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I MICROARRAY
 E IL LORO UTILIZZO IN
      DIAGNOSTICA


                          Elisa Menegatti
Università di Torino - Dipartimento di Medicina ed Oncologia Sperimentale
I microarray
 Linea ordinata di elementi
 microscopici su di una superficie
 piana su cui sono immobilizzati acidi
 nucleici, proteine, cellule o tessuti
 capaci di riconoscere e legare
 molecole specifiche.

                                   Tissue
DNA           Protein      Cell    microarray
microarray    microarray   microarray

       DNA microarray
DNA microarray (gene chip, DNA chip, o biochip)
è costituito da una collezione sonde (DNA o
oligonucleotidi) depositate in una posizione nota su
un supporto a formare una microgriglia (da cui il
nome microarray) che consente di identificarle in
modo univoco.

Il supporto può essere di vetro, plastica o siliconico




                          100 - 1 million DNA probes in 1 cm2

                            Dimensioni degli spot da 15 a 350 micron
Principio: appaiamento delle basi
complementari
Vengono utilizzati per:

• espressione genica

• genotipizzazione

• valutazione di delezioni, duplicazioni,
 riarrangiamenti

• profilo di metilazione

• analisi di micro-RNA
Una metodologia promettente…


                                        7000
•   2007 = 6517                                                                             6236
                                                                                                   6517
                                        6000




                  N° citazioni PubMed
•   2006 = 6236
                                        5000
•   2005 = 4406                                                                      4406
                                        4000
•   2004 = 3509                         3000
                                                                              3509

•   2003 = 2421                         2000
                                                                       2421
                                                                1557
•   2002 = 1557                         1000              834
•   2001 = 834                             0
                                                    294

•   2000 = 294                             1998   2000     2002          2004         2006          2008
                                                                  Anni
Punti di forza
• numero di informazioni disponibili   con
un’ unico esperimento
• miniaturizzazione
Fasi analitiche

•   Produzione dell’ array
•   Marcatura del campione
•   Ibridazione
•   Rilevazione del segnale (scan, imaging)
•   Analisi dei dati
1. PRODUZIONE DELL’
           ARRAY

• Per deposizione (cDNA, oligonucleotidi)

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• Ink-jet technology (oligonucleotidi)
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FOTOLITOGRAFIA
InkJet technology
Marcatura del campione

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Analisi dei dati
Analisi dell’ immagine
                                1.   Identificazione degli spot
                                     (automatica, semiautomatica,
                                     manuale)
                                2.   Segmentazione: separa gli
                                     spots dal background.
                                     Histogram
                                3.   Valutazione dell’ intensità:
                                     media o mediana dei pixels
                                     rilevati nello spot
                                4.   Correzione del background



Normalizzazione, software dedicati
DIAGNOSTICA
• Analisi dei geni espressi

• ANALISI DEI CNV             (Copy Number Variants),
       •pazienti con ritardo mentale
       •pazienti con dismorfismi
       •Ricerca di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti
                     array CGH

• RICERCA DI MUTAZIONI PUNTIFORMI

          • GENOTIPIZZAZIONE (SNP array)
          • SEQUENZIAMENTO DIRETTO (su array)
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  da poche centinaia a 2,3 milioni   (distanza minima
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          association studies
SEQUENZIAMENTO
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Menegatti 28 Nov 08

  • 1. I MICROARRAY E IL LORO UTILIZZO IN DIAGNOSTICA Elisa Menegatti Università di Torino - Dipartimento di Medicina ed Oncologia Sperimentale
  • 2. I microarray Linea ordinata di elementi microscopici su di una superficie piana su cui sono immobilizzati acidi nucleici, proteine, cellule o tessuti capaci di riconoscere e legare molecole specifiche. Tissue DNA Protein Cell microarray microarray microarray microarray DNA microarray
  • 3. DNA microarray (gene chip, DNA chip, o biochip) è costituito da una collezione sonde (DNA o oligonucleotidi) depositate in una posizione nota su un supporto a formare una microgriglia (da cui il nome microarray) che consente di identificarle in modo univoco. Il supporto può essere di vetro, plastica o siliconico 100 - 1 million DNA probes in 1 cm2 Dimensioni degli spot da 15 a 350 micron
  • 4. Principio: appaiamento delle basi complementari
  • 5. Vengono utilizzati per: • espressione genica • genotipizzazione • valutazione di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti • profilo di metilazione • analisi di micro-RNA
  • 6. Una metodologia promettente… 7000 • 2007 = 6517 6236 6517 6000 N° citazioni PubMed • 2006 = 6236 5000 • 2005 = 4406 4406 4000 • 2004 = 3509 3000 3509 • 2003 = 2421 2000 2421 1557 • 2002 = 1557 1000 834 • 2001 = 834 0 294 • 2000 = 294 1998 2000 2002 2004 2006 2008 Anni
  • 7. Punti di forza • numero di informazioni disponibili con un’ unico esperimento • miniaturizzazione
  • 8. Fasi analitiche • Produzione dell’ array • Marcatura del campione • Ibridazione • Rilevazione del segnale (scan, imaging) • Analisi dei dati
  • 9. 1. PRODUZIONE DELL’ ARRAY • Per deposizione (cDNA, oligonucleotidi) • Fotolitografia (oligonucleotidi) • Ink-jet technology (oligonucleotidi)
  • 13. Marcatura del campione Ibridazione Rilevazione del segnale (scan, imaging) Analisi dei dati
  • 14.
  • 15.
  • 16. Analisi dell’ immagine 1. Identificazione degli spot (automatica, semiautomatica, manuale) 2. Segmentazione: separa gli spots dal background. Histogram 3. Valutazione dell’ intensità: media o mediana dei pixels rilevati nello spot 4. Correzione del background Normalizzazione, software dedicati
  • 17. DIAGNOSTICA • Analisi dei geni espressi • ANALISI DEI CNV (Copy Number Variants), •pazienti con ritardo mentale •pazienti con dismorfismi •Ricerca di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti array CGH • RICERCA DI MUTAZIONI PUNTIFORMI • GENOTIPIZZAZIONE (SNP array) • SEQUENZIAMENTO DIRETTO (su array)
  • 19.
  • 20.
  • 21. SNPs analizzabili con un unico assay: da poche centinaia a 2,3 milioni (distanza minima raggiungibile 1,5 kb) Genome-wide association studies
  • 22.
  • 23. SEQUENZIAMENTO DIRETTO
  • 25.
  • 26.
  • 27.
  • 28.
  • 29.
  • 30. ARRAY CON MUTAZIONI CONOSCIUTE ARRAY SEQUENZIAMENTO Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46:3355