Oxford Nanopore Stepik course - pt3

1. Часть 3.Применения нанопорного секвенирования.
● Полногеномное секвенирование: соединяй и властвуй
● Секвенирование ампликонов: 16S, 18S, и другие
● Секвенирование кДНК и прямое секвенирование РНК
● Идентификация сложных структурных вариантов

2. 3.1. Полногеномное секвенирование: соединяй и властвуй

3. Сборка геномов
● Современные методы включают:
○ короткие прочтения (Illumina)
○ длинные прочтения
○ Hi-C для объединения в хромосомы
● возможность недорого получить
большой объем прочтений (1D:
10 Гб за ~ $500) перевешивает
недостатки
● возможность получить сверх-
длинные прочтения

4. Разрешение гаплотипов
● фазирование - определение, от кого из
родителей унаследован аллель
● длинные прочтения позволяют получить
полностью фазированную сборку

5. Josh Quick protocol
● вариация протокола rapid (RAD001-4)
● минимизируя операции с ДНК, дает
самые длинные прочтения

6. Наш опыт в Cristatella Mucedo
● Cristatella Mucedo - пресноводная
мшанка с неизвестным геномом
● Три запуска Нанопоры:
○ 2.1 Гб - длинные прочтения
(SQK-RAD002)
○ 6.8 Гб - 1D (SQK-LSK108)
○ 3.4 Гб - 1D (SQK-LSK108)
● Две сборки с N50 1.2-1.3Мб,
90-91% полных генов BUSCO
● 85% выравниваемость РНК-сек

7. Геном человека
● Секвенирование ДНК NA12878
● Закрывает пробелы в сборке

8. Сборка центромеры Y-хромосомы
● альфа-повторы (171 п.н.), организованы в HOR
● разработан метод высокого покрытия BACs
● первая известная сборка центромеры!

9. 3.2. Секвенирование ампликонов: 16S, 18S, и другие

10. Метагеномика
● широко используются для
исследования бактериальных
сообществ
● ген 16S содержит 9
вариабельных регионов (V1-V9),
разделенных консервативными
последовательностями
● получаемые ампликоны служат
для определения разнообразия
бактерий

11. Зачем нам длинные прочтения?
● длина гена 16S - 1500-1800 п.н.
● самый длинный ампликон на Illumina - 600 п.н. (2x300)
● чаще всего исследуют фрагмент V3-V4
● использование всего 16S сильно увеличивает разрешение метода

12. Ампликоны HLA (MHC)
● регион MHC (3.8Мб)
содержит 253 гена
● крайне важен в работе
иммунитета
● типирование HLA
широко применяется при
пересадке любых
органов
● современные методы
быстро смещаются в
NGS 3-го поколения

13. Гибридное типирование
● амплификация ~ 9кб
фрагмента HLA-DRB
● гибридная сборка де-
ново позволяет
разрешить короткие
повторы и гаплотипы

14. 3.3. Секвенирование кДНК и прямое секвенирование РНК

15. Альтернативный сплайсинг
● короткие прочтения
характеризуют изоформы
очень неточно
● мышечные и неврологические
заболевания часто включают
в себя огромные гены (титин,
дистрофин, каналы)
● длинные прочтения
позволяют получить
транскрипты целиком
TTN

16. Кальциевый канал CACNA1C
● сплайсинг в тканях мозга часто нарушен при заболеваниях
● варианты в CACNA1 ассоциированы с шизофренией
● секвенирование ампликона обнаружило 38 новых экзонов и 83 изоформы!

17. Прямое РНК-секвенирование вируса гриппа
● вирусы обладают уникальными особенностями генома
● прямое секвенирование позволит увидеть новые модификации
● динамическое и прямое наблюдение изменений в эпидемиях

18. 3.4. Идентификация сложных структурных вариантов

19. Сложные варианты в моногенных заболеваниях
● сложные варианты
составляют 2% от всех
структурных вариантов
- в среднем 15 на геном
● 1324 индивидуумов,
болезни ретины и
неврологического
развития
● 4 подтвержденных
патогенных варианта

20. Анализ экспансии повторов
● специальный случай эпилепсии (BAFME)
● известны 4 локуса, но неизвестны
варианты, приводящие к заболеванию
● ПЦР и BAC-клонирование давали
результаты, отличные от Southern blot
● секвенирование нанопорой позволило
подтвердить экспансию TTTTA/TTTCA