Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử một số taxon thuộc chi sâm (panax l.) ở vùng tây Nghệ An.doc

Dịch vụ viết thuê đề tài – KB Zalo/Tele 0917.193.864 – luanvantrust.com
Kham thảo miễn phí – Kết bạn Zalo/Tele mình 0917.193.864
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO
TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Học viên: Nguyễn Thị Hiên
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN
TỬ MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.)
Ở VÙNG TÂY NGHỆ AN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Hà Nội,

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO
TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Học viên: Nguyễn Thị Hiên
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN
TỬ MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.)
Ở VÙNG TÂY NGHỆ AN
Chuyên ngành: Thực vật
Mã số: 8 42 01 11
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: PGS.TS Phan Kế Long
Hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Hƣơng
Hà Nội

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn này là trung
thực và chƣa đƣợc tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào. Tất cả
các nguồn thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc liệt kê trong tài liệu
tham khảo. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./.
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Tác giả
Nguyễn Thị Hiên

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, các thầy cô giáo
Khoa Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập, nghiên cứu.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy hƣớng dẫn số 1 -
PGS.TS. Phan Kế Long – ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn khoa học, cùng cô giáo
hƣớng dẫn số 2 – TS. Nguyễn Thị Thanh Hƣơng đã luôn dành nhiều thời
gian, công sức, tâm huyết và lòng nhiệt tình hƣớng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Quỹ học bổng Nagao tại Việt Nam, Nhiệm
vụ Điều tra cơ bản mã số UQĐTCB.01/18-19 và Đề tài TN 17-/C04, thuộc
Chƣơng trình Tây Nguyên 2016-2020 đã hỗ trợ về kinh phí giúp tôi hoàn
thiện đề tài khoa học của mình.
Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu trƣờng THPT Ngô Sĩ Liên –
thành phố Bắc Giang, tỉnh Bắc Giang, các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Hóa –
Sinh cùng toàn thể các thầy cô giáo công tác trong trƣờng đã tạo điều kiện hết
mức về thời gian cũng nhƣ công việc ở trƣờng giúp tôi thoàn thành quá trình
học tập và nghiên cứu của mình.
Cuối cùng tôi xin trân trọng cảm ơn gia đình, bạn bè luôn là điểm tựa
vững chắc về vật chất, tinh thần, luôn cổ vũ động viên tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn!
Hà nội, ngày tháng năm 2020
Tác giả
Nguyễn Thị Hiên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
CR : Cực kì nguy cấp
DNA : Deoxyribonucleic acid
EW : Tuyệt chủng ngoài tự nhiên
ITS : Internal transcribed spacer
IUCN : International Union for Conservation of Nature and
Natural Resources
matK : Maturase K
ML : Maximum Likelihood
MP : Maximum Parsimony
NCBI : National Center for Biotechnology Information
NJ : Neighbor – Joining
PCR : Polymerase Chain Reaction
RAMS : Random amplified microsatellite
RAPD : Randomly Amplified Polymosphic DNA
rbcL : Ribulose bisphosphate carboxylase large chain
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
SCN : Sau công nguyên
SSR : Simple Sequence Repeats
TCN : Trƣớc công nguyên
UPGMA : Unweighted pair group method with arithmetic mean

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi nhân bản vùng ITS-rDNA bằng kỹ thuật PCR với
cặp mồi theo Phan Kế Long và cs. (2014)......................................16
Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR.......................................................20
Bảng 2.3. Danh sách trình tự sử dụng trong nghiên cứu thu thập trên Genbank
23
Bảng 3.1. So sánh đặc điểm hình thái giữa Tam thất hoang (P. stipuleanatus)
và Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) (Nguyễn Tập, 2007)................38
Bảng 3.2. Thành phần nucleotide (%) của các mẫu nghiên cứu.....................46
Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền (%) giữa các mẫu nghiên cứu (bên trên) và
số lƣợng nucleotide sai khác (bên dƣới) giữa các mẫu nghiên cứu 50

DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH VẼ
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thí nghiệm .............................................................17
Hình 2.2. Máy đo NanoDrop one....................................................................19
Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR.................................................................20
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng QIAquick ..............................................................21
Hình 3.1. Panax notoginseng - Tam thất (lá mẫu TH1). ................................26
Hình 3.2. Panax notoginseng - Tam thất (củ mẫu TH1). ...............................27
Hình 3.3. Mẫu Panax thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng. ................................29
Hình 3.4. Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB1: lá chét nguyên). 31
Hình 3.5. Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB2: lá chét xẻ thùy
sâu)..................................................................................................31
sâu)..................................................................................................32
nông) ...............................................................................................33
Hình 3.8. Panax stipuleanatus -Tam thất hoang (mẫu lá ML1).....................34
Hình 3.9. Panax stipuleanatus-Tam thất hoang (mẫu củ ML1) .....................35
Hình 3.10. Mẫu (K.M.Feng 13694) isotype (P. stipuleanatus) hiện đang lƣu
trữ tại phòng tiêu bản Viện Thực vật Bắc Kinh (PE0025805) .......36
Hình 3.11. So sánh trình tự vùng gen ITS-rDNA của các mẫu Panax TB1-
TB4 và ML1 với trình tự vùng gen của loài P. stipuleanatus........37
Hình 3.12. Lá loài Panax zingiberensis -Tam thất gừng (mẫu lá ML2).........40
Hình 3.13. Củ của loài Panax zingiberensis -Tam thất gừng (mẫu củ ML2).41
Hình 3.14. So sánh trình tự vùng gen ITS-rDNA của mẫu ML2 với các loài
trong cùng nhóm: P. zingiberensis và P. Wangianus.....................43
Hình 3.15. Sắc ký đồ trình tự vùng gen ITS-rDNA của mẫu Panax TB1......46
Hình 3.16. Trình tự vùng gen ITS-rDNA của các mẫu nghiên cứu................49

Hình 3.17. Mối quan hệ họ hàng của các mẫu nghiên cứu với các loài/thứ
trong chi Panax L. trên cơ sở phân tích trình tự vùng gen ITS-
rDNA theo phƣơng pháp Maximum Likelihood (ML). Mô hình tối
ƣu GTR+G+I. Eleutherococcus senticosus là loài ngoài nhóm. Giá
trị ở gốc là giá trị bootstrap >50%..................................................51

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỞ ĐẦU...................................................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI SÂM PANAX L.....................................................................4
1.2. TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L. TRÊN THẾ
GIỚI..........................................................................................................................................................4
1.3. TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L Ở VIỆT NAM
8
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............14
2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU.........14
2.1.1. Vật liệu...............................................................................................................................14
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu..................................................................................................14
2.1.3. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu...............................................................14
2.1.4. Thi t ị và dụng cụ nghiên cứu............................................................................15
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................................................17
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu..........................................................................................................17
2.2.2. Phương pháp thu thập mẫu....................................................................................17
2.2.3. Phương pháp định loại hình thái........................................................................18
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử..................................................18
2.2.4.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số....................................................18
2.2.4.2. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)...........................19
2.2.4.3. Tinh sạch sản phẩm PCR................................................................................21
2.2.4.4. Phƣơng pháp phân tích số liệu....................................................................22

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................25
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................................................25
3.1.1. Đặc điểm nhận bi t chi Panax..............................................................................25
3.1.2. Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H. Chow - Tam thất
25
3.1.3. Panax stipuleanatus Tsai et Feng- Tam thất hoang................................28
3.1.4. Panax zingiberensis C.Y. Wu & K.M. Feng-Tam thất gừng ..............39
3.1.5. Đặc điểm hình thái chung của chi Panax ở vùng Tây Nghệ An.......43
3.1.6. Mối quan hệ họ hàng của các mẫu nghiên cứu .........................................45
3.2. THẢO LUẬN.........................................................................................................................52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................54
1. KẾT LUẬN......................................................................................................................................54
2. KIẾN NGHỊ.....................................................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................................55
PHỤ LỤC

1
MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên
có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Thêm vào đó, cộng đồng
các dân tộc Việt Nam từ lâu đời cũng đã có nhiều kinh nghiệm sử dụng các
loại cây cỏ làm thuốc trong đó có Sâm.
Nhân sâm đƣợc dùng trong y học phƣơng Đông hàng ngàn năm nay. Ngƣời
Trung Quốc đã sử dụng nhân sâm từ rất lâu đời nhƣ một thứ dƣợc liệu vô cùng trân
quý, chỉ có các vua chúa và các quan lớn mới có loại thảo dƣợc này. Tác dụng của
nhân sâm đƣợc đề cập trong các trƣớc tác của Shi You (khoảng những năm 48-33
TCN) hay Shanghan Lun (khoảng những năm 200 SCN).
Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì
(Araliaceae) gồm 15 loài, tất cả đều có giá trị làm thuốc, một số loài thuộc chi
Panax L. (Araliaceae) đƣợc sử dụng có giá trị cao nhƣ Nhân sâm (P.
ginseng), Tam thất (P. notoginseng). Ở Việt Nam, có một số loài thuộc chi
này nhƣ Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus)
và Sâm ngọc linh (P. vietnamensis) [1,2,3].
Do có giá trị sử dụng và giá trị kinh tế cao, các loài nhân sâm này đã bị
tìm kiếm, khai thác đến mức kiệt quệ trong tự nhiên. Sâm vũ diệp và Tam thất
hoang đã đƣợc xếp hạng cực kỳ nguy cấp (CR), còn Sâm ngọc linh ngày nay
đã đƣợc coi là tuyệt chủng ngoài tự nhiên (EW). Cả ba loài này đã đƣợc đƣa
vào Sách Đỏ Việt Nam (2007), Phụ lục IA - các loài nghiêm cấm khai thác và
sử dụng vì mục đích thƣơng mại của Nghị định 06/2019/NĐ-CP ngày
22/01/2019, Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30/03/2006 về quản lý thực vật
rừng, động vật rừng nguy cấp, quý hiếm. Và đây cũng là ba trong số 17 loài
thực vật thuộc Danh mục loài nguy cấp qúy hiếm đƣợc ƣu tiên bảo vệ theo
Nghị định số 160/2013/NĐ-CP ngày 12/11/2013 của Thủ tƣớng Chính phủ
[4].
Vùng Tây Nghệ An có diện tích rất lớn với 1,3 triệu ha với 09 đỉnh núi
thuộc Bắc Trƣờng Sơn cao trên 1000m so với mặt biển nhƣ Pù Hon 1447m,

2
Pù Mát 1814m, Phu Xai Lai Leng 2711m, Pù Hút 2452m, Pù Lon 1561m, Pu
Đen Đin 1540m, Rào Cỏ 2286m, Pù Huống 1200m và Chốp Cháp 1705m có
khả năng phù hợp với điều kiện sinh trƣởng và phát triển của các loài cây
thuốc thuộc chi Sâm (Panax L.). Trên cơ sở nghiên cứu bƣớc đầu và thông
tin từ ngƣời dân địa phƣơng cho biết đã gặp một số cây sâm ở các khe núi Ca
Nọi, Na Khang và Phú Khả thuộc khu vực núi Phu Xai Lai Leng có độ cao
2711m thuộc xã Na Ngoi, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An nên nhóm nghiên cứu
đã lựa chọn điều tra đại diện các loài cây thuộc chi Sâm (Panax L.) cho vùng
Tây Nghệ An tại khu vực đỉnh núi Phu Xai Lai Leng.
Thêm vào đó, hiện nay Công ty TNHH TH true MILK đã đầu tƣ vƣờn
dƣợc liệu tại các xã Na Ngoi và Mƣờng Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An trong đó có
khoảng hơn 1000m2
trồng Sâm. Theo thông tin ghi nhận đƣợc, các loài Sâm
trồng ở đây đƣợc thu thập từ khu vực Tây Nghệ An và nhập từ địa phƣơng
khác về trong đó có cả Sâm ngọc linh đƣợc mang về từ Nam Trà My vì vậy
việc khảo sát, định loại các loài thuộc chi Sâm tại đây có thể mang lại thêm
thông tin về đa dạng loài Sâm tại vùng Tây Nghệ An. Hơn nữa, các loài Sâm
đều sinh trƣởng tốt tại vƣờn ƣơm này, vì vậy đây có thể là mô hình bảo tồn
chuyển vị cho các loài thuộc chi Sâm ở Tây Nghệ An
Nhằm cung cấp những dẫn liệu và cơ sở khoa học phục vụ công tác bảo
tồn, phát triển cũng nhƣ công tác định danh, phân biệt một số loài Sâm ở Tây
Nghệ An, luận văn đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và
phân tử một số taxon thuộc chi Sâm (Panax L.) ở vùng Tây Nghệ An”.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
- Mô tả đặc điểm hình thái và sinh học phân tử các loài thuộc chi Sâm
(Panax L.) thu thập ở khu vực Phu Xai Lai Leng, Kỳ Sơn, Nghệ An
- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của một số
loài thuộc chi Sâm (Panax L.) đƣợc trồng tại Công ty TNHH TH true MILK
Na Ngoi và Mƣờng Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An.
3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đối tƣợng nghiên cứu: Các loài cây thuộc chi Sâm (Panax L.) thu

3
thập ở vùng Tây Nghệ An gồm các mẫu thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng và
vƣờn giống của Công ty TNHH Thtrue MILK ở xã Na Ngoi và Mƣờng Lống,
Kỳ Sơn, Nghệ An.
- Phạm vi nghiên cứu: Vùng Tây Nghệ An
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN
CỨU * Ý nghĩa khoa học
- Góp phần bổ sung hoàn chỉnh vốn kiến thức về hình thái và phân loại
chi Sâm (Panax L.) ở Việt Nam
* Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả của nghiên cứu là cơ sở khoa học để nhận biết bảo tồn các
loài thuộc chi Sâm (Panax L.) tại vùng Tây Nghệ An.
- Thông tin về thành phần loài, phân bố và hiện trạng các loài thuộc chi
Sâm (Panax L.) ở vùng Tây Nghệ An có ý nghĩa lớn đối với việc phát triển
kinh tế vùng, mang lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng.
- Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ cho các ngành ứng dụng
và sản xuất nhƣ Nông - Lâm nghiệp, Dƣợc học, Tài nguyên thực vật, Đa
dạng sinh học và trong công tác đào tạo.
5. ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN VĂN
- Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái 3 loài thuộc chi Panax L. thu đƣợc ở
vùng Tây Nghệ An
- Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử hỗ trợ định danh chuẩn các
loài thuộc chi Panax thu đƣợc ở vùng Tây Nghệ An.
- Đã phân tích, xác định Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ở Việt Nam là
cùng một loài P. stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng.
- Xây dựng bộ tƣ liệu ảnh minh họa đặc điểm hình thái, sinh học phân
tử của các taxon thuộc chi Panax ở vùng Tây Nghệ An: 14 ảnh chụp từ các
mẫu thu trực tiếp trên thực địa, ảnh tham khảo và ảnh chụp từ mẫu trong
phòng tiêu bản.

4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI SÂM PANAX L.
Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì
(Araliaceae). Chi này trên thế giới có 8 loài phân bố ở vùng Đông Á,
Hymalaia, Inđôchina, Bắc Châu Mỹ [5]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế
giới cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi
giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam
Canada (có 2 loài P. quinquefolius và P. trifoliatus) [6, 7, 8]. Vùng Đông Bắc
Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật
Bản) có 2 loài là P. ginseng và P. japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L.
có thể từ vùng Tây - Nam của Trung Quốc xuống phía Bắc Việt Nam. Thực chất
khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai
(Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và thứ mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng
là P. notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P. pseudoginseng. Đây có thể coi là trung
tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) trên thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài
(P. notoginseng; P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía
Nam của chi Panax L. là loài Sâm Việt Nam (P. vietnamensis) ở Miền Trung
của Việt Nam, tại 140
15’
vĩ độ Bắc.
1.2. TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L. TRÊN THẾ GIỚI
Chi Panax L. đƣợc Carl Linnaeus mô tả lần đầu tiên từ năm 1753 với
loài chuẩn là P. quinquefolius phân bố ở Bắc Mỹ [8]. Sang thế kỷ 19, một số
loài khác đƣợc công bố nhƣ Giả nhân sâm - P. pseudoginseng Wall, ở Nepal;
Nhân sâm - P. ginseng Meyer ở Bắc Triều Tiên, Đông Bắc Trung Quốc và
Viễn Đông Nga; Sâm Nhật P. japonicus Meyer ở Nhật Bản và Trung Quốc;
Sâm vũ diệp - P. bipinnatifidus Seem, ở Đông Bắc Ắn Độ, Nepal và Trung
Quốc (Wen J., 2000) [9]. Nhƣ vậy, đến cuối thế kỷ 19, chi Panax L. có 6 loài.
Năm 1975, Trung Quốc đã bổ sung thêm một loài mới là P. stipuleanatus H.
T. Tsai & K. M. Feng, đồng thời nâng cấp các taxon thứ của P.
pseudoginseng Wall, của các tác giả trƣớc đó thành bậc loài hoàn chỉnh
(Nocerino E. et al., 2000) [10]. Năm 1985[11], một loài mới khác đƣợc tìm

5
thấy ở Việt Nam là Sâm ngọc linh - P. vietnamensis Ha et Grushv. đã nâng
tổng số loài thuộc chi Panax trên thế giới lên 12 loài và 1 thứ. Trong đó Bắc
Mỹ có 2 loài (P. quinquefolius và P. trifolius). Các loài còn lại phân bố ở
châu Á, bao gồm 6 loài ở Trung Quốc, 3 loài có ở Nhật Bản và có 5 loài có ở
Việt Nam (kể cả 2 loài cây trồng nhập nội).
Theo Linnaeus (1753) [8] điểm khác biệt của chi Panax L. so với các
chi khác trong họ Araliaceae là bầu 2 ô, hoa mẫu 5, xếp van hay xếp lợp.
Trong giai đoạn này, số lƣợng loài đã biết còn ít, nên tác giả chỉ giới hạn ở
các đặc điểm của hoa: hoa vừa xếp lợp vừa xếp van. Đây là đặc điểm chính
của chi để phân biệt với các chi khác trong họ Araliaceae. Tuy nhiên, với cách
sắp xếp này thì đặc điểm của chi Panax bao gồm một số chi khác thuộc họ
Araliaceae, đặc biệt là chi Nothopanax.
Theo quan điểm trên, De Candolle (1830) [12] đã chuyển một số loài
thuộc chi Nothopanax vào chi Panax. Kể từ đây, vị trí phân loại và mối quan
hệ phát sinh của chi Panax không có sự đồng nhất về quan điểm giữa các tác
giả. Decaisne và Planchon (1854) [13] cho rằng đặc điểm chính của chi Panax
là đài xếp van, nên chuyển 2 loài P. quinquefolius và P. trifolius sang chi
Aralia, đồng thời hợp nhất hoá các chi Polyscias, Clerodendron,
Pseudopanax và Maralia vào chi Panax. Nhƣ vậy, với cách sắp xếp nhƣ trên,
các tác giả đã cho rằng đặc điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp van
còn có đặc điểm thân gỗ và thân thảo. Đồng ý với quan điểm trên, các tác giả
Bentham và Hooker (1867) [14], Clarke (1879) [15] tiếp tục sát nhập chi
Nothopanax vào chi Panax, đồng thời chuyển chi Panax vào tông (tribe)
Panaceae. Đến thời điểm này, số lƣợng loài thuộc chi Panax lên đến 25 loài,
phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi, Newzeland và Australia.
Năm 1868, Seemann [16] đã xem xét lại vị trí phân loại chi Panax và
cho rằng những mô tả của Linnaeus về đặc điểm hình thái đặc trƣng của chi
Panax là không rõ ràng. Theo tác giả, đặc điểm chính để phân biệt chi Panax
so với các chi khác trong họ Araliaceae là đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô. Với đặc
điểm này thì 2 loài P. quinquefolius và P. trifolius thuộc về chi Panax và có
mối quan hệ gần với chi Aralia. Đối chiếu với đặc điểm của các chi khác

6
thuộc họ Araliaceae, tác giả ghi nhận có một đặc điểm chỉ ra sự khác biệt giữa
chi Panax so với chi khác là thân dạng củ. Qua đó, tác giả chuyển các loài có
thân dạng củ trƣớc đây ở các chi khác vào chi Panax, đồng thời chuyển một
số loài không có thân dạng củ ra khỏi chi Panax. Nhƣ vậy, chi Panax có 3
đặc điểm quan trọng làm cơ sở để phân biệt với các chi khác trong họ
Araliaceae là: thân dạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô. Với quan điểm trên, tác
giả đã chuyển 61 loài ra khỏi chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P.
trifolius L., P. quinquefolius L., P. ginseng Mey., P. pseudoginseng Wall., P.
japonicus Mey. và P. bipinnatifidus Seem. Với loài P. fructicosus có đặc điểm
là đài xếp van, Seemann xếp vào chi Nothopanax và đồng thời lấy loài này là
type cho chi Nothopanax. Có lẽ đây là quan điểm đƣợc nhiều nhà nghiên cứu
về chi Panax cho là phù hợp hơn cả. Để khẳng định lại quan điểm của
Seeman (1868) [16], Harm (1897) [17] đã nghiên cứu tất cả các đặc điểm của
các loài Sâm phân bố trên thể giới nhƣ: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh dƣỡng
và cho rằng chi Panax có nguồn gốc từ chi Aralia, điểm khác biệt ở đây là
thân dạng củ. Britton và Brown (1913) [18] tiếp tục xem xét vị trí phân loại
chi Panax và đồng tình với quan điểm của Seeman (1868) và Harm (1897)
[17], chỉ ra loài P. quinquefolius có đặc điểm đại diện cho chi: thân dạng củ,
hoa mẫu 5 xếp lợp, bầu 2 ô, và loài đƣợc mô tả lần đầu tiên, nên lấy loài này
làm type danh pháp cho chi Panax.
Hoo (1961) [19] khi nghiên cứu về hệ thống học, mối quan hệ phát sinh
và phân bố của taxon trong họ Araliaceae đã cho rằng chi Panax có nguồn
gốc phát sinh từ Acanthopanax. Vì chi này có đặc điểm hoa mẫu 5, lá có lông
cứng mọc trên gân lá, thân thảo hay thân dạng cây bụi nhỏ. Tác giả cho rằng
đặc điểm thân thảo là đặc điểm tƣơng đồng quan trọng nhất, các loài trong
chi Aralia hầu nhƣ không có đặc điểm này. Quan điểm này của Hoo hầu nhƣ
không nhận đƣợc sự đồng tình của các nhà nghiên cứu về chi Panax.
Năm 1970, Hara [20] xem xét đặc điểm của chi Panax dựa trên mẫu vật
của các loài thuộc chi Panax ở châu Á thu đƣợc ngoài tự nhiên cũng nhƣ dựa
trên mẫu lƣu giữ ở các Bảo tàng thực vật. Qua đó, tác giả thống nhất với các
quan điểm nghiên cứu trƣớc đó về đặc điểm của chi Panax: thân dạng củ, hoa
mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu 2 ô và có mối quan hệ gần với chi Aralia.

7
Tuy nhiên, theo tác giả các loài trong chi Panax có đặc điểm hình thái biến đổi
rất lớn so với các bậc phân loại khác trong họ Araliaceae. Do đó, việc định loại
các loài trong chi Panax là việc rất khó khăn nếu chỉ dựa vào một đặc điểm hình
thái nào đó. Theo tác giả, để phân biệt các loài thuộc chi Panax, trƣớc tiên xếp
loài vào 1 trong 3 chuẩn hình thái của thân rễ (rhizome type): thân rễ có dạng
thân củ (carot type); thân rễ có đốt kéo dài; và thân rễ có đốt ngắn nhƣ đốt trúc.
Tiếp theo đó là các đặc điểm hình thái lá, đài, tràng, số lƣợng chỉ nhụy, quả...
Cách phân loại dựa vào hình thái thân rễ trƣớc rồi mới đến các đặc điểm cơ quan
sinh dƣỡng và sinh sản đã đƣợc Xiang và Lowry (2007) [5] áp dụng để xây
dựng khóa phân loại chi Panax ở Trung Quốc.
Wen và Zimmer (1996) [21] dựa vào đặc điểm hình thái, hình thái giải
phẫu, hạt phấn và sinh học phân tử cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần
gũi với chi Aralia. Đến thời điểm hiện nay, các hệ thống quan điểm dựa vào
hình thái, giải phẫu và sinh học phân tử đều thống nhất và cho rằng chi Panax
có mối quan hệ gần với chi Aralia, điểm khác khác biệt chủ yếu dễ dàng nhận
thấy so với chi Aralia là thân dạng củ, lá kép hình chân vịt, noãn 2-3.
Sau năm 1970, vị trí phân loại và hệ thống phát sinh của chi Panax hầu
nhƣ không thay đổi. Tuy nhiên do đặc điểm hình thái có biến đổi rất lớn, ngay
trong một loài ở các vùng phân bố khác nhau thì có đặc điểm hình thái cũng khác
nhau (Hara,1970) [20], đồng thời ngày càng có nhiều phát hiện mới nên từ đó
đến nay, việc ghi nhận số lƣợng loài trong chi Panax có sự thay đổi theo thời
gian và tùy vào quan điểm của các nhà nghiên cứu. Ở nửa đầu của thập niên
1970, quan niệm về thành phần loài Sâm châu Á của các nhà nghiên cứu cũng rất
khác nhau và có sự bổ sung nhiều taxon mới. Gần đây, quan hệ phát sinh giữa
các taxon thuộc chi Panax đƣợc xây dựng không chỉ dựa vào đặc điểm hình thái
mà còn sử dụng trình tự các DNA mã vạch - hoặc gọi là chỉ thị DNA), tuy vậy
vẫn chƣa có sự thống nhất giữa các nhóm tác giả. Có thể nhận thấy sự khác nhau
giữa các quan điểm phân loại về số lƣợng loài, sự sắp xếp và phân chia các loài
và dƣới loài trong chi Panax qua các thời kỳ có thể do các nguyên nhân sau: tính
đa dạng về hình thái trong chi Panax, quan điểm về hệ thống phát sinh dựa vào
đặc điểm hình thái rất đa dạng; việc sử dụng các DNA barcode khác nhau để hỗ
trợ cho nghiên cứu phân loại; các phát hiện mới về taxon.

8
Các taxon thuộc chi Panax đã biết đều là các đối tƣợng có giá trị sử
dụng cao và đƣợc xem là “thần dƣợc cuộc sống” (Florence, 1992) [22], do
vậy đã có hàng loạt các công trình nghiên cứu trên thế giới và cũng nhƣ ở
Việt Nam đƣợc tiến hành nhằm thúc đẩy sản xuất, khai thác, sử dụng hiệu
quả. Nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa dƣợc và dƣợc lý, tiếp
đến là nghiên cứu về nhân giống, canh tác, chế biến, hệ thống học thực vật, đa
dạng di truyền, bảo tồn đa dạng nguồn gen... Do đó có khá nhiều công trình
nghiên cứu đƣợc công bố trên các tạp chí, sách chuyên khảo và các thông tin
trên các phƣơng tiện đại chúng liên quan đến Sâm. Nói cách khác, các loài
Sâm là đối tƣợng thực vật có một sự cuốn hút lớn đối với những ngƣời làm
công tác nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực trên toàn thế giới. Những công trình
nghiên cứu về sâm vẫn đang đƣợc triển khai cho dù những phát hiện đột phá
về mặt thành phần loài gần đây không nhiều.
1.3. TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L Ở VIỆT NAM
Mặc dù là những loài cây thuốc có giá trị nhƣng các công trình nghiên
cứu về thực vật ở Việt Nam và Đông Dƣơng từ thời Pháp thuộc vẫn chƣa ghi
nhận phân bố của các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam. Đến năm 1964, Viện
Dƣợc liệu đã thu đƣợc một số mẫu của loài cây thuốc có tên là “Phan xiết” do
đồng bào ngƣời Dao và Mông ở Sa Pa giới thiệu. Tháng 7 năm 1964 nhà thực
vật học ngƣời Trung Quốc Ngô Chính Dật đã giám định các tiêu bản thuộc chi
Panax L. lƣu giữ tại Viện Dƣợc liệu, trong đó mẫu số 911 và 348 thu ở xã Tả
Phin huyện Sa Pa tỉnh Lào Cai ngày 14/6/1964 đƣợc xác định có tên khoa học là
P. bipinnatifidus Seem. Đến năm 1969, loài này mới đƣợc Grushvitzky và cộng
sự [23] công bố trong một loạt các công trình nghiên cứu về họ Araliaceae ở
miền Bắc Việt Nam [24,25,26]. Từ đó, Sâm vũ diệp đã đƣợc ghi nhận trong tất
cả các tài liệu về cây thuốc và hệ thực vật ở Việt Nam.
Viguier (1908 – 1923) là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam
chỉ mô tả đặc điểm và phân bố của chi Panax. Nhƣng không trích dẫn tài liệu
tham khảo, dẫn đến gây khó khăn cho ngƣời nghiên cứu tiếp theo và chƣa
xác định đƣợc các loài có phân bố ở Việt Nam. [27]
Phạm Hoàng Hộ (1970) [28] là ngƣời đầu tiên ghi nhận thứ Sâm nhật

9
(P. schinseng Nees var. japonicum Mak.) có ở rừng dày ẩm, núi Langbian
(Lâm Đồng) trong bộ “Cây cỏ Việt Nam”. Ông mô tả ngắn gọn về đặc điểm
hình thái, sinh thái, phân bố và hình vẽ của thứ này.
Năm 1973, Võ Văn Chi & cs trong cuốn “Cây cỏ thƣờng thấy ở Việt
Nam” mô tả Panax pseudoginseng Nees – Tam thất kim bất [29].
Năm 1993, Phạm Hoàng Hộ [30] đã mô tả 3 loài thuộc chi Panax L. có
ở Việt Nam là Sâm hai lần chẻ - P. bipinnatifidus Seem, có ở Hoàng Liên
Sơn, Sâm nhật - P. japonica (Nees) Meyer có ở Langbian, Kon Tum và Giả
nhân sâm - P. pseudoginseng Wall, có ở Sa Pa. Trong lần tái bản vào năm
2000, ngoài hai loài Sâm hai lần chẻ và Giả nhân sâm, Phạm Hoàng Hộ còn
bổ sung thêm một loài Sâm ngọc linh - P. vietnamensis Ha et Grushv. có ở
Gia Lai - Kon Tum. Còn loài Sâm nhật ông ghi có ở Langbian và cả ở Kon
Tum. Nhƣ vậy theo Phạm Hoàng Hộ, trên địa bản tỉnh Kon Tum hoặc Gia
Lai - Kon Tum cũ, có cả hai loài Sâm nhật và Sâm việt nam. Còn đối với Sâm
nhật ở Kon Tum, ông không ghi rõ nguồn mẫu xác định và nơi phân bố cụ
thể, điều này gây trở ngại cho việc các định loài Sâm nhật kể trên có thực sự
phân bố tự nhiên ở Việt Nam hay không. Trong khi đó, loài Sâm nhật do
Phạm Hoàng Hộ đã từng ghi nhận ở Langbian cũng chính là Sâm việt nam
hay Sâm ngọc linh đƣợc Hà Thị Dụng và Grushvitzky [31] (1996) công bố là
loài mới cho khoa học và đặt tên là P. vietnamensis Ha et Grushv.
Năm 1993, Trần Đình Lý trong cuốn “1900 loài cây có ích ở Việt
Nam”, mô tả rất ngắn gọn về phân bố và tác dụng của P. vietnamensis Ha et
Grushv., P. bipinnatifidus Seem. và P. Pseudoginseng Wall. [32].
Năm 1995, Đỗ Tất Lợi trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt
nam” đã mô tả rất chi tiết về lịch sử ra đời, hình thái, thành phần hóa học, tác
dụng dƣợc lý, công dụng và liều dùng của hai loài là P. vietnamensis Ha et
Grushv và P. pseudoginseng Wall.[33]
Năm 1997, Võ Văn Chi [34] trong cuốn “ Từ điển cây thuốc Việt Nam”
mô tả về P. pseudoginseng Wall. Loài của Nam Trung quốc và Bắc Việt Nam. Ở
nƣớc ta cây mọc hoang và đƣợc trồng nhiều ở Hà Giang, Lào Cai,

10
Cao Bằng tại các vùng núi cao lạnh 1200 – 1500 m; Tam thất hoang P.
bipinnatifidus Seem – Vũ diệp tam thất. Loài của Nam Trung Quốc và Bắc
Việt Nam, ở độ cao 1900 – 2400 m trong rừng ẩm, cây mọc hoang ở vùng núi
cao lạnh của tỉnh Lào Cai. Cũng đƣợc trồng và mọc tốt nhƣ Tam thất; Sâm
ngọc linh P. vietnamensis Ha et Grushv là loài đặc hữu của Việt Nam mọc tập
trung trong 13 xã thuộc 3 huyện miền núi Ngọc linh, thuộc hai tỉnh Kon tum
và Quảng Nam. Cả ba loài này tác giả đều mô tả đầy đủ về hình thái, bộ phận
sử dụng, nơi sống và thu hái, thành phần hóa học cũng nhƣ công dụng.
Năm 1997, Lê Trần Đức trong cuốn “Cây thuốc Việt Nam trồng hái
chế biến trị bệnh ban đầu” đã mô tả rất chi tiết về đặc điểm hình thái, điều
kiện sống, kĩ thuật trồng và chăm sóc, trị sâu bệnh, cách thu hái và chế biến,
công dụng của P. pseudoginseng Wall. Phần cuối mô tả tác giả có ghi phụ chú
cho biết P. vietnamensis Ha et Grushv và củ Tam thất mọc hoang – P.
bipinnatifidus Seem cũng đƣợc dùng với hiệu quả gần nhƣ P. pseudoginseng
Wall. [35]
Năm 2000, Phạm Hoàng Hộ [36] trong cuốn “Cây cỏ Việt Nam” đã
chỉnh sửa thành P. bipinnatifidus Seem. Sâm hai lần kép đƣợc tìm thấy ở núi
Hoàng Liên Sơn. Điểm khác biệt là trong quyển 2 xuất bản năm 2000 Phạm
Hoàng Hộ bổ sung thêm đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và vẽ hình của
loài P. vietnamensis Dung & Grushv. Sâm việt tìm thấy ở Gia Lai, Kon Tum.
Nhìn chung các công trình của Phạm Hoàng Hộ còn mang tính chất thông kê
đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và vẽ hình chƣa mô tả đặc điểm chi,
chƣa chỉ ra mẫu nghiên cứu và mẫu chuẩn cũng nhƣ bảo tàng lƣu giữ mẫu.
Tuy nhiên đây đƣợc coi là tài liệu phân loại thực vật về chi Panax ở Việt
Nam có giá trị nhất tới thời điểm này.
Năm 2003, Lê Trọng Cúc & cs [37] trong “Danh lục các loài thực vật
Việt Nam”, tập II mô tả về 3 loài: P. bipinnatifidum Seem. 1868 ( CCVN, 2:
640), - Aralia bipinnatifida C. B. Clarke, 1879, - P. pseudoginseng var.
bipinnatifidus (Seem) H. L. Li, 1942 (FLPF, 54:187), - Vũ diệp tam thất, sâm
vũ diệp, Trúc tiết nhân Sâm, tam thất lá xẻ, Tam thất hoang, Sâm hai lần xẻ,
Hoàng liên thất, phân bố ở Lai Châu (Tà Phỉn), Lào Cai (Sa Pa), còn có ở Ấn

11
Độ, Trung Quốc; P. pseudoginseng Wall. 1829 (CCVN, 2: 641) đƣợc trồng ở
Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phố Bằng, So Phin), Cao Bằng (Tắc Tẻ, Thông
Nông), Vĩnh Phúc ( Tam Đảo), còn có ở Nêpal, Trung Quốc; P. stipuleanatus,
Tsai & Feng, 1975 – Tam thất hoang, Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Sâm
tam thất, Phan xiết ( H’Mông) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa: Núi Hàm Rồng, xã
Tà Phỉn, xã Bản Khoang, còn có ở Trung Quốc (Vân Nam); P. vietnamensis
Ha & Grushv. 1985 (“vietnamensis”) – Sâm ngọc linh phân bố ở Quảng Nam
(Trà My, Trà Linh, Trà Cang), Kon Tum (Đac Glây, Đác Choong, Ngọc Linh,
Đác Tô), Gia Lai (Long Hi), Lâm Đồng (Lang Bian). Tác giả mô tả ngắn
ngọn về hình thái, phân bố, sinh thái và công dụng.
Năm 2005, Nguyễn Tập [6] sau khi nghiên cứu và hệ thống lại các loài
thuộc chi Panax đã kết luận chi Panax ở Việt Nam có 5 loài, trong đó 3 loài
mọc tự nhiên là Sâm vũ diệp - P. bipinnatifidus Seem., Tam thất hoang - P.
stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng và Sâm việt nam - P. vietnamensis Ha et
Grushv. Cùng với hai loài nhập trồng là Nhân sâm - P. ginseng và Tam thất P.
notoginseng. Đồng thời cũng chính thức mô tả loài Tam thất hoang - P.
stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng. Từ đó đến nay, các tài liệu nhƣ: “Các
loài cây thuốc cần bảo tồn”, “Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam”, “Danh lục
thực vật Việt Nam” .v.v. đều đề cập đến loài Tam thất hoang - P.
stipuleanatus H.T. Tsai et KM. Feng kể trên. Tác giả mô tả đầy đủ chi tiết về
các loài Sâm này.
Năm 2007 “Sách đỏ Việt Nam” [38] mô tả về 3 loài thuộc chi Panax
gồm: P. bipinnatifidus (Seem). 1868 – Sâm vũ diệp (tên khác: Ngật đáp thất,
Tam thất hoang, Tam thất lá xẻ, Trúc tiết nhân sâm, Vũ diệp tam thất) phân
bố ở Lai Châu (Tả Phìn), Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên, núi Hoàng
Liên Sơn), còn có ở Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc; P. stipuleanatus H.T. Tsai et
K.M. Feng. 1975 phân bố ở Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, núi Hoàng Liên Sơn),
ngoài ra còn có ở Trung Quốc (Vân Nam); P. vietnamensis Ha & Grushv.
1985 phân bố ở Quảng Nam (Trà My), Kon Tum (Đăk Tô, Đắk Glei, núi
Ngọc Linh, Gia Lai, Lâm Đồng, còn có ở Trung Quốc. Cả ba loài này Sách đỏ
đều ghi lại đặc điểm nhận dạng, sinh học và sinh thái, phân bố, giá trị, tình

12
trạng, phân hạng, biện pháp bảo vệ kèm ảnh minh họa.
Năm 2013, Phan Kế Long & cs. [39] đã ghi nhận bổ sung cho khu hệ
thực vật Việt Nam thứ P. vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu &
S.Q. Cai vốn đƣợc phát hiện trƣớc đó ở Vân Nam, Trung Quốc. Nhóm
nghiên cứu đã phát hiện một số điểm phân bố của thứ loài này tại Mƣờng Tè,
Tam Đƣờng và Sìn Hồ tỉnh Lai Châu nên đƣợc đặt tên là Sâm lai châu. Tác
giả mô tả đầy đủ chi tiết về đặc điểm hình thái, phân bố, công dụng.
Năm 2014, Phan Kế Long & cs. [40] tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình
thái và DNA của 7 mẫu cây không có cơ quan sinh sản thuộc chi Panax thu
thập đƣợc ở núi Phu Xai Lai Leng (Kỳ Sơn, Nghệ An). Kết quả cho thấy các
mẫu nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với loài Tam thất hoang - P.
stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng (dựa trên trình tự vùng gen ITS-rDNA).
Các mẫu có đặc điểm chung là lá từ không xẻ thùy đến xẻ thùy 1 lần (thùy
nông hoặc sâu); cuống lá có lá kèm.
Đến năm 2016, Trần Ngọc Lân và cộng sự [41] đã nghiên cứu đặc điểm
hình thái, thành phần hóa học và chỉ thị DNA của các mẫu đƣợc gọi là "Sâm
puxailaileng" cũng thu thập ở địa điểm trên. Nghiên cứu đã cho thấy các mẫu
này có mối quan hệ gần gũi với Sâm việt nam (P. vietnamensis), khác xa với
Tam thất hoang (P. stipuleanatus) và Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) và kết
luận "Sâm phu xai lai leng" thuộc loài P. vietnamensis Ha et Grushv.. Các
mẫu này đƣợc tác giả cho rằng có đặc điểm đặc trƣng phân biệt với "Tam
thất hoang" ở "thân rễ mang các đốt mọc cùng 1 hƣớng, khi sấy khô thƣờng
dẻo và chuyển màu đen" trong khi loài "Tam thất hoang" có "thân rễ có các
đốt thƣờng mọc so le, khi sấy khô thƣờng cứng và chuyển màu trắng". Tuy
nhiên, những đặc điểm quan trọng khác lại chƣa đƣợc mô tả chi tiết nhƣ: có
hay không có lá kèm, hình dạng và màu sắc đĩa tuyến mật, hình dạng và màu
sắc quả chín... Ngoài ra, các tác giả đã không đề cập tới nơi lƣu giữ các tiêu
bản nghiên cứu. Sự không thống nhất của các kết quả nghiên cứu về đặc điểm
hình thái và trình tự vùng ITS-rDNA trên các cá thể thuộc chi Panax cùng thu
thập ở vùng núi Phu Xai Lai Leng ở trên có thể do tại đây có sự tồn tại của
nhiều hơn 1 loài Panax. Cả hai nhóm nghiên cứu đều cho rằng cần có những

13
nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử của các loài để có
đƣợc những kết quả chính xác hơn.
Nông Văn Duy & cs (2016) [42] khi nghiên cứu đặc điểm hình thái và
chỉ thị phân tử vùng gen ITS1-5.8S-ITS2, 18S rRNA và matK của quần thể
"Sâm langbiang" phân bố ở Cao nguyên Lâm Viên (núi Lang Biang, Lâm
Đồng) đã công bố đây là thứ mới của loài Sâm việt nam và đặt tên là P.
vietnamensis var. langbianensis N.V. Duy. V.T. Tran & L.N. Trieu.
Từ những nghiên cứu trên cho thấy chi Nhân sâm (Panax L.) ở Việt
Nam gồm 03 loài và 02 thứ ở Việt Nam mọc hoang dã bao gồm Sâm vũ diệp
(P. bipinnatifidus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), Sâm việt nam hay còn
đƣợc gọi là Sâm ngọc linh (P. vietnamensis var. vietnamensis), Sâm lai châu
(P. vietnamensis var. fuscidiscus) và Sâm langbian (P. vietnamensis var.
langbianensis).

14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu
Mẫu vật nghiên cứu bao gồm:
- 04 mẫu Sâm tự nhiên ở khu vực núi Phu Xai Lai Leng (Ký hiệu
Panax TB1 đến Panax TB4) trong đó có 02 mẫu có hoa non, lá, thân, rễ củ
(Panax TB1 và Panax TB2).
- 03 mẫu Sâm tại vƣờn ƣơm: 01 mẫu Sâm (Ký hiệu Panax TH1) gồm
lá và củ đƣợc thu tại vƣờn ƣơm ở xã Na Ngoi, Kỳ Sơn, Nghệ An; 02 mẫu
sâm gồm lá và củ (Ký hiệu Panax ML1 và Panax ML2) đƣợc thu tại vƣờn
ƣơm ở xã Mƣờng Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An thuộc sở hữu của Công ty
TNHH TH true MILK.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng Thực vật học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và phòng
Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt
Nam.
2.1.3. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
* Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm:
- Taq PCR mastermix 2x (QIAgen, Mỹ).
- BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ).
- Dung dịch TBE 10x (10mM Tris, 0.9 mM axir boric, 0.01 mM
EDTA) của hãng Invitrogen, Mỹ.
- Thuốc nhuộm an toàn (Malaysia).
- Kít tách chiết DNA (Trung Quốc).
- Kít tinh sạch sản phẩm PCR: QIAgen Quick Gel Extraction Kit
(QIAgen, Mỹ).
- Agarose (Invitrogen, Mỹ).

15
- Sephadex G50 (Sigma, Mỹ).
- Các hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (NaCl, CTAB, EDTA, Tris-
HCl, β-Mercaptoethanol, Isopropanol, Sodium acetate 3M, ethanol 100%,
70%, Rnase (10mg/ml)
- Hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE, dye ...).
* Hóa chất cho phản ứng
PCR: - Taq DNA polymerase
- MgCl2
- Mastermix 2X bao gồm:
+ dNTP
+ MgCl2
+ Taq DNA polymerase
2.1.4. Thi t ị và dụng cụ nghiên cứu
* Các thiết bị chính sử dụng trong thao tác thực hiện thí nghiệm:
- Tủ lạnh thƣờng và tủ lạnh sâu.
- Bể ổn nhiệt và lò vi sóng.
- Tủ khử trùng, máy sấy chân không.
- Máy khuấy từ, máy trộn.
- Máy soi cực tím.
- Máy khử trùng Mac - 250Nex (Sanyo, Nhật Bản).
- Máy định lƣợng DNA NanoDrop One (Thermo scientific – Mỹ).
- Cân phân tích (Precisa, Thụy Sĩ).
- Máy ổn nhiệt (Memmert, Đức).
- Máy trộn rung (Vortex - Fluka, Mỹ).
- Máy ly tâm 5415D (Eppendorf, Đức).

16
- Máy ly tâm lạnh (Hitachi, Nhật).
- Máy PCR Mastercycler (Eppendorf, Đức).
- Máy điện di agarose gel (BioRad, Mỹ).
- Máy soi gel (UVP, Mỹ).
- Pipette, đầu côn, ống eppendorf.
* Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu:
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi nhân bản vùng ITS-rDNA bằng kỹ thuật PCR với
cặp mồi theo Phan Kế Long và cs. (2014)
Ký hiệu Trình tự nucleotide (5’– 3’) Kích thƣớc Nhiệt độ
cặp mồi Lý thuy t bắt cặp
(bp) (Tm)C
PaITS-F 5’- CAC TGA ACC TTA TCA TTT 700 49-50
AG AG -3’
PaITS-R 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA
CTC AG -3'
* Phần mềm xử lý số liệu:
- ClustalW [43 ]
- GeneDoc 2.5 [44]
- MEGA X [45]

17
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Mẫu lá sâm
Tách chiết
DNA Tổng số
PCR
Khai thác trình tự trong NCBI
Thiết kế mồi
Cặp mồi
Cặp mồi
Vùng gen ITS-
rDNA
Giải trình tự
Đọc kết quả trình tự
gen
Phân tích số liệu, so sánh với
các loài thuộc chi Panax và
loài ngoài nhóm
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thí
nghiệm 2.2.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu
Thu thập mẫu cây trƣởng thành trong các chuyến thực địa ở khu vực
núi Phu Xai Lai Leng với cơ quan sinh sản để làm tiêu bản, chụp ảnh, ghi
chép, gắn etiket cho mẫu, mô tả …
Đối với cây non và cây trong vƣờn ƣơm chỉ thu mẫu lá và ghi nhận đặc
điểm hình thái lá, củ; thu 01 lá chét và bảo quản trong túi nylon có chứa
silicagel. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc -20o
C cho đến khi phân tích.

18
2.2.3. Phƣơng pháp định loại hình thái
Chụp ảnh, mô tả mẫu vật thu thập đƣợc
Phân loại mẫu vật sử dụng phƣơng pháp so sánh hình thái dựa vào các
tài liệu có liên quan, đặc biệt là các tài liệu định loại ở Việt Nam, các nƣớc
lân cận Việt Nam và tài liệu mô tả gốc của các chi.
2.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu sinh học phân tử
2.2.4.1. Phương pháp tách chi t DNA tổng số
DNA tổng số của các mẫu sâm đƣợc tách chiết bằng Dneasy Plant
Mini Kit theo qui trình sau:
- Lấy mẫu lá bảo quản lạnh sâu (-20◦C) đem nghiền trong nitrogen lỏng
(-196◦C) thành dạng bột mịn. Lấy 100mg bột cho vào ống eppendorf 1,5ml.
- Thêm 400μl đệm AP1 và 4ul Rnase A. Trộn đều bằng vortex và ủ ở
65◦C trong 10 phút. Đảo trộn 2 – 3 lần trong quá trình ủ.
- Thêm 130μl đệm AP2. Trộn đều và ủ trong đá 5 phút.
- Hút dịch ly giải vào cột QIAshredder Mini. Ly tâm tốc độ 14000rpm
trong 2 phút.
- Chuyển dịch qua cột vào ống eppendorf 1,5ml mới nhƣng không xáo
trộn. Thêm 1,5 lần thể tích đệm AP3/E và trộn đều bằng pipet.
- Chuyển 650μl hỗn dịch vào cột Dneasy Mini. Ly tâm tốc độ 8000rpm
trong 1 phút. Loại bỏ dịch qua cột. Lặp lại bƣớc này với phần hỗn dịch còn
lại.
- Đặt cột vào ống thu mới. Thêm 500μl đệm AW và ly tâm 8000rpm
trong 1 phút. Loại bỏ dịch qua cột.
- Thêm 500μl đệm AW. Ly tâm 14000rpm trong 2 phút. Loại bỏ dịch
qua cột.
- Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml có ghi nhãn. Thêm 100μl đệm
AE để hoà tan. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 6000rpm trong 1 phút. Lặp
lại bƣớc này, thu đƣợc dịch chiết chứa DNA tổng số, bảo quản ở -20◦C.

19
- Kiểm tra nồng độ DNA tổng số bằng máy định lƣợng DNA
NanoDrop One (Thermo scientific – Mỹ) (Hình 2.2).
Hình 2.2. Máy đo NanoDrop one
2.2.4.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ti n hành:

- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn, tính và tạo các nồng độ DNA của
các mẫu nhƣ nhau để khi đƣa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn
đƣợc giống nhau, và đạt nồng độ 10ng trong tổng thể tích là 25 l/ 1 phản ứng.
- Tính lƣợng thể tích các thành phần khác trong phản ứng, trộn đều các
thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA.

20
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu trình và cho máy
chạy. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với các thành phần nhƣ Bảng 2.2
Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 Taq PCR Mastermix 2x 12,5
2 Mồi xuôi 20 mM 1,0
3 Mồi ngƣợc 20 mM 1,0
4 DNA tổng số 10 ng 1,0
5 Nƣớc cất khử ion - 9,5
Tổng 25,0
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau: (Hình 2.3)
35 chu
96o
C 96o
C 72o
C 72o
C
2 30 50o
C 40giây 5 phút 4o
C
25

Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR

21
2.2.4.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng QIAquick

Các bƣớc tiến hành:

Sử dụng Dneasy plant mini kit (Qiagen, Đức) để tinh sạch sản phẩm
PCR. Các bƣớc tinh sạch sản phẩm:
Bước 1: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.

22
Bước 2: Cắt đoạn gel chứa băng DNA của từng mẫu, cho vào
eppendorf 1,5 ml.
Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt. Bổ sung 3 lần thể tích dung dịch
QG theo trọng lƣợng từng mẫu (1g gel tƣơng đƣơng 1000 μ dung dịch QG).
Bước 4: Ủ ở 50 0
C trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn. Để làm tan
gel tốt. lắc đều eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút.
Bước 5: Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu.
Màu của dung dịch tốt là màu vàng của QG ban đầu.
Bước 6: Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute đặt trong ống thu
dịch ly tâm của Kit và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700 μl dung
dịch PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm 13.000 rpm
trong 1 phút.
Bước 8: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm với 13.000
rpm trong 1 phút.
Bước 9: Chuyển cột sang eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, cho 10
μl EB vào cột và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Bước 10: Bỏ cột, bảo quản sản phẩm PCR trong ống eppendorf ở -20 0
C.
Bước 11: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự ở
Công ty Macrogen (Hàn Quốc).
2.2.4.4. Phương pháp phân tích số liệu
- Sử dụng chƣơng trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng
đã đƣợc các tác giả khác công bố trên ngân hàng DNA (Genbank).
- Các trình tự DNA đƣợc so sánh, phân tích với các loài thuộc chi
Panax và loài Eleutherococcus senticosus là loài ngoài nhóm (Bảng 2.3) sử
dụng các phần mềm ClustalW [46], GeneDoc 2.5 [47], phần mềm MEGA X
[48] đƣợc dùng để phân tích tiến hóa phân tử và xây dựng cây phát sinh
chủng loại theo phƣơng pháp Maximum Likelihood (ML) với giá trị

23
bootstrap dùng để đánh giá độ tin cậy của cây phát sinh chủng loại đƣợc tính
với 1.000 lần lấy mẫu thử (resampling) [45, 46].
Bảng 2.3. Danh sách trình tự sử dụng trong nghiên cứu thu thập trên Genbank
TT Loài/thứ ITS
U41680
1 P. ginseng
U41681
U41688
2 P. quinquefolius
U41689
U41702
3 P. japonicus Nhật Bản (JP)
AF263373
4 P. japonicus var. major U41683
5 P. japonicus var. bipinnatifidus U41679
6 P. japonicus var. angustifolius AY271915
7 P. japonicus var. bipinnatifidus HQ112421
8 P. notoginseng U41685
9 P. zingiberensis U41699
10
P. vietnamensis var. vietnamensis
KJ418193
Trà Linh, Quảng Nam
11
P. vietnamensis var. langbianensis
KX768322
Langbian, Lâm Đồng
12
P. vietnamensis var. fuscidiscus KJ418191
Mƣờng Tè, Lai Châu, Việt Nam (MT)

24
TT Loài/thứ ITS
13
P. vietnamensis var. fuscidiscus
KJ418187
Tam Đƣờng, Lai Châu, Việt Nam (TĐ)
14
P. vietnamensis var. fuscidiscus
KJ418184
Sìn Hồ, Lai Châu, Việt Nam (SH)
U41693
15 P. pseudoginseng
U41694
16 P. assamicus AY233322
17 P. trifolius U41698
18 P. wangianus U41690
19 P. sinesis AY271920
U41692
20 P. omeiensis
U41686
21 P. shangianus AY233328
HQ112444
HQ112441
22 P. stipuleanatus
AY271921
AY271922
23
P. stipuleanatus
KJ418196
Tam Đƣờng, Lai Châu, Việt Nam (TĐ)
24 Eleutherococcus senticosus AB570259

25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử một số taxon thuộc chi sâm (panax l.) ở vùng tây Nghệ An.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử một số taxon thuộc chi sâm (panax l.) ở vùng tây Nghệ An.doc

Similar to Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử một số taxon thuộc chi sâm (panax l.) ở vùng tây Nghệ An.doc (20)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (10)

Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử một số taxon thuộc chi sâm (panax l.) ở vùng tây Nghệ An.doc