và Việt Nam).
Qua đó, mức độ tiến hóa của phân đoạn S7 của các chủng thu đƣợc và mức độ ảnh
hƣởng của protein mã hóa bởi phân đoạn này đến khả năng lây lan của bệnh đƣợc đánh
giá. Từ đó, chúng tôi có thể đƣa ra phƣơng án phòng bệnh hoặc dập dịch thích hợp.

36
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu thập và bảo quản mẫu
Các mẫu lúa bệnh đƣợc thu trực tiếp tại đồng ruộng, với những cây lúa có triệu
chứng điển hình: thân cây thấp, lá xanh đậm, xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có
những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các
đốt thân... (Bảng 2 và Hình 10). Trong đó, triệu chứng lớp u sáp trên thân hay sọc
phồng ở gân thân cây lúa (bên trong bẹ) là triệu chứng đặc trƣng duy nhất của bệnh
lùn sọc đen. Các mẫu sau khi thu thập sẽ đƣợc rửa sạch, loại bỏ phần héo úa, cắt nhỏ
và sử dụng ngay hoặc bảo quản khô trong các bình kín nhờ hạt hút ẩm silicagel.
Kết quả chúng tôi đã thu đƣợc 51 mẫu bệnh thuộc các tỉnh Ninh Bình, Sơn La, Hải
Phòng, Thái Bình, Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà
Tĩnh, Quảng Trị, Huế. Các mẫu đều đƣợc đánh số thứ tự theo từng tỉnh.
Bảng 2: Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa
STT Triệu chứng
1 Cây thấp lùn
2 Xoắn chót lá
3 Có nhiều vết nhăn ngang trên lá
4 Lá bị xoắn
5 Xoắn lá nõn
6 Sọc phồng ở gân phiến lá
7 Sọc phồng ở gân bẹ lá
8 Sọc phồng ở gân thân cây (bên trong bẹ) hay lớp u sáp trên thân
9 Bộ lá xanh đậm
10 Cây cứng
11 Trắng mép lá
12 Rách mép lá
13 Nhánh phụ
14 Đen hạt

37
ĐH (Đen hạt) GL (Gấp lá) L (lùn) NG (nhăn giữa lá) N (nghẹn lá) NP (Nhánh phụ)
NC (Nhăn chót lá) RN (rễ ngƣợc) RM (rách mép lá) SP (Sọc phiến) SB (Sọc bẹ) ST (Sọc thân)
PTH (Phồng tràng hạt) TM (trắng mép lá) VLX (Vàng lá xoắn) X (xoắn lá) XLN (Xoắn lá nõn) XC (Xoắn chót lá)
Hình 10. Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam

38
3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một
bƣớc
3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phương pháp Sandwich- ELISA
Sử dụng phƣơng pháp Sandwich-ELISA với quy trình và kit (IgG và conjugate) do
Tiến sỹ Omura tại Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản cung cấp chúng tôi đã tiến
hành kiểm tra mẫu bệnh với lần lƣợt từng loại virus RRSV, RGSV, RTBV, RTSV, RGDV,
RRBV và RBSDV. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Kết quả bƣớc đầu cho thấy số lƣợng mẫu nhiễm RTSV là 11/51 mẫu, số lƣợng mẫu
nhiễm RGSV là 6/51 mẫu, nhiễm RGDV là 4/ 51 mẫu, nhiễm RRSV là 4/51 mẫu, lƣợng
mẫu nhiễm RTBV là 3/51 mẫu, nhiễm RRBV rất ít, chiếm 1/51 mẫu, 5/51 mẫu nhiễm
RBSDV, ngoài ra còn có 5/51 mẫu nghi nhiễm RBSDV với phản ứng dƣơng tính không rõ
ràng (Hình 11). Sau kiểm nghiệm chỉ có 12 mẫu không có bất kỳ phản ứng dƣơng tính nào
với kiểm nghiệm ELISA, các mẫu này sau đó đƣợc chúng tôi kiểm nghiệm tiếp bằng
phƣơng pháp RT-PCR một bƣớc cùng với các mẫu có phản ứng dƣơng tính không rõ ràng
để khẳng định sự có mặt của SRBSDV với cặp mồi đặc hiệu cho virus này.
Hình 11. Một số kết quả kiểm tra ELISA với các mẫu thu thập ở các tỉnh Việt Nam

39
3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp RT-PCR 1 bước
Tất cả 17 mẫu sau khi đã đƣợc kiểm tra bằng kit ELISA không có phản ứng
dƣơng tính hoặc dƣơng tính không rõ ràng với bất kỳ kit phát hiện virus nào đã đƣợc
chúng tôi đi kiểm nghiệm bằng phƣơng pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu virus lùn
sọc đen phƣơng Nam là SRBSDVS10F3/R3 (725bp). Kết quả điện di kiểm tra cho thấy
phản ứng RT-PCR 1 bƣớc với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 có 12 mẫu có phản ứng
dƣơng tính với cặp mồi này (Hình 12A,B) . Sơ bộ chúng tôi cho rằng 12 mẫu bệnh này
có thể đƣợc sử dụng làm nguồn vật liệu phân lập hệ gen virus lùn sọc đen phƣơng nam
SRBSDV ở Việt Nam (Hình 12A&B).
Kết quả toàn bộ quy trình xét nghiệm đƣợc thể hiện trong bảng 3.
Hình 12. Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bƣớc của các mẫu lúa
A, B. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bước với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3
Giếng M: Marker; giếng 1: Mẫu Hải Phòng-3; giếng 2: Mẫu Huế-1; giếng 3: Mẫu Huế-2; giếng 4:
Mẫu Hòa Bình-2; giếng 5: Mẫu Nam Định-2; giếng 6: Mẫu Nam Định-1; giếng 8: Mẫu Nghệ An-1;
giếng 9: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 10: Mẫu Ninh Bình-3; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 12: Mẫu
Thái Bình-4; giếng 13: Mẫu Thái Bình-1; giếng 14: Mẫu Thái Bình-2
3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV
12 mẫu lúa bệnh thu đƣợc từ các vùng dịch, sau khi sàng lọc để chọn ra các mẫu
dƣơng tính với SRBSDV, đƣợc chúng tôi sử dụng để phân lập hệ gen của SRBSDV, sử
dụng phƣơng pháp tách bằng cột CF11.

40
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA sợi đôi tinh sạch trên gel agrose 1%
(chạy 100V trong 1 giờ) trong hình 13 cho thấy, hệ gen của các mẫu virus thu đƣợc
gồm 7 băng, trong đó băng thứ 3 (tính theo kích thƣớc giảm dần) bao gồm ba phân
đoạn S3, S4, S5 có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau ( lần lƣợt là 3618bp, 3571bp và
3167bp) và băng thứ 6 bao gồm hai phân đoạn S8 và S9 (1928bp và 1900bp) (Hình
13). So sánh với hình ảnh điện di hệ gen SRBSDV trên agarose của Zhou et al. (2008)
[23] có thể thấy chúng tôi đã phân lập thành công hệ gen của SRBSDV. Đây chính là
nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu RNA đƣợc bảo quản ở
-20o
C để sử dụng cho các mục đích tiếp theo.
Hình 13: Hình ảnh điện di hệ gen của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu lúa
Giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Ninh Bình-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Thái Bình-1;
giếng 5: Mẫu Thái Bình-2; giếng 6: Mẫu Nghệ An; giếng 7: Mẫu Nam Định; giếng 8: Mẫu Lào Cai; giếng 9:
Mẫu Quảng Trị-1; giếng 10: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 11: Mẫu Huế-1; giếng 12: Mẫu Huế-2

41
STT
Mẫu
Địa điểm
lấy mẫu
Kết
quả
ELISA
Kết quả RT-PCR
với cặp mồi
SRBSDVS10F3/R3
Kết luận
1 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV
5 Hải Phòng Nhiễm RGDV
6 Hải Phòng Nhiễm RGDV
7 Hải Phòng Nhiễm RBSDV Ghi chú
8 Hải Phòng (*) (-) Nhiễm RBSDV
9 Hòa Bình Nhiễm RGSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTSV10 Hòa Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
11 Hòa Bình Nhiễm RRSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGSV12 Hòa Bình Nhiễm RRSV
13 Huế (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGDV14 Huế (+) Nhiễm SRBSDV
15 Huế Nhiễm RBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRSV16 Huế Nhiễm RTSV
17 Lào Cai (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RBSDV18 Lào Cai Nhiễm RTBV
19 Lào Cai Nhiễm RTBV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTBV20 Lào Cai Nhiễm RBSDV
21 Nam Định (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRBV22 Nam Định (*) (-) Nhiễm RBSDV
23 Nam Định Nhiễm RGSV (*) Dƣơng tính không rõ ràng
với kháng nguyên RBSDV24 Nam Định Nhiễm RRBV
25 Nghệ An (+) Nhiễm SRBSDV Âm tính
26 Nghệ An Nhiễm RTSV
27 Nghệ An Nhiễm RTSV (+) Dƣơng tính với cặp mồi
tƣơng ứng28 Nghệ An Nhiễm RBSDV
29 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV (-) Âm tính với cặp mồi tƣơng
ứng30 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV
31 Ninh Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
32 Ninh Bình Nhiễm RRSV
33 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV
34 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV
35 Quảng Trị Nhiễm RGSV
36 Quảng Trị Nhiễm RGSV
37 Sơn La (+) Nhiễm SRBSDV
38 Sơn La Nhiễm RGDV
39 Sơn La Nhiễm RTBV
40 Sơn La Nhiễm RGSV
41 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV
42 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV
43 Thái Bình Nhiễm RGDV
44 Thái Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
45 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
Bảng 3: Kết quả sàng lọc mẫu
bệnh bằng phương pháp
Sandwich-ELISA và RT-PCR
một bước
49 Vĩnh Phúc Nhiễm RBSDV
50 Vĩnh Phúc Nhiễm RGSV
51 Vĩnh Phúc Nhiễm RRSV

Di truyền phân đoạn các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen, 9đ

Di truyền phân đoạn các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen, 9đ

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Di truyền phân đoạn các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen, 9đ

Similar to Di truyền phân đoạn các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen, 9đ (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (10)

Di truyền phân đoạn các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen, 9đ