vi-sinh-vật-gay-bệnh-trong-thực-phẩm-libre

M C L C
M Đ U............................................................................................................................................... 1
I. TÌNH HÌNH NG Đ C TH C PH M TRÊN TH GI I VÀ VI T NAM................................... 2
II. M T S VI SINH V T CÓ TH GÂY NG Đ C TH C PH M.............................................. 6
2.1 Salmonella......................................................................................................................6
2.2 Campylobacter ...............................................................................................................6
2.3 Clostridium perfringens .................................................................................................7
2.4 Clostridium.....................................................................................................................7
2.5 Staphylococcus ...............................................................................................................8
2.6 Vibrio spp .......................................................................................................................9
2.7 Escherichia coli............................................................................................................10
2.8 Shigella.........................................................................................................................10
2.9 Listeria monocytogenes................................................................................................11
2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm .........................................................................12
2.11 Coliforms....................................................................................................................13
2.12 N m men và n m m c................................................................................................13
III. CÁC PH NG PHÁP Đ NH L NG VI SINH V T............................................................... 15
3.1 Đ nh l ng vi sinh v t bằng ph ng pháp đ m tr c ti p.............................................15
3.1.1 Đ m bằng buồng đ m hồng c u............................................................................15
3.1.2 Kỹ thu t đ m Breed...............................................................................................17
3.1.3 Đ m bằng kính hi n vi huỳnh quang.....................................................................18
3.2 Các kỹ thu t đ nh l ng vi sinh v t trong m u bằng ph ng pháp nuôi c y...............19
3.2.1 Ph ng pháp đ m khu n l c .................................................................................20
3.2.2 Ph ng pháp c đoán s l ng vi sinh bằng kỹ thu t MPN (Most Probable
Number): ........................................................................................................................28
3.2.3 Ph ng pháp lai khu n l c ....................................................................................29
3.3 Ph ng pháp đo đ đ c................................................................................................31
IV. ÁP D NG Đ I V I M T S VI SINH V T GÂY B NH TRONG TH C PH M ............... 32
4.1 Đ nh l ng Fecal Coliform và E. Coli bằng ph ng pháp đ m đĩa ............................32
4.2 Đ nh l ng Vibrio Parahaemolyticus ..........................................................................33
4.3 Đ nh l ng Coliforms, Coliforms ch u nhi t, E. Coli gi đ nh (Fecal Coliforms) bằng
ph ng pháp MPN .............................................................................................................35
4.4 Đ nh l ng Enterococci đ ng ru t trong n c bằng ph ng pháp màng lọc ...........37
Thi t b : ..........................................................................................................................37
4.5 Đ nh l ng Clostridium khử sunfite trong n c bằng ph ng pháp tăng sinh trong môi
tr ng c y l ng...................................................................................................................38
K T LU N........................................................................................................................................ 40
TÀI LI U THAM KH O..................................................................................................41
PH L C...........................................................................................................................42

http://www.ebook.edu.vn 1
M Đ U
Các vi sinh v t gây b nh nhi m trong th c ph m th ng gặp gồm các vi
khu n Salmonella Shigella, E.coli, Bibrio choterea, Clostridium botulinum,
Clostridium perfringens; các vius Hepatis, virus Hepatis virus A, Rotavirus;
các ký sinh trùng Amip, sán lá gan, sán bò, trùng lông; các n m m c và n m
men Aspergillus, candida, Furanium...
Vi sinh v t gây b nh nhi m trong th c ph m bằng 4 con đ ng chính: qua
súc v t, qua môi tr ng, ch bi n và b o qu n. M c đ nguy hi m và tri u
ch ng c a b nh có th gây nên do đ c t c a vi sinh v t ti t vào th c ph m hay
do chính t bào c a chúng gây nên. Đ có th gây ng đ c th c ph m, vi sinh
ph i hi n di n v i s l ng t bào l n và ph thu c li u l ng c a từng ch ng
lo i nhi m vào, th c ph m ph i có các đ u ki n lý hoá thích h p cho vi sinh v t
đó phát tri n, nhi t đ và th i gian ph i thích h p cho quá trình tăng tr ng c a
chúng từ khi chúng nhi m vào cho đ n khi tiêu th đ vi sinh v t nhân lên đ n
đ li u l ng hay s n xu t đ l ng đ c t gây h i. Khi nhi m th c ph m, vi
sinh v t gây h h ng làm th c ph m b đổi màu, đổi v , có mùi. Tuy nhiên cũng
có m t s lo i gây nhi m th c ph m nh ng không làm thay đổi màu, mùi, v
hay hình d ng bên ngoài c a th c ph m. Vì v y r t khó nh n bi t bằng c m
quan. Do đó, vi c xác đ nh và đ nh l ng các vi sinh v t gây b nh nhi m trong
th c ph m là đi u r t c n thi t.

I. TÌNH HÌNH NG Đ C TH C PH M TRÊN
TH GI I VÀ VI T NAM
các n c phát tri n có t i 10% dân s b ng đ c th c ph m và mắc
b nh truy n qua th c ph m m i năm; v i các n c kém phát tri n tỷ l này cao
h n nhi u. Nhi u n c có quy đ nh báo cáo nh ng ch đ t 1% s ca b ng đ c
th c ph m. Ng đ c th c ph m Mỹ chi m 5% dân s /năm (>10 tri u ng -
i/năm), trung bình 175 ca/100.000 dân, m i năm ch t 5.000 ng i; Anh: 190
ca/100.000 dân; Nh t: 20-40 ca/100.000 dân; Úc là 4,2 tri u ca/năm.
Th c tr ng vi ph m v sinh an toàn th c ph m n c ta r t đáng báo
đ ng. Ng đ c th c ph m c p tính trong nh ng năm qua v n có chi u h ng
gia tăng c v s v và quy mô mắc. Tỷ l mắc/100.000 dân trung bình từ năm
2001 – 2005 là 5,48. Có nhi u nguyên nhân gây ra các v ng đ c th c ph m
trong toàn qu c nh th c ph m ô nhi m, môi tr ng ô nhi m; th c ph m có
đ c; đi u ki n s n xu t, ch bi n th c ph m không b o đ m an toàn, nh n th c
– hành vi đúng v phòng ch ng ng đ c th c ph m c a c ng đồng còn nhi u
h n ch …
Trung bình m i năm có 202.2 v ng đ c th c ph m x y ra v i 5.525,1
ng i mắc và 55.2 ng i ch t. S v ng đ c x y ra nhi u nh t là từ tháng 4 - 7
và tháng 9 – 11. Tỷ l mắc ng đ c trung bình là 7.14/100.000 dân, tỷ l ch t là
0,06/100.000 dân/năm.
S v ng đ c l n (≥ 30 ng i) chi m 26,8% v i s mắc chi m 83,2%.
V ng đ c nh và vừa (<30 ng i) chi m 73,2% v i s mắc chi m 16,8%. Tỷ
l mắc ng đ c chi m 18.7% tổng s đ i t ng cùng ăn chung b a ăn; tỷ l
ch t là 0,8% tổng s đ i t ng b mắc ng đ c th c ph m. Mọi l a tuổi đ u có
th b ng đ c, tuổi nh (0 - 4 tuổi) và tuổi cao ≥ 50 có nguy c mắc và ch t
cao do ng đ c Bi u hi n chung trong các v ng đ c là buồn nôn (81,0%), nôn
(83,9%), đau b ng chi m 79.0%, a ch y 72.2 %, đau đ u chi m 53.2%, chóng
mặt 43,4%, s t 26,3%….
C s nguyên nhân ng đ c ch y u là gia đình (54,6%), b p ăn t p th
(15,6%), đám c i/gi (16,6%), th c ăn đ ng ph (5,4%), b p ăn tr ng học
(4,0%). Th c ăn nguyên nhân ch y u là th c ph m h n h p (40,0%); thuỷ s n
14,1%; n m 13,2%; ngũ c c và các s n ph m là 7,8%…
Nguyên nhân ng đ c ch y u là nguyên nhân vi sinh v t (34,0%), đ c t
t nhiên (24,0%), hoá ch t (10,0%). Còn 32,0% s v không xác đ nh đ c
nguyên nhân. Vi sinh v t gây ng đ c là Salmonella, Streptoccocus, E.coli,
Staphylococcus aurerus và Vibrio parahaemolyticus; đ c t t nhiên ch y u là
đ c t c a n m đ c (13,2%).

Th i gian báo cáo trung bình c a v ng đ c là 9.74 ngày. V i v ng đ c
th c ph m ≥30 ng i là 8.53 ngày (0-31 ngày), v i v ng đ c <30 ng i là
10,20 ngày (1-37 ngày).
L y m u xét nghi m nguyên nhân v ng đ c đ t tỷ l r t th p: M u th c
ph m là 47,3%, m u b nh ph m là 23,9 %; d ng c , bao gói đ t t l th p 1,5 %
các v ng đ c.
Bảng 1: S l ng các v ng đ c th c ph m toàn qu c từ năm 2000 – 2008
K t qu đi u tra
Năm
V ng đ c (vụ) S mắc (người) Ch t (người)
2000 213 4233 59
2001 245 3901 63
2002 218 4.984 71
2003 238 6.428 37
2004 145 3.584 41
2005 144 4.304 53
2006 165 7.135 57
2007 247 7.329 55
2008 205 7.828 61
Trung bình/năm 202.2 (247 - 144) 5.525,1 (7.828 - 3.584) 55.2 (71 – 31)
Tổng c ng 1.820 49.726 497
Bảng 2. Tình hình ngộ độc tại Hà Nội trong 3 năm gần đây
S v ng đ c Nguyên nhân gây ng đ c
Năm S
v
S
ng ời
mắc
S
ng ời
ch t
Vi sinh
v t
Th c
ph m
bi n
chất
Hóa
chất
tồn d
trong
th c
ph m
Đ c t
t
nhiên
Nguyên
nhân
khác
2006 2 41 0 2 0 0 0 0
2007 8 137 0 7 0 1 0 0
2008 8 354 0 8 0 0 0 0
Cộng 18 620 0 17 0 1 0 0

Bảng 3: Nguyên nhân trong các v ng đ c th c ph m trong năm 2007
K t qu đi u tra
TT Nguyên nhân ng đ c
Số lượng Tỷ lệ (%)
1 Salmonella 3 1.5
2 Streptoccocus 2 1.0
3 E.coli 4 2.0
4 Staphylococcus aurerus 7 3.4
5 Vibrio parahaemolyticus 1 0.5
6 Thu c di t chu t 0 0.0
7 Hoá ch t 1 0.5
8 Đ c t c a cá nóc 8 3.9
9 Đ c t con so 2 1.0
10 Đ c t c a con sam 2 1.0
11 Đ c t trong th t cóc 2 1.0
12 Đ c t Histamin 3 1.5
13 Đ c t trong mắm tép 0 0.0
14 Đ c t trong r u 5 2.4
15 Đ c t c a Lá ngón 2 1.0
16 N m đ c 27 13.2
17 Không rõ nguyên nhân 136 66.3
Tổng c ng 205 100,0

Salmonella Shigella E. coli Vibrio
Staphylococcus Campylobacter Clostridium Listeria

II. M T S VI SINH V T CÓ TH GÂY NG
Đ C TH C PH M
2.1 Salmonella
Salmonella Tr c năm 1983 các nhà khoa học chia Salmonella ra làm 3
loài d a theo ph n ng sinh hóa mà chúng tham gia : S.typhi, S.choleraesuis,S.
enteridis.
Salmonella là tr c khu n garm (-), hi u khí và k khí tùy ý, có kh năng di
đ ng không t o bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nh ng không lên
men sacarose và lactose, không sinh indole, không phân gi i urê không có kh
năng tách nhóm amin từ tryptophane, h u h t các ch ng đ u sinh H2S. pH t i
u cho chúng phát tri n nằm trong vùng trung tính, tuy nhiên đôi khi phát tri n
trong vùng pH từ 4 ÷ 9, không có kh năng phát tri n nồng đ mu i cao.
Vi khu n Salmonella tồn t i trong c th nhi u loài đ ng v t và có th gây
b nh cho ng I. Vi khu n Salmonella có th gây b nh truy n nhi m cho đ ng
v t nh phó th ng hàn bò, phó th ng hàn l n, b nh s y thai cừu và ng a,
b nh b ch lỵ gà, b nh viêm ru t bò,… Nh ng b nh k trên do Salmonella gây
ra ng i ta gọi là b nh truy n nhi m nguyên phát, ngoài ra có th phá hi n
đ c Salmonella trong ch t bài ti t c a đ ng v t.
S l ng Salmonella đ đ gây ng đ c là khi chúng hi n di n c tri u t
bào trong m t gam th c ph m. Các tri u ch ng do Salmonella gây ra th ng là
tiêu ch y, ói mửa, buồn nôn. Th i gian b nh cho đ n khi các tri u ch ng bi u
hi n th ng sau 12-36 gi k từ khi tiêu th th c ph m b nhi m. Tri u ch ng
th ng kéo dài ít nh t từ 2-7 ngày. Không ph i t t c mọi ng i khi tiêu th
th c ph m b nhi m Salmonella đi u có bi u hi n b nh, ng c l i m t s ng i
không có tri u ch ng lâm sàng khi tiêu th ph i th c ph m nhi m vi sinh v t
này khi đó chúng đ c bài ti t ra ngoài. Các lo i th c ph m có nguy c b
nhi m Salmonella nh th t gia c m, s n ph m th t, tr ng và các s n ph m c a
tr ng, th y s n. Nguồn nhi m vi sinh v t vào các lo i th c ph m th ng có
nguồn g c từ đ ng ru t c a ng i và các loài đ ng v t, chúng có th đ c
nhi m gián ti p hay tr c ti p. Salmonella gây nên b nh s t th ng hàn thu c
các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C. các dòng này
th ng không gây b nh cho các loài đ ng v t.
2.2 Campylobacter
Đây là vi sinh v t gây nên b nh viêm nhi m đ ng ru t, bằng các ph ng
pháp phân l p đã ch ng minh vi sinh v t này hi n di n khắp n i.
Campylobacters là m t trong nh ng h vi sinh v t c a nhi u lo i đ ng v t và
chim. Nh ng các dòng có kh năng gây ng đ c th c ph m không th phát
tri n khi nhi t đ th p h n 300
C, đây là vi sinh v t a nhi t bắt bu t. S n ph m

s a và th t gia c m là nh ng nguồn có th gây nên ng đ c do vi sinh v t này.
N c cũng là m t trong nh ng nguồn mang b nh này. Campylobacters là vi
sinh v t r t nh y v i nhi t đ , chúng b tiêu di t hoàn toàn bằng ph ng pháp
thanh trùng Pasteur, chúng không th s ng sót trong th c ph m có môi tr ng
acid. Chúng không th phát tri n trong th c ph m b o qu n trong đi u ki n
hi u khí mà ch phát tri n trong các lo i th c ph m hút chân không.
Khi xâm nhi m Campylobacter, th i gian b nh th ng từ 2-11 ngày.
Các tri u ch ng do vi sinh v t này gây nên nh đau nh c, tiêu ch y, s t, đau
đ u, khó ch u, chu t rút, l nh cóng, mê s n. Th nh tho ng có nh ng bi u hi n
b nh gi ng nh c m cúm.
2.3 Clostridium perfringens
Quan ni m v s ng đ c th c ph m do Clostridium perfringens gây ra đã
có nh ng thay đổi trong nh ng năm g n đây. Theo nh ng quan ni m tr c đây
cho rằng các dòng C.perfringens kháng nhi t, t o bào tử và không làm tan máu
m i có th gây ng đ th c ph m. Nh ng trong nh ng năm gây đây các dòng
nh y c m v i nhi t, không làm tan máu cũng đ c tìm th y trong các v ng
đ c do vi sinh v t này gây nên.
Vì các bào tử c a C. perfringen kháng nhi t nên chúng th ng s ng sót
qua quá trình n u chín. Tuy nhiên cũng ph thu c vào th i gian ti p xúc v i
nhi t. N u nh ng bào tử s ng sót, khi gặp đi u ki n thích h p chúng s n y
m m và nhân lên. Khi đun n u th c ăn nhi t đ th p và th i gian ngắn có th
làm cho các dòng kháng nhi t tồn t i vì th chúng s gây tái nhi m sau khi b o
qu n. Các nguồn th c ph m có th gây ng đ c v i các vi sinh v t này th ng
là th t gia c m, nh t là các lo i gia c m l n đông l nh sâu, th t trong các h m
ch a. C. perfringens cũng đ c tìm th y trong đ t, trong phân ng i và trong
các lo i th c ph m khác. Các tri u ch ng do vi sinh v t này gây ra th ng là
đau thắt vùng b ng, tiêu ch y. Th i gian b nh từ 12-24 gi . Các tri u ch ng
lâm sàng gây nên do đ c t c a chúng.
2.4 Clostridium
Clostridium là các vi khu n garm (+), hình que, k khí sinh bào tử , không
di đ ng, có th th y gi i saccaride và protein trong các ho t đ ng thu nh n
năng l ng t o ra các s n ph m nh acid acetic, butiric, r u, t o ra các mùi
khó ch u trong s n ph m. Clostridium phát tri n m nh nhi t đ 55o
C, nhi t đ
t i u là 43 ÷ 47o
C. Nhi t đ 15 ÷ 20o
C làm ch m hoặc làm ng ng s phát tri n
c a vi khu n này. Không phát tri n pH h n 5,0 hoặc trên 9,0, b c ch b i
5% NaCl. Clostridium hi n di n trong đ t, m t s loài trong nhóm này gây
b nh cho ng i và đ ng v t, m t s loài khác gây h h ng th c ph m, khử
sunphit thành sunphur t o ra màu đem và gây mùi khó ch u.

Clostridium botulinum là vi sinh v t sinh đ c t gây b nh ng đ c th t cho
ng i (botulism). B nh bi u hi n r t nghiêm trọng ng i. B nh gây ra do đ c
t đ c hình thành b i C.botulinum nhi m trong th c ph m. Tri u ch ng lâm
sàng c a b nh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có nh ng bi u hi n r i lo n thành
kinh nh choáng váng, r i lo n th giác, r i lo n các c cổ và mi ng, đau
vùng ng c, khó th và tê li t, có th d n đ n tử vong. Các tri u ch ng trên bi u
hi n sau 12-36 gi sau khi tiêu th th c ph m nhi m đ c t . Các tri u ch ng
th ng kéo dài 2-6 ngày tuỳ theo tình tr ng nhi m đ c và s c khoẻ c ng từng
b nh nhân.
Các lo i th c ph m nh th t, rau qu không đ c b o qu n đúng qui đ nh
hay lây nhi m từ đ t, phân đ ng v t hay do ch bi n không đ nhi t đ tr c
khi dùng, các s n ph m đóng h p không đúng qui cách cũng có nguy c nhi m
vi sinh v t này r y cao. Đi u ki n thích h p cho vi c hình thành đ c t c a vi
sinh v t này đi u ki n môi tr ng kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh
v t khác c nh tranh. Đ c t botuline do C. botulinum ti t ra gồm m t s lo i
khác nhau nh A, B, C1, C2, D, E, F, G. các đ c t này là nh ng protein có
trọng l ng phân tử l n kho ng 1 tri u danton. Nh ng nh ng d ng có tác đ ng
m nh đ n con ng i là A, B, và E. đây cũng là m t trong nh ng lo i đ c t
sinh học có c ng đ m nh nh t. Trong nh ng năm g y đây, các v ng đ c
botulism gây ra do C.botulinum dòng E th ng đ c phát hi n khi tiêu th cá
và các s n ph m th y s n. Dòng vi sinh v t này th ng xuyên phân l p đ c từ
các m u bùn đáy t i các cửa sông.
2.5 Staphylococcus
Staphylococcus là lo i c u khu n gram (+), các t bào c a chúng liên k t
thành hình chùm nho. Khi phát tri n trong môi tr ng, Staphylococcus có kh
năng t o ra sắc t từ màu trắng đ n vàng s m, nhi t đ 20 ÷ 25o
C thích h p
nh t cho chúng t o màu. Staphylococcus không di đ ng, không t o bào tử,
nhi t đ thích h p cho s phát tri n là 37o
C, ch u đ c s khô h n, h i nóng (
nhi t đ 50o
C chúng v n s ng trong 30 phút), có kh năng s ng nồng đ
mu i 9 ÷ 10%. Staphylococcus phát tri n pH r t r ng (pH = 4,0 ÷ 9,8).
Kho ng pH t i u c a chúng là 6 ÷ 7 và aw t i u kho ng 0,83 ÷ 0,86.
Staphylococcus có kh năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose,
sucrose. Staphylococcus đ c phân b khắp n i nh ng ch y u đ c phân l p
từ da và màng nh y c a ng i và đ ng v t máu nóng. Staphylococcus có th
nhi m vào trong th c ph m qua con đ ng ti p xúc v i ng i thao tác trong
quá trình ch bi n th c ph m. S hi n di n v i m t đ cao c a Staphylococcus
trong th c ph m ch th đi u ki n v sinh và ki m soát nhi t đ kém c a quá
trình ch bi n.
Staphylococcus aureus là VSV có kh năng s n sinh m t s lo i đ c t
đ ng ru t b n nhi t, không b phân huỷ khi đun 100o
C trong kho ng 30

phút. Khi vi sinh v t này xâm nhi m vào trong th c ph m, chúng ti t đ c t
vào trong s n ph m và gây đ c. Khi con ng i tiêu th lo i th c ph m có ch a
đ c t này, sau 4-6 gi b nh s b c phát các tri u ch ng lâm sàng nh tiêu
ch y, nôn m a, các tri u ch ng này kéo dài từ 6-8 gi . Các lo i th c ph m có
ch a hàm l ng mu i cao th ng có nguy c nhi m vi sinh v t này nh
jambon, kem tổng h p, n c soup… vì các lo i th c ph m này ít khi đ c xử
lý nhi t đ cao h n 40o
C. Các lo i thuỷ s n hay th c ph m đóng h p cũng
th ng hay b nhi m loài vi sinh v t này. Các nguồn lây nhi m vào th c ph m
ch yêu từ các khâu ch bi n trong nhà b p. Trong t nhiên các vi sinh v t này
th ng tình th y trên da, mũi, tóc hay lông c a các loài đ ng v t máu nóng.
2.6 Vibrio spp
Các loài Vibrio có nguồn g c từ bi n, chúng c n ion Na+ đ phát tri n.
Gi ng Vibrio có m t s loài có kh năng gây b nh cho ng i nh V. cholerae,
V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. hollisae, V. furnsii, V. mimicus, V.
fluvialis, V. alginolyticus.
V. cholerae là tác nhân gây nên các v d ch t trên toàn th gi i. Loài vi
sinh v t này đ c chia thành hai ki u huy t thanh chính đó là O1 và non-O1,
ki u huy t thanh O1 bao gồm ba ki u huy t thanh ph nh sau: Ogawa; Inaba
(hai ki u này đ c gọi chung là ki u cổ đi n – Classic) và ki u Eltor (ki u
Eltor còn đ c gọi là ki u O139). Hai ki u huy t thanh Inaba và Ogawa ngày
nay ch còn đ c tìm th y t i các n c thu c khu v c châu A. Trong khi đó các
v d ch t trên khắp th gi i gây ra do ki u Eltor. Khi có các tr n d ch do V.
cholerae gây ra th ng lan truy n r t nhanh vào trong n c, gây nhi m vào
th c ph m, n u đi u ki n v sinh kém, vi khu n s lan truy n qua con ng i và
d ch b nh càng thêm nghiêm trọng. Vi sinh v t này s n sinh đ c t
cholaratoxin, đây là lo i đ c t đ ng ru t có c ng đ m nh, ch c n 5µg gây
nhi m qua đ ng mi ng có th gây tiêu ch y cho ng i tr ng thành. M t s
đ c t khác cũng đ c vi sinh này ti t ra nh hemolysine có đ c tính t ng t
tetrodotoxin (đ c t cá nóc) hay đ c t t ng t shiga-toxin.
Các lo i th c ph m có th lan truy n V. cholerae nh n c u ng, n c
trái cây, rau qu , s a và các s n ph m s a, th m chí bia cũng có kh năng
nhi m vi sinh v t này. Các lo i s n ph m thuỷ s n t i s ng, không qua gia
nhi t, gia nhi t nhẹ hay do s nhi m chéo sau khi gia nhi t cũng đ c khuy n
các là có nguy c mang V.cholerae khá nghiêm trọng.
V. parahaemolyticus là loài vi sinh v t tồn t i và phát tri n trong môi
tr ng có hàm l ng mu i cao, chúng th ng xuyên đ c phân l p từ các s n
ph m th y s n, trong các vùng n c m ven b bi n. Chúng s n sinh đ c t
hemolysine b n nhi t, ch t này ch u trách nhi m cho đặc tính kháng nguyên
Kanagawa. Nh ng trong nh ng năm g n đây các dòng V.parahaemolyticus có
ph n ng Kanagawa âm tính cũng có th gây b nh. Tri u ch ng bi u hi n c a

b nh có th xu t hi n trong kho ng 2-96 gi sau khi tiêu th th c ph m b
nhi m, th i gian này ph thu c vào li u l ng xâm nhi m và th tr ng c a từng
b nh nhân, lo i th c ph m tiêu th và hàm l ng acid trong d dày. Các bi u
hi n b nh lý khi vi sinh v t này xâm nhi m và đau thắt vùng b ng, viêm nhi m
đ ng ru t và tiêu ch y nhẹ.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhi m vào trong th c ph m cũng có th gây
nên các b nh đ ng ru t và có bi u hi n b nh lý t ng t nh hai loài trên. Dĩ
nhiên tuỳ từng loài và li u l ng mà có nh ng bi u hi n b nh nặng nhẹ khác
nhau. Ch riêng loài V. vulnificus không gây các tri u ch ng b nh đ ng ru t
mà chúng gây nhi m trùng máu cho ng i.
2.7 Escherichia coli
E.coli thu c họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), tr c
khu n ngắn, không t o bào tử, ch u đ c nhi t, không b h y khi đun nóng
100oC trong 2 gi . E.coli có th kháng cồn, không b h y khi ti p xúc v i cồn
50%, b h y b i focmol 5%, có kh năng phát tri n nhi t đ từ 30 ÷ 50o
C,
nhi t đ phát tri n t i u c a chúng là 37o
C, phát tri n pH t i u là 4,4 và aw
t i u là 0,95.
E. coli là vi sinh v t hi u khí phổ bi n trong đ ng tiêu hoá c a ng i và
các loài đ ng v t máu nóng. H u h t các dòng E. coli tồn t i m t cách t nhiên
và không gây h i trong đ ng tiêu hoá, ng c l i chúng còn đóng vai trò quan
trọng trong vi c ổn đ nh sinh lý đ ng tiêu hoá. Tuy nhiên có ít nh t 4 dòng
sau đây có th gây b nh cho ng i và m t s loài đ ng v t:
Enterobathogenic E. coli (EPEC)
Enterotocigenic E. coli (ETEC)
Enteroinvasive E. coli (EIEC)
Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli
O157: H7
Các dòng E. coli gây b nh khi chúng xâm nhi m vào ng i qua con
đ ng th c ph m có th gây nên các b nh r i lo n đ ng tiêu hoá, các bi u
hi n lâm sàng bi n đ ng có th từ nhẹ đ n r t nặng, có th đe do m ng s ng
c a con ng i ph thu c vào li u l ng, dòng gây nhi m và kh năng đáp ng
c a từng ng i.
2.8 Shigella
Gi ng Shigella cũng là m t thành viên c a họ vi khu n đ ng ru t
Enterobacteriacae, chúng gồm có 4 loài sau: S. dysenteriae, S. sonnei, S.
plexneri, S. boydii. Đây là gi ng vi sinh v t có t bào ch đặc hi u, chúng ch
thích nghi và phát tri n trong t bào ch là ng i và các loài linh tr ng. S
hi n di n c a chúng trong môi tr ng là do s nhi m phân c a ng i và các
loài mang vi sinh v t này. Shigella có th tồn t i h n 6 tháng trong môi tr ng

n c. Các v ng đ c th c ph m do Shigella gây ra ch y u t p trung các
n c kém phát tri n, ch bi n th c ph m trong đi u ki n kém v sinh. B nh
cũng có th truy n tr c ti p từ ng i qua ng i.
Shigella ch y u gây nên các b nh l tr c trùng. Th i gian b nh sau khi
tiêu th th c ph m b nhi m là 1-7 ngày. Các bi u hi n tri u ch ng b nh có th
nhẹ, bi u hi n không rõ, ch thoáng qua nh tiêu ch y nhẹ, nh ng đôi khi cũng
có nh ng bi u hi n nghiêm trọng nh đi tiêu ra máu, có nh ng m nh niêm m c
ru t, m t n c, s t cao và b co rút thành b ng. Các tri u ch ng trên có th kéo
dài 12-14 ngày hay lâu h n. Đ i v i ng i l n, các tr ng h p tử vong do
Shigella hi m khi di n ra, nh ng b nh bi u hi n r t nghiêm trọng đ i v i trẻ
em và ng i già. Hàng năm có kho ng nửa tri u ng i tử vong do vi sinh v t
gây ra trên khắp th gi i.
S lây nhi m vi khu n Shigella ch y u đ ng mi ng. N c là m t môi
tr ng truy n b nh quan trọng, đặc bi t nh ng n i kém v sinh. Tuy nhiên
các lo i th c ph m cũng là nguyên nhân gây nên các b nh do Shigella. Vi sinh
v t này nhi m vào th c ph m qua nguyên li u hay quá trình ch bi n. Ðôi khi
nhi m b nh do v sinh cá nhân kém.
2.9 Listeria monocytogenes
Trong nh ng năm g n đây L. monocytogenes nổi lên nh m t m t tác
nhân gây b nh nguy hi m. Đ i t ng gây b nh c a vi sinh v t này là trẻ em,
ph n mang thai hay nh ng ng i già. Đ i v i nh ng vi sinh v t gây b nh g
đ c th c ph m khác, chúng b c phát b nh khi con ng i h p thu đ li u l ng,
sau th i gian b nh các tri u ch ng lâm sàng bi u hi n. Ng c l i L.
monocytogenes hi n di n v i m t s l ng nh trong th c ph m, khi đ c đ a
vào c th , chúng tồn t i và ch c h i. Khi có đi u ki n thu n l i, chúng nhân
lên xâm nhi m vào các mô sâu và gây b nh. Các b nh do vi sinh v t này gây
nên bắt đ u từ đ ng tiêu hoá nh tiêu ch y, s t nhẹ. Sau đó chúng xâm nhi m
vào các đ i th c bào gây nên b nh nhi m trùng máu, tác đ ng lên h th n kinh
trung ng, tim mắt, và có th xâm nh p vào bào thai gây nên s y thai, đẻ non
hay nhi m trùng thai nhi.
L. monocytogenes thu c lo i vi sinh v t a l nh, chúng có th phát tri n
nhi t đ từ 2-44o
C. Chúng th ng đ c phân l p từ các lo i th c ph m nh
phomat s a, th t cá rau qu và th m chí phân l p đ c từ trong n c mặt.
Trong t t c các công đo n ch bi n th c ph m, s a hay rau qu đ u có kh
năng xâm nhi m vi sinh v t v t này. Đặt bi t trong công đo n b o qu n các s n
ph m nhi t đ th p, vi sinh v t này có c h i phát tri n thành s l ng l n.
Các s n ph m thanh trùng Pasteur và đ c b o qu n nhi t đ th p trong các
t l nh có nguy c nhi m vi sinh v t này r t cao.

2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm
Các đ t d ch b nh gây ra từ th c ph m do tác nhân virus cho đ n nay v n
là v n đ bí n. Nh ng m t s tác gi v n tin rằng virus trong th c ph m là tác
nhân gây nên các b nh hi m nghèo. Nh ng ti n b trong các nhiên c u v virus
th c ph m v n còn h n ch . Cho d n nay các đặc đi m sinh lý c a virus đ ng
ru t v n còn bi t r t h n ch . Cho đ n nay các ph ng pháp nuôi c y đ phát
hi n virus trong th c ph m cho đ n nay v n ch a th th c hi n đ c. Nh ng
v i các ti n b v kỹ thu t sinh học phân tử nh kỹ thu t lai phân tử, kỹ thu t
PCR có th phát hi n đ c các virus có h i cho con ng i trong th c ph m.
S lan truy n virus cho ng i qua con đ ng th c ph m đ c bi t từ
nh ng năm 1950. Các virus gây b nh đ ng ru t cho ng i ch y u có nguồn
g c từ các s n ph m thuỷ s n. Cho đ n nay đ c bi t có kho ng h n 100 lo i
virus đ ng ru t. Nh ng ch m t vài loài trong s đó có kh năng gây b nh cho
ng i. Theo Kilgen và Cole (1991) các loài virus sau đây có th gây nguy hi m
cho ng i.
Hepatitis type A (HAV)
Virus Norwalk
Calicivirus
Astrovirus
Virus NonA và Non B.
Virus tồn t i th không ho t đ ng khi bên ngoài t bào, chúng không
th t nhân lên trong n c hay trong các s n ph m th c ph m cho dù b t kỳ
đi u ki n hoá lý nh th nào. Chúng xâm nhi m vào th c ph m hoàn toàn do
quá trình ch bi n, từ n c b ô nhi m. Các loài nhuy n th ăn lọc có kh năng
tích luỹ nhi u virus trong n c. Hàng ngày m t con nguy n th có th lọc 1500
lít n c, theo đó m t s l ng l n virus có th vào c th c a con v t này và
tích luỹ t i đó. Vì th m t đ virus trong c th nhuy n th cao h n r t nhi u so
v i môi tr ng n c chúng đang sinh s ng.
Li u l ng gây b nh c a virus có th th p h n r t nhi u so v i vi khu n khi
con ng i tiêu th th c ph m b nhi m. Li u l ng gây nhi m t i thi u c a m t
s loài vurus đ ng ru t t ng đ ng v i s l ng hi n di n trong th c ph m
mà các phòng thí nghi n có th phát hi n đ c bằng ph ng pháp nuôi c y.
C th ng i và các loài đ ng v t là nguồn ch a các virus đ ng ru t. Virus
đ c tìm th y v i s l ng l n trong phân c a nh ng ng i b nhi m và tồn t i
trong nhi u ngày đ n nhi u tu n. S nhi m phân vào trong th c ph m bằng con
đ ng gián ti p hay tr c ti p là con đ ng xâm nhi m virus vào th c ph m.
S s ng sót c a virus trong môi tr ng hay trong th c ph m ph thu c
vào y u t nh nhi t đ , nồng đ mu i, c ng đ b c x mặt tr i hay s hi n
di n c a các thành ph n h u c khác. Virus đ ng ru t cũng có kh năng tồn

t i nhi u tháng trong n c bi n nhi t đ < 10o
C th m chí có th lâu h n. Vì
th đây cũng là nhân t ch th ô nhi m phân. T t c các virus đ ng ru t đ u
kháng v i acid, các enzym th y gi i, hay mu i m t có trong đ ng tiêu hoá.
M t s virus có th kháng nhi t nh Hepatits type A, m t s khác có th kháng
v i các ch t t y u nh phenolic, ethanol …. Ozon và chlorine là nh ng tác
nhân có th làm b t ho t m t vài lo i virus đ ng ru t.
Đ ngăn ngừa các b nh do virus từ th c ph m, các lo i th c ăn ph i đ c
n u chín,khử virus tr c khi tiêu th , các lo i nhuy n th ăn lọc ph i đ c khai
thác tronng nh ng vùng n c không nhi m virus hay đ c nuôi trong các vùng
n c s ch tr c khi tiêu th .
2.11 Coliforms
Coliforms là nh ng tr c khu n hình g y, gram âm (-), không sinh bào tử,
hi u khí hoặc kỵ khí tùy ý. Chúng có kh năng phát tri n nhi t đ r t r ng từ
-2o
C đ n 50o
C, pH trong kho ng 4,4 ÷ 9,0. Coliforms có kh năng lên men
lactose sinh acid và sinh h i 37o
C trong 24 ÷ 48gi .
Coliforms hi n di n r ng rãi trong t nhiên trong ru t ng i, đ ng v t.
Khi s Coliforms c a th c ph m cao thì kh năng hi n di n c a các vi sinh v t
gây b nh khác cũng cao….
Coliforms ch u nhi t là nh ng Coliforms có kh năng lên men lactose sinh
h i trong kho ng 24 gi khi đ c 44o
C tromg môi tr ng canh EC.
Coliforms phân là Coliforms ch u nhi t có kh năng sinh indole khi đ c
kho ng 24 gi 45,5o
C trong canh Trypton. Coliforms phân là m t thành ph n
c a h vi sinh v t đ ng ru t ng i và các đ ng v t máu nóng khác và đ c
sử d ng đ ch th m c đ v sinh trong quá trình ch bi n, b o qu n, v n
chuy n th c ph m, n c u ng.
Căn c vào nhi t đ vi sinh v t có th phát tri n đ chia nhóm Coliform
thành hai nhóm. Nhóm Coliform có nguồn g c từ phân c a các loài đ ng v t
và, nhóm này đ c gọi là Coliform phân và nhóm không có nguồn g c từ phân
đ ng v t. Trên th c t , các ph ng pháp ki m nghi m ch xác đ nh Coliform
phân là xác đ nh nhóm coliform có nguồn ng c từ ru t ng i và các đ ng v t
máu nóng bao gồm các gi ng nh Escherichia; Klebsiella và Enterobater.
2.12 Nấm men và nấm m c
N m men và n m m c là nhóm vi sinh v t r t đa d ng, đây là nhóm vi
sinh v t nhân th t có vách t bào và l p v chitin, có nhân và các bào quan
khác. T t c các loài n m men và n m móc đ u thu c nhóm vi sinh v t d
d ng. Chúng ch có kh năng nh n các ch t dinh d ng d ng hòa tan. Trong
quá trình trao đổi ch t x y ra t bào chúng l i có kh năng chuy n hóa các
ch t hòa tan thành các ch t không hòa tan nh lignocellulose,…. Ngoài ra,
chúng còn có th t o ra các ch t đ c, các ch t đ c c a chúng đ c gọi chung là

đ c t vi n m (mycotoxins). Tiêu bi u có Aspegillus flavus, Aspegillus
parasiticus, Aspegiluus moninus, Penicillium italicum, Penicillium digitatum,
Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii. Trong th c ph m n m m c
và n m men hi n di n có th tăng tr ng làm thay đổi màu c a th c ph m, làm
phát sinh muồi hay v l , làm h h ng hay thay đổi c c u c a th c ph m, m t
s có th t o đ c t gây ng đ c th c ph m.

III. CÁC PH NG PHÁP Đ NH L NG VI
SINH V T
3.1 Đ nh l ng vi sinh v t bằng ph ng pháp đ m tr c ti p
S l ng Vi sinh v t trong m u có th đ c xác đ nh bằng cách đ m tr c
ti p trên kính hi n vi. Qui trình đ n tr c ti p cho phép xác đ nh đ c s l ng
vi sinh v t v i k t qu cao nh t. Mặt dù ph ng pháp đ m tr c ti p bằng kính
hi n vi cho phép c l ng nhanh chóng s l ng vi sinh v t có trong m u.
Tuy v y ph ng pháp này có nh ng đi m h n ch nh t đ nh nh không phân
bi t đ c s l ng t bào s ng và s l ng t bào ch t, d nh m l n t bào vi
sinh v t v i các m nh v nh c a m u và không cho phép tìm hi u các đặc
đi m khác c a c a vi sinh v t đ c đ c quan sát.
3.1.1 Đ m bằng buồng đ m hồng c u
Đ i v i các vi sinh v t có kích th c l n nh n m men, n m m c, t o và
protozoa, ph ng pháp đ m tr c ti p d dàng th c hi n v i các lo i buồng
đ m. Có r t nhi u lo i buồn đ m vi sinh v t khác nhau phù h p v i từng th
tích và kích th c c a từng nhóm vi sinh v t. Ví d có th sử d ng buồng đ m
hồng c u Petroff – Hauser đ đ m vi khu n. Đ i v i các m u n c và các m u
khác, buồng đ m Holber đ c sử d ng r ng rãi nh t.
Buồng đ n Holber là m t lam kính dày 2-3mm có m t vùng đĩa đ m nằm
gi a lame kính vùng này đ c bao quanh b i m t rãnh. Đĩa đ m th p h n b
mặt c a lame kính kho ng 0,02mm, có hình tròn vì th khi ph lên trên bằng
kính đ y v t thì đ sâu c a đĩa đ m s đồng đ u nhau. Vùng đĩa đ m có đi n
tích 1mm2
và đ c chia thành 400 ô vuông nh h n, m i ô có di n tích
0.0025mm2
. th tích c a m i ô là 0,02 x 0,0025 mm2
, th tích này t ng đ ng
v i 0,00005ml. Thêm vài giọt formalin vào trong nh ng lọ ch a m u, tr n đ u.
Pha loãng m u c n đ m sao cho trong m i ô nh c a buồng đ m có khoãng 5 -
10 t bào vi sinh v t. Đ đ t đ c đ pha loãng nh v y c n ph i c l ng
đ c s l ng vi sinh v t trong m u, đồng th i ph i thử vài l n trong quá trình
pha loãng. M u ph i đ c pha loãng bằng dung d ch pha loãng ch a 0,1%
pepton và 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue. T t c các dung d ch pha
loãng đ u ph i c n lọc tr c khi sử d ng.

Đặt m t giọt m u đ c pha loãng vào trong đĩa đ m trên buồng đ m, đ y
bằng kính đ y v t. T t c các buồng đ m và kính đ y v t ph i đ c lau th t
s ch. Th tích m u ch a trong buồng đ m là kho ng không gian gi a đĩa đ m
và kính đ y v t, không đ m u tràng ra bên ngoài rãnh c a đĩa. Sau khi đ t
m u, đ yên kho ng 5 phút đ ổn đ nh v trí c a các t bào trong buồng đ m.
Đ m ng u nhiên kho ng 50-100 ô nh . Tính trung bình s l ng vi khu n trong
t t c các ô đã đ m. Sau đó nhân v i 20 000 và v i đ pha loãng m u tr c khi
đ m đ có đ c s l ng t bào trong 1ml. Lặp l i hai l n hay nhi u h n đ l y
giá tr s đ m trung bình. Đ i v i các vi sinh v t t thành từng c m, không th
phân bi t từng t bào thì m i c m đ c xem là m t vi khu n.
V i nh ng kinh nghi m c a m i cá nhân v đ pha loãng, thao tác kỹ
thu t thành th o có th nh n đ c các s đ m chính xác. Tuy v t k t qu có
chính xác hay không còn ph thu c vào s s ch s c a buồng đ m, kính đ y
v t nhằm đ m b o không có vi khu n khác không ph i từ m u hi n di n trong
buồng đ m và trong kính đ y v t.
3.1.2 Kỹ thu t đ m Breed
Kỹ thu t này r t h u ích trong vi c xác đ nh tổng s vi sinh v t bằng
ph ng pháp đ m tr c ti p. Lame kính Breed có m t vùng có di n tích 1cm2
đ c đánh d u trên lame. Dùng b m tiêm, hay que c y vòng cho 0,01ml m u
c n đ m vào trong vùng này, s y khô bằng ngọn lửa sau đó nhu m v i methyl
blue. Khi đ m, cho d u nhúng lên di n tích vùng c n đ m. Thông th ng vùng
này có đ ng kính 0,16 mm. Di n tích vùng đ m là pr2 hay 3,14 x 0,08 x 0,08
= 0,02mm2. V i di n tích này chi m 1/5000 trong tổng di n tích đặt m u là
100mm2 hay th tích trong vùng đ m là 1/5000 x 0,01ml. Nh v y n u có 1 vi
sinh v t trong vùng đ m thì t ng đ ng v i 5000/0,01ml hay 500 000 t
bào/ml. S đ m c a các vi sinh v t trong các vùng khác nhau c a vùng qui c
đ c tính bằng công th c nh sau:
4
2
Nx4x10
C =
dπ
d: đ ng kính v a vùng đ m
N: s l ng t bào trong 1 vùng
C: s t bào trong 1ml
Khi sử d ng kính hi n vi huỳnh quang v i các ch t nhu m khác nh
acridin cam (AODC), 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein
isothiocyanate (FITC) cũng đ c sử d ng r ng rãi đ đ m s l ng vi khu n.
Các nghiên c u c a K.G. Porter và Y.S. Feig cho th y rằng khi sử d ng DAPI
đ đ m s l ng vi khu n trong n c cho k t qu t t h n khi sử d ng ch t
nhu m AODC khi trong m u n c có nhi u ch t dinh d ng và nhi u phiêu
sinh v t khác. V đ b n tính phát huỳnh quang c a DAPI cũng cao h n

AODC. Hai tác gi trên cũng ch ng minh rằng khi nhu m v i DAFI có th b o
qu n trong t i đ n 24 tu n mà c ng đ phát quan không thay đổi. Trong khi
đó AODC c ng đ và s l ng phát quang b gi m khi b o qu n trong vòng 1
tu n c ng đi u ki n.
3.1.3 Đ m bằng kính hi n vi huỳnh quang
M t kỹ thu t khác d a trên nguyên tắc nhu m màu đặc hi u DNA đ c
gọi là Hoechst 33258 cũng đ c sử d ng đ nhu m và đ m s l ng vi sinh v t
trên kính hi n vi huỳnh quang. Ph ng pháp này nh sau: Bisbenzumide k t
h p v i vùng DNA giàu adenine và thyamine sau khi gắn ph c h p này s phát
huỳng quang. Hoechst 33258 đ c sử d ng nhi u trong vi c đ nh l ng vi sinh
v t trên b mặt. Đặt bi t trên b mặt có gắn các acridine orange. M t s thu n
l i khác khi sử d ng ph ng pháp nhu m màu bisbenzimide cho phép đ m s
l ng vi sinh v t trong các d ng d ch ch t t y rửa, trong mu i dùng cho các
phòng thí nhi m hay trong các ch ph m sinh học khác mà không có s hi n
di n c a DNA. Ph ng pháp đ m s l ng vi sinh v t bằng ph ng pháp phát
huỳnh quang đ c ng d ng r ng rãi trong vi c phân tích các m u môi tr ng
nh n c đ t ….
Sử d ng d u nhúng phát quang th p là m t phát minh quan trọng trong
vi c h n ch s phát huỳnh quang c a các màng lọc. Màng carbonate
Nuclepore là m t màng cellulose cao c p dùng trong vi c đ m tr c ti p vi
khu n b i vì chúng có kích th c lổ đồng nh t và b mặt màng phẳng, chúng
có th gi l i t t c các vi sinh v t trên b mặt c a chúng. Màng Nuclepore có
th nhu m v i thu c nhu m Irgalan đen hay các lo i thu c nhu m phù h p
khác đ t o nên m t n n màu đen t ng ph n v i màu phát quang c a vi sinh
v t vì th vi c đ m đ c th c hi n d dàng. Khi sử d ng thu c nhu m là
acridine cam vi khu n và các vi sinh v t khác phát quang màu xanh hay màu
cam. Màu phát quang xanh hay cam là ph thu c vào tình tr ng sinh lý c a
từng vi sinh v t. Nh ng kh năng phân bi t t bào đang s ng hay t bào đã ch t
b i m u phát quang đôi khi đ a đ n s nh m l n. Sử d ng ADPI nhu m DNA
c a t bào vi khu n chúng đ a đ n s phát quang màu xanh d ng đ c cho là
t i u h n so v i vi c sử d ng acridin cam đ nhu m các vi khu n có kích
th c nh .
S đ m nh n đ c từ ph ng pháp đ m tr c ti p trên kính hi n vi phát
huỳnh quang luôn cho k t qu cao t ng đ ng hai l n so v i k t qu nh n
đ c bằng kỹ thu t nuôi c y khác. Nh ng vi khu n có kích th c nh , có hình
d ng b t th ng khác cũng đ u có th nhìn th y bằng ph ng pháp phát huỳnh
quang. M t s d ng vi sinh v t không th nuôi c y trong các môi tr ng tổng
h p trong phòng thí nghi m. Hi n t ng không th nuôi c y c a các vi sinh v t
cho đ n nay v n ch a rõ là do chúng thoái hoá, không th nhân lên trong các
môi tr ng nhân t o hay do không đáp ng đ c các đi u ki n sinh lý c n thi t

cho s phát tri n c a chúng. Trong m t s tr ng h p, s t ng quan cao gi a
ph ng pháp đ m tr c ti p bằng ph ng pháp phát huỳnh quang và ph ng
pháp đ m khu n. Tuy nhiên trong m t s tr ng h p khác s t ng quang này
r t kém. S khác bi t gi a ph ng pháp đ m tr c ti p và ph ng pháp đ m
khu n l c ph n ánh s chọn lọc c a môi tr ng và đi u ki n nuôi c y, m t
ph n t bào b ch t hay b th ng tổn và s loài c th trong m u.
Giá tr c a s đ m tr c ti p bằng ph ng pháp phát huỳnh quang trên kính
hi n vi t ng đ ng v i v i s l ng vi sinh v t th t s có th có v i t t c các
loài khác nhau. Đi u đó cho phép c đoán đ c đ c s l ng th t s trong
n c bi n, trong n c t nhiên, trong trong m t lo i m u nào đó, mặt dù các loài
này có s khác bi t l n v s l ng c a từng ch ng loài, khác bi t v đặc đi m
sinh lý di n ra trong cùng đi u ki n c a m u. S đ m tr c ti p th ng ph n ánh
đúng v i sinh kh i, vì th th ng đ c dùng đ c l ng sinh kh i vi sinh v t
có trong m u. Tuy nhiên đ có đ c s đ m chính xác bằng kính hi n vi phát
huỳng quang c n ph i đ m nhi u l n và nhi u v trí khác nhau trên m u.
Thêm vào đó n u đ m nhi u t bào đang phân chia có th cho phép c
đoán t c đ phát tri n c a vi sinh v t trong m u. T n su t c a t bào đang phân
chia đ c nhìn th y có m i liên h v i ch s đo khác c a t c đ phát tri n vi
sinh v t nh t c đ tổng h p RNA đ c đo b i s phòng thích c a adenine đ c
đánh d u. T ng xu t c a t bào đang phân chia đ c tính bằng th i gian gi a lúc
bắt đ u s thắt c a t bào đ n khi t bào phân chia là m t hằng s . Con s này
không ph i là b t bi n. Th t khó khăn đ nh n ra s phân chia t bào khi sử d ng
kính hi n vi quang học mà không sử d ng kính hi n vi phát huỳnh quang.
3.2 Các kỹ thu t đ nh l ng vi sinh v t trong m u bằng ph ng pháp
nuôi cấy
Có hai cách đ xác đ nh s l ng vi khu n bằng ph ng pháp nuôi c y:
ph ng pháp đ m khu n l c và ph ng pháp c đoán s l ng vi khu n
(MPN – Most probable number). T t c các ph ng pháp đ nh l ng vi khu n

trong m u bằng ph ng pháp nuôi c y đ u yêu c u các t bào ph i đ c tách
r i nhau, qua quá trình nuôi c y các t bào này phát tri n thành các dòng riêng
bi t. T t các qui trình đ nh l ng bằng ph ng pháp nuôi c y nhằm chọn lọc
m t hay nhi u nhóm vi khu n nh t đ nh nào đó, m c đ chọn lọc ph thu c và
từng qui trình qui trình c th . Đ xác đ nh tổng s vi sinh v t trong m u ph i
chọn qui trình gi m t i thi u kh năng chọn lọc. Nh ng dù m c đ chọn lọc
m c t i thi u cũng ch đ nh l ng đ c s l ng vi sinh v t có th nuôi c y.
Còn m t s l ng l n vi sinh v t khác không th phát tri n đ c trong quá
trình nuôi c y thì không th đ nh l ng đ c bằng ph ng pháp này. Có các
ph ng pháp đ nh l ng nuôi c y nh sau nh sau:
3.2.1 Ph ng pháp đ m khu n l c
Ph ng pháp đ m khu n l c trên đĩa đ c sử d ng r ng rãi đ đ nh l ng
vi sinh v t, đặc bi t là vi khu n, nh ng pháp này có nh ng khuy t đi m và đã
có nh ng cách nhìn nh n khác nhau v mặt khoa học. Khuy t đi m c a ph ng
pháp này nằm trong s l m d ng đ bi u đ t sai các k t qu . T t c mọi ng i
đ u mắc sai l m khi nh n ra rằng ph ng pháp này không th dùng đ thu đ c
k t qu tổng s vi sinh v t.
Ph ng pháp đ m khu n l c sử d ng nhi u lo i môi tr ng và các đi u
ki n nuôi c y khác nhau. Agar là ch t th ng đ c dùng đ làm đặc các môi
tr ng nuôi c y vì h u h r các vi sinh v t đ u m t các gen tổng h p enzym
phân gi i agar. Các m u đã đ c pha loãng đ trãi lên b mặt môi tr ng agar
(ph ng pháp trãi) hay khuy t tán vào trong nôi tr ng tr c khi làm đặc
(ph ng pháp đổ đĩa). M t v n đ c n ph i cân nhắc là các vi sinh v t c n xác
đ nh có th tồn t i và phát tri n trong môi tr ng agar hay không. M t s vi
sinh v t có th b ch t khi trãi trên b mặt môi tr ng trong qui trình c y tr i b
mặt. M t s loài vi khu n khác không th s ng trong đi u ki n nhi t đ duy trì
tr ng thái l ng c a agar trong qui trình đổ đĩa. B i vì agar ch là tác nhân làm
rắn môi tr ng nuôi c y trong qui trình đ nh l ng vi sinh v t vì th trong m t
s tr ng h p agar có th đ c thay th bằng các tác nhân làm rắn khác. Trong
m t s tr ng h p các vi sinh v t có các nhu c u dinh d ng đặc bi t khác, các
ch t nh silicagel có th đ c thay th đ làm rắn môi tr ng. Nh ng vì chu n
b môi tr ng silicagel khó khăn h n chu n b môi tr ng agar nên ch dùng
môi tr ng silicagel khi không th thay th đ c môi tr ng agar.
Ph ng pháp ng cu n đ c dùng đ đ nh l ng các vi sinh v t kỵ khí bắt
bu c. Đây là m t ph ng pháp c i biên c a ph ng pháp đổ đĩa. Các đĩa hay
các ng sau khi c y vi khu n đ c trong đi u ki n nhi t đ đặc bi t trong m t
th i gian nh t đ nh đ cho sinh v t phát tri n thành các khu n l c có th nhìn
th y bằng mắt tr ng, s l ng khu n l c xu t hi n trên đĩa s đ c đ m. S
l ng khu n l c s đ c gán cho s t bào đ n lẻ trong m u ban đ u. Đ s
l ng khu n l c ph n ánh đ c s l ng t bào vi khu n, m u ph i đ c phân

tán đ u vào trong môi tr ng hay trên b mặt môi trt ng rắn. Nh ng đĩa có
quá nhi u khu n l c xu t hi n thì không th cho s l ng đ m chính xác b i vì
chúng có th chồng l p lên nhau. Nh ng đĩa có quá ít khu n l c cũng ph i b đi
vì theo nguyên tắc c a xác su t.
Nh ng v n đ chính y u c n xem xét trong qui trình đ m khu n l c là
thành ph n môi tr ng, đi u ki n và th i gian nuôi . Môi tr ng đ đ nh
l ng các vi sinh v t d d ng không th c đ nh nit ph i ch a các nguồn
nit , carbon, phosphate d sử d ng và các cation, anion c n thi t nh sắt,
mangie, calci, natri, clo và sulphate. Thành ph n c a các hàm l ng không nh t
đ nh, chúng đặt thù cho từng lo i môi tr ng và từng lo i m u nh t đ nh đ có
th nh n đ c s l ng vi sinh v t m c tiêu cao nh t. Nh v y môi tr ng nuôi
c y ph i có các thành ph n dinh d ng phù h p v i từng yêu c u c a loài vi
sinh v t, bao gồm c các nhân t c n thi t khác cho s phát tri n c a m t h vi
sinh v t nh t đ nh. M c đích chung c a môi tr ng là hàm l ng dinh d ng
ph i cao h n các thành ph n có trong các m u đang phân tích. Hàm l ng dinh
d ng trong các lo i môi tr ng đ m tổng s vi sinh v t ph i đ cao, và đ c
tính c a môi tr ng đ i v i sinh v t m c th p nh t.
Đ nâng cao hi u qu c a qui trình đ nh l ng vi sinh v t bằng ph ng
pháp đ m khu n l c, các đi u ki n c n ph i đi u ch nh sao cho ch có các thành
viên vi sinh v t c n phát hi n theo đ nh nghĩa đ c đ m. Các môi tr ng đ m
đĩa đ c chọn lọc hay phân bi t v i các thành viên vi sinh v t khác. Qui trình
đ m đĩa chọn lọc đ c thi t k cho thích h p v i s phát tri n c a vi sinh v t
mong mu n. S phát tri n c a các nhóm vi sinh v t khác đ c lo i b b i các
thành ph n c a môi tr ng hay đi u ki n nuôi . Môi tr ng phân bi t là môi
tr ng không lo i b các nhóm vi sinh v t không mong mu n mà ng c l i cho
phép chúng phát tri n cũng trên môi tr ng đó nh ng có th bi t phân bi t các
nhóm vi sinh v t mong mu n v i các nhóm khác bằng các đặc đi m nh n d ng.
Môi tr ng cũng có th đ c thi t l p đ chọn lọc các loài n m m c. Mặt
dù kỹ thu t đ m khu n l c không ph i là ph ng pháp đ c chọn cho vi c xác
đ nh s l ng n m m c trong các m u th c ph m và trong môi tr ng. B i vì
kỹ thu t này ch thích h p cho vi c đ nh l ng các loài vi sinh v t không có s i
hay bào tử. Dĩ nhiên ph ng pháp đ m khu n l c cũng thích h p cho vi c đ nh
l ng các loài n m men. Vì s l ng c a vi khu n luôn nhi u h n s l ng c a
n m m c nên đ ngăn c n s phát tri n c a vi khu n trong các khu n l c c a
n m m c, các tác nhân c ch vi khu n đ c thêm vào trong các môi tr ng
nuôi c y. Các thu c nhu m bengal rose và các kháng sinh nh streptomycine,
neomycine th ng đ c sử d ng là nh ng tác nhân c ch vi khu n. M t bi n
pháp đ n gi n đ c ch s phát tri n c a vi khu n là h th p pH c a môi
tr ng nuôi c y xu ng kho ng 4,5 - 5,5. H u h t các n m m c đ u không b tác
đ ng khi phát tri n trong kho ng pH này nh ng khi đó vi khu n b c ch .

Môi tr ng chọn đ c xác l p công th c đ c ch s phát tri n c a nhóm
vi sinh v t và cho phép m t nhóm vi sinh v t khác phát tri n. Ví d môi tr ng
Saubouraud Dextrose Agar đ c dùng đ đ nh l ng n m m c d a trên nguyên
tắc pH th p và nguồn carbohydrate. Bổ sung vào môi tr ng các ch t kháng
sinh khác nh peniciline hay methyl bule là nh ng tác nhân c ch vi khu n
gram âm. Các vi sinh v t kháng kháng sinh cũng có th đ c đ nh l ng trên
môi tr ng bằng cách thêm vào đó m t li u l ng kháng sinh.
Môi tr ng phân bi t đ c thi t l p d a trên nhi u cách. Các thu c thử
đ c thêm vào trong môi tr ng đ cho phép nh n ra các s khác bi t c a
nh ng vi sinh v t mong mu n. Có th thêm thu c thử vào môi tr ng sau khi
nuôi c y đ nh n ra các loài vi sinh v t đặc tr ng c n tìm. Chìa khoá nâng cao
kh năng phân bi t c a môi tr ng là qui trình nuôi c y đ cho phép môi
tr ng phân bi t m t cách t t nh t v i vi sinh v t c n đ nh l ng và các vi sinh
v t khác có trong m u.
Môi tr ng Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là nh ng môi
tr ng đ c sử d ng r ng rãi trong vi c phân tích vi sinh v t trong n c.
Nh ng môi tr ng này bao gồm tính chọn lọc và tính phân bi t. Chúng chọn
lọc cho s phát tri n c a các vi khu n gram âm b i trong đó có thêm vào các
tác nhân c ch các vi khu n gram d ng. Môi tr ng này có th phân bi t các
vi khu n có th sử d ng lactose b i s hình thành các khu n l c có th phân
bi t bằng màu sắc. Trên môi tr ng EMB, vi khu n thu c nhóm coliforms là
nhóm gram âm t o nên nh ng khu n l c có màu tím ánh kim. Đ nh l ng s
l ng coliform bằng cách đ m s l ng khu n l c có các đặc đi m này. Cách
này th ng xuyên đ c s d ng trong vi c phân bi t các vi sinh v t ch th
trong n c và trong th c ph m.
V i kỹ thu t đ n khu n l c, các m u c n phân tích ph i đ c pha loãng
thành chu i pha loãng liên ti p và đ c xác đ nh m t vài nồng đ pha loãng
nh t đ nh đ c y vào các môi tr ng đã chọn phù h p v i các đ i t ng c n
xác đ nh. Mổi khu n l c đ c hình thành đ c gán cho m t đ n v hình thành
khu n l c (cfu-colony forming units). Kỹ thu t th ng qua các b c nh sau:
Dung d ch pha loãng: m t s dung d ch dùng đ pha loãng có th làm ch t
t bào nh : n c mu i, n c c t. Các dung d ch pha loãng không đ c dùng
ngay khi l y ra từ t l nh có th gây s c và làm cho vi sinh v t không th phát
tri n đ c. Dung d ch pepton water là dung đ ch pha loãng đ c sử d ng nhi u
nh t và đ c xem là dung d ch pha loãng cho t t c các lo i m u. N u trong
m u còn có m t ít các ch t khử trùng thì ph i thêm vào dung d ch pha loãng tác
nhân gi m thi u kh năng khử trùng c a chúng, ví d : n u trong m u còn d
l ng c a các h p ch t amonium (NH4-) thì có th thêm vào đó Tween 80 hay
lecithin. Ng c l i n u trong m u có ch a các h p ch t chlorin hay iodin thì
c n thêm vào đó các mu i nh sodium thiosulphate.

Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
B m chính xác 9ml dung d ch pha loãng vào trong ng nghi m có nắp
đ y. N u sử d ng các ng nghi m có nắp không đóng chặc đ c thì ph i khử
trùng ng nghi m, sau đó b m dung d ch pha loãng vào, các thao tác này ph i
đ c th c hi n m t cách vô trùng. Phân ph i dung d ch pha loãng vào các ng
sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đ m b o th tích dung d ch pha loãng không
b m t do quá trình khử trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thu c vào từng lo i
m u. C th nh sau:
- N u pha loãng các m u là ch t l ng, tr c khi pha loãng m u ph i đ c
lắc kỹ, cắm đ u pippette sâu vào trong m u kho ng 1” hút ra 1ml, cho vào
trong ng ch a dung d ch pha loãng đ u tiên, lắc kỹ ng nghi m ch a m u, b
pippette vừa sử d ng, dùng m t pipptte m i th c hi n l i thao tác nh trên v i
các đ pha loãng ti p theo. C ti p t c nh v y cho đ n khi đ t đ c đ pha
loãng mong mu n. M i đ pha loãng ch đ c phép sử d ng 1 pippette. Hàm
l ng m u trong 1ml dung d ch các đ pha loãng c a dãy nh sau:
ng s 1 2 3 4
T l pha
loãng
1/10 1/100 1/1000 1/10000
Th tích m u
ban đ u (ml)
0,1 0,01 0,001 0,0001
Đ pha loãng 10-1
10-2
10-3
10-4
- Đ i v i các m u rắn hay bán l ng, các thao tác đ c ti n hành nh sau:
cân 10 g m u vào trong các bao d p m u hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml

dung d ch pha loãng và đồng nh t m u, ph i đ m b o sao cho vi khu n phân
tán đ u vào trong dung d ch. Sau khi m u và dung d ch pha loãng đ c đồng
nh t ta đ c dung d ch pha loãng 1/10. Các đ pha loãng sau đ c ti n hành
t ng t nh ph n pha loãng m u l ng. Trong 1ml các dung d ch pha loãng
ch a hàm l ng m u nh sau:
ng s 1 2 3 4
T l pha
loãng
1/10 1/100 1/1000 1/10000
Th tích m u
ban đ u (g)
0,1 0,01 0,001 0,0001
Đ pha loãng 10-1
10-2
10-3
10-4
Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa
Các môi tr ng agar đ c đun ch y trong các chai hay trong các ng
nghi m có th tích phù h p. Đ c làm mát trong các b đi u nhi t 45o
C.
Hút 1ml m i dung d ch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. M i đ
pha loãng th ng đ c c y vào hai đĩa petri hay nhi u h n. Cũng s d ng các
pippette s ch cho m i đ pha loãng. Ch chọn c y vào đĩa petri nh ng đ pha
loãng có m t đ vi sinh v t phù h p, th ng trong kho ng 25-300 t bào/ml.
Đ vào m i đĩa đã c y 10-15ml môi tr ng đã đ c đun ch y và làm ngu i, lắc
đĩa theo chi u và ng c chi u kim đồng hồ kho ng 5-6 l n, đặc đĩa lên mặt
phẳng ngang và đ i cho đ n khi môi tr ng trong đĩa đông đặc. L t ng c đĩa
và trong đi u ki n nhi t đ và th i gian xác đ nh.
Cấy mẫu trên bề mặt
Đây là ph ng pháp thay th cho ph ng pháp đổ đĩa đ phân tích các ch
tiêu vi sinh trong th c ph m, nh t là các ch tiêu vi sinh v t nh y c m v i nhi t đ
nh Pseudomonas, các vi sinh v t này s b suy y u khi ti p xúc v i nhi t đ c a
môi tr ng agar tr ng thái l ng. Ph ng pháp này cũng đ c dùng đ phân tích
các ch tiêu mà các dòng nh n đ c ph i c y chuy n các b c ti p theo.
C y 0,1ml hay th tích phù h p lên b mặt bằng pipettes hay bằng que c y
lên đĩa môi tr ng đã đ c làm khô và tr i đ u bằng que c y trang hay que c y
vòng đ trãi m u trên khắp b mặt môi tr ng. U các đĩa đã c y đi u ki n
nhi t đ và th i gian xác đ nh tuỳ theo từng ch tiêu phân tích, đ m các khu n
l c đặc tr ng hay t t c các khu n l c xu t hi n trên đĩa.
Khi đ m các khu n l c, trong m t s tr ng h p xu t hi n các khu n l c
mọc lan, thông th ng các khu n l c khác cũng đ c nhìn th y bên trong các
v t khu n l c loang. Khi đ m ta ch coi khu n l c loang là m t đ n v hình

thành khu n l c và đ n các khu n l c khác trong khu n l c loang. Các khu n
l c loang này là do các vi khu n t p trung thành từng t p đoàn trong quá trình
phát tri n.
Đếm khuẩn lạc trong trường hợp cấy trang hay đổ đĩa
Đ m t t c các khu n l c đ n lẻ trên các đĩa c y đã chọn, thông th ng
chọn các đĩa có s l ng khu n l c trong kho ng 30 - 300 khu n l c. Th ng
dùng các bút có th vi t lên thuỷ tinh đ đánh d u các khu n l c đã đ m phía
sau đĩa petri. Có th dùng các thi t b hổ tr trong quá trình đ m s l ng
khu n l c nh máy đ m hay kính lúp. Tính toán s đ n v hính thành khu n l c
theo các công th c th ng kê d a trên th tích m u c y, s l ng khu n l c trên
các đĩa, đ pha loãng đã c y và s l ng đĩa c a m i đ pha loãng. Thông
th ng s đ n v hình thành khu n l c trong m t gram m u hay 1ml đ c tính
toán ít nh t từ hai n ng đ pha loãng liên ti p c a m u. Các t ng trình k t qu
đ c bi u di n d i d ng s đ n v hình thành khu n l c/g (ml) (cfu/g). Không
bi u di n k t qu d i d ng s vi khu n/g(ml).
Phương pháp đểm khuẩn lạc trên ống
Thay vì dùng đĩa petri, có th dùng ng nghi m có đ ng kính l n hay các
chai nh có nắp đ thay th . C y m u vào, cho môi tr ng vào, lắc theo chi u
ngang cho đ n khi môi tr ng trong chai hay ng đ ng đặc.
Phân ph i 2-4 ml môi tr ng có hàm l ng agar cao h n các môi tr ng
dùng cho đổ đĩa kho ng 0,5-1% vào ng nghi m có nắp v i th tích 25ml, môi
tr ng đã đ c làm ngu i đ n 45o
C, c y vào ng nghi m 0,1ml m u đã đ c
pha loãng. Lắc các ng theo chi u ngang trong n c l nh cho đ n khi agar
đ ng đặc t o thành m t màng film đồng nh t trên thành ng nghi m. Vì th kỹ
thu t này c n có nh ng kỹ năng khéo léo. M t ph ng pháp khác có th đ c
dùng là sử d ng m t m u n c đá, đặt lên trên m t m nh v i và làm m t đ ng
r nh bằng v i ng nghi m bằng các xoay tròn ng nghi m đặt ngang trên
mi ng băng. Các ng nghi m đã c y m u và môi tr ng đ c xoay trên m nh
Máy đ m khu n l c Máy đ m khu n l c
t đ ng

c a mi ng băng. V i ph ng pháp này, các ng i th c hi n có th ti t nhi n
đ c nhi u th i gian và s c lao đ ng.
Các ng sau khi c y m u đ c l t ng c đ tránh s ng ng t h i n c
gây nên v t loang sau khi . Đ m các khu n l c xu t hi n trong l p màng fiml
agar xung quanh ng, các khu n l c nằng sâu bên trong có th đ c quan sát
bằng kính lúp.
Ph ng pháp dùng kỹ thu t ng xoay đ c sử d ng nhi u trong vi c phân
tích các m u s a và các s n ph m c a s a, các lo i m u th c ph m công
nghi p. Cho đ n nay đã có nh ng thi t b thay th cho vi c xoay ng, đ m b o
các màng film trên thành ng đồng nh t và ti t ki m đ c th i gian cũng nh
công lao đ ng.
Phương pháp cấy theo đường xoắn ốc
Ph ng pháp này d a trên s hổ tr c a m t thi t b xoay. Thi t b này có
th ho t đ ng hoàn toàn t đ ng và cũng có th ho t đ ng không t đ ng. Thi t
b này s phân ph i m t l ng m u xác đ nh lên b mặt đĩa đang xoay tròn.
Đi m ti p xúc c a m u và đĩa môi tr ng bắt đ u từ trung tâm đĩa và di chuy n
d n ra bên ngoài theo đ ng xoắn c. Sau khi làm khô b mặt môi tr ng, đĩa
đ c trong đi u ki n xác đ nh, vi khu n s phát tri n theo đ ng xoắn c.
Càng xa tâm c a đĩa, m t đ vi sinh v t sẻ gi m d n và s xu t hi n các khu n
l c riêng bi t.
Căn c vào t c đ xoay c a thi t b , th tích m u phân ph i và kích th c
c a đĩa, m t đ khu n l c xu t hi n vòng xoắn cu i cùng s tính đ c m t đ
vi sinh v t trong m u. K t qu tổng s đ n v hình thành khu n l c đ c xác
đ nh bằng ph ng pháp này đ c cho là t ng đ ng v i ph ng pháp đổ đĩa
hay c y tr i trên b mặt. Các h th ng t đ ng đ c thi t k d a trên nguyên
tắc c y xoay đ c thi t k v i s h tr c a các máy đ m khu n l c bắn tia
laser đã đ c bán ngoài th tr ng r t thu n ti n cho vi c phân tích tổng s vi
sinh v t và cho k t qu chính xác trong th i gian nuôi c y ngắn.
Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc
Ph ng pháp này th ng đ c áp d ng cho các m u l ng nh n c,
s a… và đ c đánh giá là cho k t qu chính xác h n so v i ph ng pháp c
đoán MPN. Các m u ch t l ng đ c lọc qua màng lọc có kích th c lổ lọc nh
h n kích th c c a vi sinh v t. Vi sinh v t đ c gi a l i trên màng lọc. Màng
đ c đặt trên môi tr ng agar hay trên gi y th m đ c ng m s n môi tr ng
nuôi c y l ng đã chọn và trong đi u ki n xác đ nh. Sau khi , đ m các khu n
l c s xu t hi n trên b mặt màng lọc.
Thi t bi lọc có th bằng th y tinh, bằng kim lo i hay bằng nh a, bao gồm
ph u lọc giá đ màng lọc, b thi t b hổ tr hút chân không và bình ch a. Màng
lọc đ c làm bằng cellulose ester có l lọc mằm trong kho ng 0,1-1 µm, các

lo i màng lọc dùng cho vi c phân tích tổng s vi sinh v t th ng có kích th c
lổ lọc là 0,47µm, đ ng kính màng lọc có nhi u kích c khác nhau phù h p v i
đ ng kính c a ph u lọc, b dày c a màng kho ng 120µm. Khi lọc t t c các vi
khu n đ u đ c gi l i trên màng. Khi đặc màng lọc sao cho b trên c a màng
h ng lên phía trên, vi khu n không ti p xúc tr c ti p v i môi tr ng nh ng,
các thành ph n c a môi tr ng d dàng th m qua màng và nuôi vi khu n phát
tri n thành khu n l c. M t s lo i màng lọc có gắn các l i kỵ n c ch cho
phép khu n l c phát tri n trong m i ô c a l i và không cho lan sang các ô
khác nhằm t o đi u ki n thu n ti n khi đ m.
Các b ph n c a thi t b lọc

3.2.2 Ph ng pháp c đoán s l ng vi sinh bằng kỹ thu t MPN
(Most Probable Number):
Ph ng pháp MPN là ph ng pháp có th thay th ph ng pháp đ m
khu n l c đ xác đ nh m t đ vi sinh v t trong m u, ph ng pháp này đ c d a
trên nguyên tắc xác su t th ng kê s phân phân b vi sinh v t trong các đ pha
loãng khác nhau c a m u. M i đ pha loãng đ c nuôi c y lặp l i nhi u l n
trong các môi tr ng l ng đã đ c chọn, thông th ng ph i c y lặp l i từ 3-10
l n t i m i nồng đ pha loãng. Các đ pha loãng đ c ti n hành sao cho trong
các l n lặp l i có m t s l n cho d u hi u d ng tính và m t s l n cho d u
hi u âm tính. S l n lặp l i cho d u hi u d ng tính và âm tính đ c ghi nh n
đ đ i chi u v i b ng th ng kê s đ c giá tr c đoán s l ng vi sinh v t
trong m u. Qui trình MPN cho giá tr s l ng vi sinh v t trong m u có ý nghĩa
th ng kê theo xác su t phân b vi sinh v t trong m u khi sử d ng m t s l n lặp
l i, vì th kho ng tin c y là r t l n. Ph ng pháp MPN đ đ nh l ng vi sinh
v t cho đ n nay đã có nhi u c i ti n cho phép ti n hành qui trình d dàng và t n
ít s c lao đ ng h n và cho giá tr chính xác cao h n.
Chọn nồng đ pha loãng sao cho trong các l n lặp l i có m t s l n cho
k t qu d ng tính và m t s l n cho k t qu âm tính , s l a chọn này r t quan
trọng. Trong nhi u tr ng h p qui trình MPN đ c thi t l p sao cho gia tăng s
l ng l n lặp cho k t qu d ng tính bằng tín hi u phát tri n c a vi sinh v t.
Trong m t s tr ng h p khác, qui trình đ c thi t l p có nhi u thử nghi m
khẳng đ nh sau khi các l n lặp l i các đ pha loãng cho tín hi u phát tri n c a
vi sinh v t nh phát hi n protein hay m t emzym nào đó. Các thử nghi m sau
này cho k t qu d ng tính thì các l n lặp l i ban đ u m i đ c khẳng đ nh là
d ng tính. Cũng gi ng nh qui trình đ m khu n l c, qui trình MPN cũng đ c
sử d ng các môi tr ng chọn lọc, không chọn lọc hay môi tr ng phân bi t.
Ph ng pháp MPN cũng đ c dùng đ đ nh l ng virus đ ng ru t.
Trong ph ng pháp này, m t chu i pha loãng c a m u c n ki m tra đ c cho
vào trong các ng nghi m ch a t bào ch thích h p đ c nuôi c y. Sau khi ,
các ng nghi m đ c ki m tra hi u ng cytopathic (CPE), đó là các bi u hi n
làm ch t t bào b xâm nhi m. S l ng virus trong m u cũng nh n đ c từ
b ng MPN bằng s tham chi u s l ng các ông nuôi c y cho hi u ng CPE
d ng tính. S l ng c a virus cũng có th đ c đ nh l ng bằng ch s TCID
50 (Tissue culture infectious dose 50%). Nồng đ pha loãng th p nh t có s
hi n di n c a virus đó là n ng đ có t s CPE là 50% trong các ng nghi m.
Cũng gi ng nh qui trình đ m đĩa, trong ph ng pháp MPN, môi tr ng
và nồng đ nuôi c y cũng đ c đi u ch nh đ chọn lọc cho m t nhóm vi sinh
v t hay phân bi t các nhóm vi sinh v t này v i các nhóm vi sinh v t khác v i
các đặc đi m mong mu n, r ràng rằng s k t h p gi a đi u ki n nuôi c y và
môi tr ng cũng có th đ nh l ng nh ng nhóm vi sinh v t đặc bi t nào đó

theo đ nh nghĩa c th . M i qui trình ph i đ c chọn lọc m t cách c th và
c n th n đ có th thu đ c k t qu m t cách chính xác.
Theo quan đi m c a C.H. Collins và Patricia M. Lyne th c ch t con s
MPN bi u di n s l ng vi sinh v t trong m u là s l ng trung bình sau các
l n lặp l i. N u s l ng vi sinh v t trong m u l n thì s khác bi t c a các m u
gi a các l n lặp l i là nh , k t qu riêng lẻ c a t t c các l n lặp g n v i k t qu
trung bình. N u s l ng vi sinh v t trong m u nh , s khác bi t này s l n.
N u trong m t m u ch t l ng ch a 100 vi sinh v t/100 ml, thì trong 10 ml m u
s ch a trung bình 10 t bào. Dĩ nhiên có m t s ph n m u nhi u h n 10 t
bào, th m chí có nh ng ph n m u có th ch a 20 t bào trong 10ml m u và m t
s ph n m u ch a ít h n. N u t t c các ph n m u trên đ c nuôi c y trong
môi tr ng và đi u ki n thích h p, các vi sinh v t trong m u s phát tri n và
cho tín hi u d ng tính.
T ng t nh v y, 1ml s ch a trung bình 1 t bào vi sinh v t, nh v y có
nh ng l n l y s có 2 hay 3 t bào và có nh ng l n l y s không có t bào nào.
N u các l n hút này đ c nuôi c y trong môi tr ng và đi u ki n thích h p s
thu đ c nh ng ng nghi m cho k t qu d ng tính và nh ng ng cho k t qu
âm tính.
N u hút 0,1ml thì sau 10 l n hút m i có kh năng nh n đ c 1 l n hút có
1 t bào, nh v y h u h t các l n nuôi c y khi l y 0,1ml thì đ u cho k t qu
âm tính.
Có th tính toán con s chắc chắn s l ng vi sinh v t trong trong 100ml
m u bằng s k t h p các k t qu nh n đ c từ các chu i c y nh trên. B ng giá
tr MPN khi sử d ng h th ng c y v i các dãy 5 ng 10ml, 5 ng 1ml và 5 ng
0.1ml đã đ c tính sẵn và dùng cho phân tích các m u n c hay các m u đã
pha loãng. Cho đ n nay có r t nhi u b ng giá tr MPN đ c sử d ng v i đ
chính xác và các kho ng tin c y khác nhau và đ c sử d ng cho các m c đích
khác nhau.
Ph ng pháp MPN đ c dùng ch y u đ phân tích Coliforms và các vi
sinh v t khác khi chúng phát tri n trong môi tr ng nuôi c y l ng cho các tín
hi u d dàng nh n d ng nh sinh h i, làm đ c môi tr ng chọn lọc, thay đổi
pH môi tr ng … Ví d n m men và n m m c trong n c trái cây hay rau qu ,
vi sinh v t kỵ khí hay các bào tử Clostridia.
3.2.3 Ph ng pháp lai khu n l c
Lai khu n l c là ph ng pháp k t h p gi a ph ng pháp lai phân tử và
ph ng pháp nuôi c y truy n th ng trong vi c phân tích các ch tiêu vi sinh v t
trong các m u. Sau th i gian nuôi c y trên b mặt môi tr ng th ch, các khu n
l c vi khu n đ c chuy n lên màng lai, các khu n l c này đ c ly gi i trong
môi tr ng ki m hay xử lý bằng emzym, sau đó ti n hành lai phân tử. Ph ng

pháp này ph thu c vào kh năng phát tri n c a vi sinh v t m c tiêu trên môi
tr ng, chúng không ph thu c s phát tri n các các qu n th vi sinh v t khác.
S phát tri n c a vi sinh v t m c tiêu trong môi tr ng làm gia tăng s l ng
b n sao c a các gen m c tiêu, vì th chúng s gia tăng kh năng phát hi n c a
các m u dò.
Nguyên tắc c a ph ng pháp này đ c phát tri n đ u tiên b i M.
Grunstein và S.D. Hogness (1975) nhằm m c đích sàng lọc trên đĩa có m t đ
cao cho các dòng nuôi c y thu n. Trong qui trình nuôi c y khu n l c vi khu n
phát tri n trên môi tr ng rắn đ c chuy n lên m t giá đ phù h p nh màng
nitrocellulose, ly gi i đ tách DNA và bi n tính chúng sau đó c đ nh chúng
trên màng. Màng lọc c đ nh DNA đ c v i m u dò. M u dò đ c tách ra từ
m t đo n thông tin di truy n. Và đ c đánh d u bằng các các đ ng v phóng x
nh 32P hay các ch t phát quang khác nh biotin. Hi n t ng lai đ c din ra
n u các trình t base c a các t bào đ c ly gi i t ng đồng v i các trình t
trên m u dò đ hình thành các đo n lai m ch đôi. Các đo n lai này đ c phát
hi n bằng bằng các film phóng x t ghi khi các m u dò đ c đánh d u bằng
các đồng v phóng x , hay các film nh y sáng khi các m u dò đ c đánh d u
bằng biotin. Bằng ph ng pháp này, các đặc đi m di truy n đặc tr ng đ c
phát hi n m t cách chuyên bi t. N u chọn m u dò đặc tr ng cho m t nhóm vi
sinh v t, ph ng pháp này có th phát hi n và đ nh l ng nhóm vi sinh v t đó
trong m u.
M u dò đ c lai v i các vi sinh v t có nguồn g c từ m u, hay các dòng
thu n đ c phân l p và nuôi c y th c p. Bằng ph ng pháp này có th c i
thi n đ c các b t ti n trong quá trình phân tích bằng ph ng pháp nuôi c y
thu n tuý nh :
- Tránh đ c nh ng sai l ch trong quá trình đ m khu n l c trên môi
tr ng nuôi c y chọn lọc.
- Chắc chắn phát hi n đ c các dòng mang ki u gen m c tiêu c n phát hi n
dù các gen đó không hay bi u hi n r t kém trong m t s đi u ki n nuôi c y.
- Có th phân tích đ c các vi sinh v t b tress hay không th nuôi c y
đ c trên các môi tr ng chọn lọc bằng cách thay th bằng môi tr ng không
chọn lọc hay môi tr ng dinh d ng t i đa.
- Gi m đ c th i gian phân tích bằng cách gi m th i gian nuôi c y, quá
trình đ nh l ng gi đ nh và th i gian khằng đ nh ki u gen hay ki u hình.
Ph ng pháp lai khu n l c cũng đ c sử d ng đ khẳng đ nh các dòng vi
sinh v t nghi ng đã đ c làm thu n.
ng d ng ch yêu c a ph ng pháp lai khu n l c là phát hi n, đ nh l ng
và phân l p các vi sinh v t có ki u hình và ki u gen đặc tr ng. Và đ c sử d ng
đặc bi t trong vi c ki m soát s hi n di n và ho t đ ng c a các dòng vi sinh v t

trong môi tr ng. Nghiên c u s phân b các vi sinh v t kháng kháng sinh,
kháng kim lo i nặng trong n c trong các m u môi tr ng và trong th c ph m.
3.3 Ph ng pháp đo đ đ c
Là ph ng pháp gián ti p xác đ nh m t đ vi sinh v t. Đ nh l ng m t đ
t bào thông qua đo đ đ c bằng máy so màu các b c sóng từ 550 – 610 nm.
Ph ng pháp xác đ nh m t đ t bào theo đ đ c có th đ c dùng đ so
sánh m c đ tăng tr ng c a hai hay nhi u ch ng vi sinh v t trong môi tr ng
l ng. ph ng pháp này cho k t qu nhanh chóng và th ng đ c ng d ng
trong theo dõi hoặc nghiên c u đặc tr ng tăng tr ng c a các ch ng vi sinh v t
trong phòng thí nghi m hoặc trong s n xu t tuy nhiên không thích h p dùng
trong ki m nghi m vi sinh v t.
N
A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó:
n1Vf1 + …+ niVfi
A: s t bào vi khu n trong 1g hay 1ml m u
N: tổng s khu n l c đ m đ c trên các đĩa đã chọn
ni: s l ng đĩa c y t i đ pha loãng th i
V: th tích d ch m u (ml) c y vào trong m i đĩa
fi: đ pha loãng t ng ng

IV. ÁP D NG Đ I V I M T S VI SINH V T
GÂY B NH TRONG TH C PH M
4.1 Đ nh l ng Fecal Coliform và E. Coli bằng ph ng pháp đ m đĩa
Coliforms ch u nhi t: là nh ng vi khu n sinh tr ng cho khu n l c đi n
hình trên môi tr ng th ch Violet Red Bile 440
C trong 24 gi . Trong tr ng
h p nghi ng , vi khu n đ c khẳng đ nh b i s t o khí trong môi tr ng EC
broth 44 0
C trong 24 gi .
E. coli: là Coliforms ch u nhi t có kh năng sinh indol 44 0
C.
Nguyên tắc:
C y m t l ng m u đã bi t trên môi tr ng rắn không chọn lọc. Sau đó ,
s b nhi t đ phòng (20-250
C) trong 1-2 gi , ph lên m t l p môi tr ng
rắn chọn lọc có ch a Lactose. Các đĩa đ c 440
C trong 24h, sau đó đ m
nh ng khu n l c đi n hình và nghi ng c y nh ng khu n l c đã chọn lên nh ng
môi tr ng khẳng đ nh thích h p.
Môi tr ờng-thu c thử -d ch pha loãng:
- Dung d ch Saline Peptone
- Th ch Tryptone Soya ( TSA )
- Th ch Violet Red Bile ( VRB )
- Canh Escherichia coli (EC broth)
- Canh Tryptone
- Thu c thử Kovac’s
Chủng chứng:
- Ch ng ch ng d ng: Escherichia coli
- Ch ng ch ng âm: Salmonella typhimurium
Thi t b chính:
- T m 44.0 + 0.50
C
Quy trình:
Chuẩn bị mẫu.
Đổ đĩa: C y 1ml m u nồng đ thích h p vào đĩa Petri . Thêm vào 5ml
môi tr ng TSA đã đ c làm ngu i 45.00+1.00C. Tr n đ u d ch nuôi c y và
môi tr ng. s b các đĩa nhi t đ phòng (20 - 25 0C) trong 1-2 gi . Đổ
thêm 10-15ml VRB agar đã đ c làm ngu i 45.00 +1.00C . Tỷ l môi tr ng
gi a hai l n đổ ít nh t là 1:2.
Nuôi ủ: Các đĩa đ c l t ng c lên và 44.0 + 0.50C trong 24 ±3 h.

Đọc kết quả: Chọn các đĩa có s khu n l c đi n hình và không quá 100 đ
đ m. Khu n l c coliform ch u nhi t đi n hình có màu đ s m, đ ng kính ít
nh t là 0,5mm, xung quanh khu n l c có vùng k t t a đ .
Khẳng đ nh:
Coliform chịu nhiệt : Chọn 5 khu n l c nghi ng c a m i lo i, c y vào
môi tr ng canh EC, 44.0 + 0.50
C trong 24±3 h. Ph n ng đ c xem là
d ng tính khi trong ng Durham có khí.
E. coli:Test d ng tính c a Coliform ch u nhi t đ c th c hi n thêm v
kh năng t o indol trong môi tr ng canh tryptone bằng cách thêm 0.3- 0.5 ml
thu c thử Kovac's tr c ti p vào trong môi tr ng Tryptone đã đ c 44.0 +
0.5 0
C trong 24±3 h. Ph n ng đ c xem d ng tính khi có màu đ xu t hi n
trên b mặt. Màu vàng hay màu cam xu t hi n trong 10 phút đ c xem là âm
tính. E.coli gi đ nh cho ph n ng indol d ng tính.
Báo cáo k t qu : Đ m k t qu bằng cách nhân s khu n l c đã đ m v i
nồng đ pha loãng và tỷ l khẳng đ nh d ng tính.
Các chú ý và gi i h n của ph ng pháp
Thu c thử Kovacs’ là m i nguy cho s c kh e, vì v y c n sử d ng các bi n
pháp ch ng đ c nh đeo kh u trang và pha thu c thử trong t h t.
Không đ c thanh trùng môi tr ng VRB và đun quá nhi t.
Rót môi tr ng E.C vào các ng nghi m có ng Durrham đ o ng c. Các
ng này s chìm xu ng sau khi h p thanh trùng.
Tỷ l đ dày gi a l p trên và l p d i c a môi tr ng VRB nên là 2:1.
4.2 Đ nh l ng Vibrio Parahaemolyticus
Nguyên tắc: C y l ng m u đã bi t vào môi tr ng th ch chọn lọc
(TCBS). Nh ng khu n l c V.parahaemolyticus đi n hình s đ c thử nghi m
sinh hoá.
Môi tr ờng và thu c thử:
- Th ch TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose); Th ch Motility
medium; Th ch OF
- Canh tryptone có nồng đ NaCl 0%, 6%, 8%, 7%
- Đĩa ONPG
- Đĩa O/129 Vibriostaticum ch a 150μg 2,4- diamino- 6,7-
diisopropylpteridine
- Canh Lysine decacboxylase
- Dung d ch các lo i đ ng sucrose, lactose, cellobiose
- Canh Ure
- Thu c thử N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4 phenylenediamine (TMPD)

Thi t b chính: T m 37,0 ± 1,0 0
C
Quy trình:
Chuẩn bị mẫu.
Cấy mẫu: C y trang 1 ml d ch m u nồng đ thích h p bằng que c y tam
giác lên 03 đĩa môi tr ng th ch TCBS.
Nuôi ủ: các đĩa 37,0 ± 1,00
C trong 2 ngày, đọc k t qu sau 1 và 2 ngày.
Đọc kết quả:Trên môi tr ng th ch TCBS khu n l c V. parahaemolyticus
tròn, có màu xanh, đ ng kính 3 – 5mm.
Thử nghiệm sinh hoá: Từ các khu n l c nghi ng trên TCBS c y chuy n
sang môi tr ng TSA có bổ sung thêm 1% NaCl, 37,0 ± 1,0 0
C / 1 ngày.
Thử nghi m s b :
Thử nghi m sinh hoá K t qu
Di đ ng +
OF lên men, sinh khí
Oxidase +
KOH +
Ghi chú: A: Axit, K: Ki m.
Test khẳng đ nh:
Thử nghi m sinh hoá K t qu
Phát tri n các nồng đ
mu i:
0%NaCl -
6%NaCl +
8%NaCl +
10%NaCl -
Sinh acid từ:
Succrose |%NaCl -
Mannitol +
Cellobiose -
ONPG -
ADH -
LDC +
Ure -
O/129 10 μg R(không nh y)
O/129 150 μg S(nh y)

4.3 Đ nh l ng Coliforms, Coliforms ch u nhi t, E. Coli gi đ nh
(Fecal Coliforms) bằng ph ng pháp MPN
Trong ph ng pháp này:
Coliforms là nh ng vi sinh v t sinh h i trong môi tr ng canh Lauryl
sulphate và canh Brilliant green lactose bile salt nuôi 37.0o
C ± 1.00
C/ 2 ngày.
Coliforms ch u nhi t là nh ng vi sinh v t sinh h i trong môi tr ng canh
EC nuôi 44.5o
C ± 0.2 0
C/1 ngày.
E. coli gi đ nh (Coliforms phân) là Coliforms ch u nhi t sinh indole trong
canh trypton nuôi 44.5o
C ± 0.2 0
C/ 1 ngày
Nguyên tắc:
S l ng Coliforms, Coliforms ch u nhi t, E.coli gi đ nh (Coliforms
phân) và E.coli đ c xác đ nh bằng ph ng pháp MPN, ph ng pháp này d a
vào nguyên tắc m u đ c pha loãng thành m t dãy th p phân (hai nồng đ k
ti p chênh nhau 10 l n) và đ a vào các ng nghi m có ch a môi tr ng thích
h p, và đọc s ng cho k t qu d ng tính. S ng nghi m cho ph n ng
d ng tính c a các nồng đ pha loãng đ c tra theo b ng MPN đ xác đ nh
tổng s vi khu n trong 1 g (hoặc 1 ml) m u.
Môi tr ờng và thu c thử:
- Canh Lauryl sulphate (Sodium dodecyl sulphate - LSB)
- Canh Brilliant green lactose bile salt (BGBL)
- Canh EC (E.coli medium)
- Canh Tryptone
- Thu c thử Kovac’s
Thi t b :
- B đi u nhi t 44.5o
C ± 0.2 0
C
- T m 37.0o
C + 1.00
C
Ti n hành:
- Coliforms:
C y 1 ml d ch m u đã pha loãng 1:9 vào dãy 5 ng nghi m, m i ng ch a
10 ml canh Lauryl sulphate. Th c hi n t ng t v i d ch m u đã pha loãng
1:10 và 1:100. N u nghi ng l ng vi sinh v t trong m u quá cao, ph i tăng đ
pha loãng m u. 37.0o
C + 1.00
C/2 ngày. Ghi nh n s ng có sinh h i sau 1
ngày và 2 ngày.
Dùng khuyên c y c y chuy n d ch m u từ các ng LSB d ng tính ( ng
sinh h i) sang các ng có ch a canh Brilliant green lactose bile salt. 37.0o
C
± 1.00
C/2 ngày. Đọc s l ng các ng cho k t qu d ng tính( ng sinh h i). S
ng nghi m cho ph n ng d ng tính c a các nồng đ pha loãng đ c tra theo
b ng MPN đ xác đ nh tổng s Coliforms trong 1 g (hoặc 1 ml) m u.

- Coliforms chịu nhiệt:
Dùng khuyên c y c y chuy n d ch m u từ các ng canh Lauryl sulphate
có sinh h i sang môi tr ng canh EC, 44.5o
C ± 0.2 0
C/1 ngày. Đọc s
l ng các ng cho k t qu d ng tính( ng sinh h i). S ng nghi m cho ph n
ng d ng tính c a các nồng đ pha loãng đ c tra theo b ng MPN đ xác
đ nh tổng s Coliforms chịu nhiệt trong 1 g (hoặc 1 ml) s n ph m.
- Coliforms phân:
Dùng khuyên c y c y chuy n d ch m u từ các ng có sinh h i trên môi
tr ng canh EC sang môi tr ng canh Trypton, 44.5o
C ± 0.2o
C/1ngày. Nh
thu c thử Kovac’s vào các ng nghi m Trypton đã . Ph n ng d ng tính khi
có màu đ xu t hi n trong môi tr ng trong vòng vài phút. Đọc s l ng các
ng cho k t qu d ng tính. S ng nghi m cho ph n ng d ng tính c a các
nồng đ pha loãng đ c tra theo b ng MPN đ xác đ nh tổng s Coliforms
phân trong 1g (hoặc 1ml) m u.
Các chú ý và gi i h n của ph ng pháp:
Ph ng pháp MPN thông qua ph n ng lên men lactose không đ nh
l ng đ c vi sinh v t thu n ch ng. K t qu sai có th x y ra do s có mặt c a
các vi sinh v t lên men lactose khác. Không nên c y chuy n các bọt bóng có
sau quá trình đồng nh t m u vào môi tr ng nuôi c y.
Sau khi chuy n d ch pha loãng m u vào ng Lauryl tryptose nên xoay từ
từ ng nghi m đ d ch dính thành ng đi xu ng.
Có th có k t qu âm tính gi do s có mặt c a các Coliforms không lên
men lactose.
Nhi t đ b đi u nhi t c n đ c duy trì 44.50
C và m c n c ph i trên
m c dung d ch trong các ng nghi m. Nhi t đ m r t quan trọng, s thay đổi
chút ít có th làm thay đổi lo i và s l ng vi sinh v t phát tri n trong môi
tr ng thử nghi m.
Các ch ng lo i chu n E. coli và Enterobacter aerogenes c y song song
v i phép thử s ch ra s sai l ch c a nhi t đ b đi u nhi t. Nhi t đ cao s
d n đ n s lên men c a E.coli sai. S lên men lactose c a E. aerogenes ch ra
nhi t đ th p h n 44.50
C.
Đ nh l ng E.coli bằng Lauryl tryptose broth có th xu t hi n âm tính
gi do E.coli b tổn th ng trong quá trình ch bi n th c ph m.
Nên sử d ng ch ng ch ng và ki m soát môi tr ng trong su t quá trình
thử nghi m.

4.4 Đ nh l ng Enterococci đ ờng ru t trong n c bằng ph ng
pháp màng lọc
Enterococci đ ng ru t là các vi khu n có kh năng phân gi i 2,3,5-
triphenyltetrazolium chloride t o thành formazan và thuỷ phân aesculin 440
C
trên môi tr ng quy đ nh t i ph ng pháp này.
Lọc, nuôi cấy và đ m:
Đ m Enterococci đ ng ru t d a trên vi c lọc m t th tích xác đ nh c a
m u nu c qua m t màng lọc có kích th c l thích h p (0,45 μm) đ gi l i
các vi khu n. Màng lọc đ c đặt vào trong môi tr ng th ch chọn lọc ch a
natri azide (đ ngăn chặn s sinh tr ng và phát tri n c a các vi khu n gram
âm) và 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorua (m t ch t nhu m không màu).
Enterococci đ ng ru t s khử thu c nhu m không màu thành focmazan đ .
Sau khi nuôi c y 36.0 ± 2.00
C/ 44 ± 4 h, đ m t t c các khu n l c mọc
màu đ , màu h t dẻ hoặc màu hồng.
Khẳng đ nh:
Chuy n màng lọc có các khu n l c vào môi tr ng bile-aesculin-azide agar,
44.0 ± 0,50
C. Enterococci đ ng ru t thuỷ phân aesculin trong môi tr ng
trong 2 gi , s n ph m cu i cùng là 6,7 - dihidroxycoumarin s k t h p v i ion sắt
(III) cho h p ch t màu nâu vàng đ n đen và khu ch tán vào môi tr ng.
Môi tr ờng nuôi cấy:
- Môi tr ng Slanetz and Bartley
- Th ch m t aesculin - azide
Thi t b :
- Thi t b màng lọc
- Màng lọc vô trùng v i kích th c l 0,45μm.
- T m 36.0 ± 2.00
C
- T m 44.0 ± 0.50
C
Quy trình ti n hành:
Chuẩn bị:
Chu n b m u, thi t b lọc vô trùng và môi tr ng nuôi c y. M u nên đ c
phân tích ngay sau khi l y. N u m u b o qu n nhi t đ phòng (250
C) thì
không đ c b o qu n quá 6 gi , n u m u b o qu n nhi t đ 5 ± 30
C thì
không đ c quá 24 gi tr c khi phân tích.
Lọc và nuôi ủ
Lọc m t th tích n c thích h p.
Đi u ch nh các d ch pha loãng sao cho các khu n l c có th mọc tách bi t
ra và d dàng đ m đ c.

Sau khi lọc, tháo màng bằng kẹp đã khử trùng và đặt màng lọc lên mặt
th ch Slanetz and Bartley. Nuôi các đĩa 36.0 ± 2.00
C trong 44 gi ± 4 gi .
Khẳng định và đếm :
Sau khi nuôi, đ m t t c các khu n l c có màu nâu đ hoặc màu hồng từ
trung tâm hoặc toàn b khu n l c.
N u trên màng có các khu n l c đặc tr ng, chuy n màng lọc sang môi
tr ng bile –aesculin-azide agar đã đ c m đ n 440
C (không l t ng c
màng), 44.00
C ± 0.50
C trong 2 gi .
Đọc k t qu ngay. T t c các đĩa cho khu n l c có màu từ nâu đ n đen, hoặc
môi tr ng bao quanh có màu nâu hay đen đ c coi là ph n ng d ng tính.
Báo cáo k t qu :
K t qu bi u th bằng s vi khu n Enterococci đ ng ru t trong m t đ n
v th tích m u và đ c tính theo h ng d n trong ISO 8199.
Các chú ý và gi i h n của ph ng pháp
Bile-aesculin-azide-agar có ch a Natri azide. Do Natri azide có đ c tính
cao nên chú ý khi th c hi n c n tránh ti p xúc tr c ti p v i hoá ch t đó, đặc
bi t không đ c hít các h t b i c a môi tr ng trong quá trình pha ch môi
tr ng tổng h p. Môi tr ng có ch a azide không nên pha v i các axit vô c
m nh b i vì nó có th t o ra ch t đ c HN3. Dung d ch ch a azide cũng có th
hình thành nnên h p ch t gây nổ khi ti p xúc v i các ng d n bằng kim lo i.
Màng lọc đ c làm từ cellulose và có đ ng kính mắt l i kho ng 47-
50mm.
Màng lọc ph i đ m b o không có tính ch t c ch hoặc kích thích s phát
tri n c a vi khu n, m c in sử d ng đ in các mắt l i trên màng lọc cũng
không đ c nh h ng đ n s phát tri n c a vi khu n. N u ch a vô trùng thì
chúng c n ph i đ c khử trùng theo h ng d n c a nhà s n xu t. Vi c sử d ng
màng lọc c a các hãng khác nhau có th d n đ n vi c hình thành màu sắc khác
nhau c a vi khu n trên màng.
4.5 Đ nh l ng Clostridium khử sunfite trong n c bằng ph ng pháp
tăng sinh trong môi tr ờng cấy l ng
Gi ng Clostridium thu c họ Bacillaceace bao gồm các đặc đi m nh sau:
sinh bào tử, ph n l n di đ ng, gram d ng, hình que, k khí. Hi n di n trong
phân c a đ ng v t và ng i, trong n c th i và trong đ t. Các bào tử c a vi
sinh v t này s ng sót trong n c r t lâu vì chúng b n v ng h n các d ng t bào
sinh d ng đ i v i các tác đ ng c a các y u t v t lý và hóa học. Vì v y chúng
có th làm ch th v s ô nhi m n c. Chúng th m chí b n v i c chlorin
m c th ng v n đ c sử d ng đ xử lý n c.

Nguyên tắc: S l ng vi khu n Clostridium đ c xác đ nh trong m t th
tích n c xác đ nh theo các b c tăng sinh trong môi tr ng c y l ng, nuôi
trong đi u ki n k khí.
Môi tr ờng:
- Môi tr ng phân l p: DRCM nồng đ kép và nồng đ đ n.
- Dung d ch pha loãng- n c mu i pepton (saline pepton)
D ng c và thi t b :
- Máy d p m u.
- B đi u nhi t 75±50
C.
- T m 37±1.00
C.
- Bình k khí v i thi t b t o đi u ki n k khí.
Ti n hành thử nghi m:
Xử lý mẫu: M u đ c xử lý nhi t bằng cách đun nóng trong b đi u nhi t
75o
C + 5 trong 15-20 phút k từ lúc đ t nhi t đ trên, đ gi m b t th dinh
d ng c a vi khu n.
Cấy mẫu và nuôi ấm: C y 50ml m u n c ban đ u vào 50ml canh DRCM
nồng đ kép. C y 10ml m u n c ban đ u vào 5 ng nghi m, m i ng ch a 10
ml canh DRCM đặc. C y 1ml m u n c ban đ u vào 5 ng nghi m, m i ng
ch a 25 ml canh DRCM đ n. N u nghi ng l ng vi sinh v t trong m u quá
cao, ph i tăng đ pha loãng m u.
N u c n, đổ lên mặt t t c các ng đã c y m t l ng canh DRCM đ n đ
th tích ch t l ng đ y ng và đ m b o rằng ch còn l i m t th tích nh không
khí, sau đó gắn kín các ng nghi m và các bình, hoặc đem nuôi trong đi u ki n
k khí, 37.0 + 1.00
C/44 + 4 gi .
Bổ sung các đo n dây thép - đ c nung đ đặt vào môi tr ng tr c khi
c y m u vào, có th t o đi u ki n cho sinh v t k khí phát tri n.
Đọc và báo cáo kết quả: Các lọ trong đó th y có v t đen đ c coi là
d ng tính. K t qu bi u th theo s có xác su t cao nh t (MPN) c a
Clostridium khử Sulfite trên th tích m u thử.

K T LU N
Hàng năm Vi t Nam có kho ng h n 3 tri u tr ng h p nhi m đ c từ th c
ph m, gây thi t h i h n 200 tri u USD (WHO), h n 70% s ca do vi sinh v t
gây nên, do đó vi c xác đ nh vi sinh v t gây b nh trong th c ph m (đ nh tính,
đ nh l ng) là r t c n thi t cho công tác ngăn chặn, phòng ngừa và gi m thi t
h i gây ra b i ng đ c th c ph m.
Có nhi u ph ng pháp đ đ nh l ng vi sinh v t, m i ph ng pháp đ u có
nh ng u, nh c đi m riêng và đ c dùng đ đ nh l ng nh ng vi sinh v t
nh t đ nh, do đó c n có s nghiên c u v đặc đi m sinh học c a vi sinh v t đ
có th áp d ng đúng ph ng pháp đ nh l ng, đem l i hi u qu cao nh t.
Bài ti u lu n sử d ng s li u c a C c an toàn v sinh th c ph m - B y t
và các ph ng pháp đ nh l ng c a C c qu n lý ch t l ng nông, lâm s n &
th y s n - B NN&PTNT.

TÀI LI U THAM KH O
1. Nguy n Ti n Dũng, 2007, Ph ng pháp ki m nghi m vi sinh v t trong
th c ph m, ĐH KHTN-ĐH QGHCM.
2. Tr n Xuân Hi n, 2001, Đánh giá ch t l ng th c ph m, ĐH Nông Lâm
TpHCM.
3. Lâm Qu c Hùng, T Ngọc Thanh, 2009, M t s đặc đi m d ch t học các
v ng đ c th c ph m trong toàn qu c từ năm 2002 đ n năm 2008, C c
An toàn v sinh th c ph m - B Y t .
4. Lê Thanh Mai, 2006, Ki m tra vi sinh trong công ngh th c ph m, ĐH
BKHN.
5. L ng Đ c Ph m, 2005, Vi sinh v t học và an toàn v sinh th c ph m,
NXB Nông nghi p.
6. TCVN 17025.053, 2005, Văn phòng công nh n ch t l ng.
7. Sổ tay Ph ng pháp vi sinh, 2009, C c qu n lý ch t l ng nông lâm th y
s n.

PH L C
Ph l c 1. Các ch tiêu vi sinh v t trong th c ph m đ c quy đ nh b i tiêu
chu n c a B Y t (B ng 1) bao gồm các ch tiêu sau: tổng s vi khu n hi u
khí, Coliforms, E.coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Vibrio
parahaemolyticus, Bacillus cereus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas
aeruginosa, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tổng s n m men,
n m m c… Quy đ nh v gi i h n cho phép c a các ch tiêu thay đổi theo nhóm
và ch ng lo i th c ph m.
Ph l c 2. K t qu giám sát vi sinh v t trong m t s lo i th c ph m do
C c An toàn v sinh th c ph m ti n hành năm 2006 (B ng 2) và 2007 (B ng 3)
Ph l c 3. H th ng ph ng pháp phân tích vi sinh v t – C c Qu n lý ch t
l ng nông lâm th y s n, B NN&PTNT.
Ph l c 4. TCVN (7048,7049,7050) đ i v i các s n ph m th t.

B ng 1. Tiêu chu n vi sinh cho phép trong th c ph m, B Y t 4/1998
Gi i h n cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml th c ph m)
Nhóm th c ph m TVKH
K
EC
O
SAU
SAL/25
g
BC
E
CO
L
CP
E
VP
A
NM–
MO
SF
A
PA
E
CB
O
106
102
102
0 102
Nhóm th t:
-Th t t i, th t đông l nh, th t xay
nh , th t nghi n, th t ch bi n.
-S n ph m ch bi n từ th t: th t
hun khói, pate, xúc xích.
3. 105
3 10 0 10 50 10
106
102
102
0 102
102
105
3 10 0 10 10 10 10
Nhóm cá và h i s n:
-Cá và thủy s n t i s ng
-S n ph m ch bi n: tôm, cá hấp
nóng hun khói, ch cá, ch m c,
các lo i giáp xác, nhuy n th
lu c hấp.
-Thủy s n khô s ch : cá khô 106
10 102
0 102
20
102
105
3 10 0 102
Nhóm tr ng:
-Trứng t i, d ch trứng t i hoặc
đông l nh.
-S n ph m ch bi n từ trứng (đã
ti t trùng bằng ph ng pháp
Pasteur)
103
0 3 0 10

5. 104 0 0 0 10
5. 104 3 0 10
10
0 0 0 0
Nhóm s a:
-S a khô, s a b t
-S a t i ti t trùng theo ph ng
pháp Pasteur.
-S a t i ti t trùng theo ph ng
pháp UHT
-S n ph m ch bi n từ s a (b ,
s a chua, phomat)
104
0 0 0 10
106
102
102
102
103
102
103
S n ph m ch bi n từ ngũ c c, khoai
c , đ u đ :
-C n sử lý nhi t tr c khi dùng
-Dùng tr c ti p, không xử lý
nhi t: bánh b t. 104 3 10 10 10 10 102
10 0 0 0 0 0
102
0 0 10 0 10 0 0
Nhóm n c khoáng và n c gi i
khát đóng chai:
-N c gi i khát có cồn
-N c gi i khát không cồn
-N c khoáng đóng chai
Theo
G.M.P 0 0 0 0
Nhóm gia v :
104
3 102
0 102
102

104
0 3 0 102
10 10
Nhóm n c ch m:
-Nguồn g c đ ng v t: n c mắm
-Nguồn g c th c v t
104
0 3 0 102
10 10
105
10 102
0 102
10
Nhóm th c ăn khô và ch a dinh
d ng cho trẻ em, th c ăn thay th
đặc bi t:
-Ph i xử lý nhi t tr c khi sử
d ng
-Dùng tr c ti p không qua xử lý
nhi t
104
0 3 0 10 10 10
Kem, n c đá 5. 104
0 10 0 102
10
Nhóm đồ h p 0 0 0 0 0
Nhóm d u m 103
3 0 0 10 0
TVKHK: tổng vi khu n hi u khí; ECO: E.coli; SAU: Staphylococcus aureus; SAL: Salmonella; BCE: Bacillus cereus; COL:
Coliforms; CPE: Clostridium perfringens; VPA: Vibrio parahaemolyticus; NM – MO: tổng s nấm men, nấm m c; SFA:
Streptococcus faecalis; PAE: Pseudomonas aeruginosa; CBO: Clostridium botulinum;
G.M.P: Goof Manufacturing Practice: quy ph m s n xuất GMP

B ng 2 K t qu giám sát chủ đ ng – m u vi sinh 2006
Stt Tên m u Tổng s
m u
Đ t Không
đ t
Ch tiêu không đ t
1 Th t t i 40 6 34 Coliforms, E.coli,
S.aureus
2 Th y s n khô s ch 17 8 9 Coliforms, E.coli,
S.aureus
3 Th y s n t i 13 9 4 Coliforms, E.coli,
4 Bánh ăn li n các lo i 37 16 21 Coliforms, E.coli,
S.aureus, Cl. Perfringen,
B. cereus, TSNM- NM
5 N c gi i khát các lo i:
n c mía, rau má, n c
sâm, n c sinh t ….
20 0 21 Coliforms, E.coli,
S.aureus, Cl. Perfringen,
S. feacalis, TSNM- NM
Tổng c ng : 127 39
(30,7%)
88
(69,3%)
Nhận xét: 88/127 m u đ c ki m tra không đ t các ch tiêu vi sinh trọng đi m
Coliforms, E.coli, S.aureus, C. perfringens, B. cereus, S. fecalis, TSBT m c – men

B ng 3 K t qu giám sát chủ đ ng – m u vi sinh 2007
STT
Tên s n
ph m
Tổng
s
m u
K t
qu đ t
Coliforms E. coli
S.
aureus
C.
perfringens
S.
fecalis
1
Nem
chua lá
chu i
3 1 2 1 0 0
0
2
Nem
chua h p
3 1 2 2 0 0 0
3 Jambon 20 0 20 15 1 0 0
4 Bì thính 14 8 6 1 0 0 0
5
Nem
chua cây
2 0 2 0 0 0 0
6 Nem bì 11 2 9 5 1 3 0
7
Nem
chua
20 5 15 8 4 7 0
Tổng c ng 73
17
(23,3%)
56
(76,7%)
31
(42,5%)
6
(8,2%)
10
(13,7%)
0
(0,0%)
Nhận xét:
Có 56/73 m u đ c ki m tra (76,7%) không đ t ch tiêu vi sinh ( xét nghi m các ch tiêu
vi sinh trọng đi m: Coliforms, E. Coli, S. Aureus, C. Perfringens)
STT
Tên s n
ph m
Tổng s
m u
Đ t Không đ t Ghi chú
1
Mắm thái
16
6
(37,5%)
10
(62,5%)
Ch tiêu không đ t:
C. Perfringens
2
Mắm cá các
lo i
74
51
(68,9%)
23
(31,1%)
C. Perfringens
3
Mắm ru c
23
15
(65,2%)
8
(34,8%)
C. Perfringens
4
Mắm tôm
chua
6
3
(50%)
3
(50%)
C. Perfringens
5
Mắm ba khía
8
3
(37,5%)
5
(62,5%)
C. Perfringens
6
Mắm tôm,
mắm tép
11
8
(72,7%)
3
(27,3%)
C. Perfringens
7
Mắm bồ h c
xay
5
3
(60%)
2
(40%)
C. Perfringens
Tổng c ng 143
89
(62,2%)
54
(37,8%)
Nhận xét: Không phát hi n Vibrio cholerae, V. Parahaemolyticus trong số mẫu được kiểm
tra.
Có 54/143 m u đ c ki m tra (37,8%) nhi m C. Perfringens.Đặc bi t mắm ba khía và
mắm thái có tỷ l nhi m trên 62%.

vi-sinh-vật-gay-bệnh-trong-thực-phẩm-libre

Recommended

Recommended

More Related Content

Viewers also liked

Viewers also liked (8)

Similar to vi-sinh-vật-gay-bệnh-trong-thực-phẩm-libre

Similar to vi-sinh-vật-gay-bệnh-trong-thực-phẩm-libre (20)

vi-sinh-vật-gay-bệnh-trong-thực-phẩm-libre