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AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Filippo Fassio
AOU Careggi
SOD Immunologia e Terapie Cellulari
(Direttore Prof. E. Maggi)
ImmunoCAP vs ISAC
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Diagnostica allergologica: evoluzione…
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Prick test ImmunoCAP (ImmunoCAP)
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Dosaggio IgE sieriche
• Test di diagnostica
“tradizionale”
• Anche diagnostica
molecolare, ma
pochissimi allergeni
disponibili
• Test di diagnostica
“tradizionale”
• Anche diagnostica
molecolare, con molti
allergeni disponibili,
da indicare
singolarmente
• Solo diagnostica
molecolare
• Pannello standard
(immodificabile) di
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allergeniche
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AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Allergologia molecolare: quale test?
ImmunoCAP
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Test ISAC
(Immuno Solid-phase Allergen Chip)
Pannello standard di 112 molecole
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Allergologia molecolare: quale test?
ImmunoCAP
ISAC
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Allergologia molecolare: test ISAC
Test ISAC
(Immuno Solid-phase Allergen Chip)
Pannello standard di 112 molecole
• Test non automatizzato
• Per l’esecuzione necessita di:
• Vetrino
• Scanner per microarray
• Solo diagnostica molecolare
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Step 1.
Reazione Antigene - Anticorpo
Gli anticorpi IgE presenti nel siero del
paziente riconoscono epitopi
specifici creando immunocomplessi
con le molecole allergeniche sulla
superficie del biochip.
Dettagli pratici:
Tempo di incubazione: 120 min
Lavaggio: 10 min in Sol A.
5 min in acqua distillata
ImmunoCAP ISAC®: la reazione
immunologica
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Step 2.
Reazione con anticorpo secondario
Gli anticorpi secondari anti-IgE
vanno a legarsi all'immunocomplesso
IgE-allergene fissato sulla superficie
del chip. La reazione viene evidenziata
dalla presenza di un fluoroforo sull'anticorpo
secondario.
Dettagli pratici:
Tempo di incubazione: 30 min
Lavaggio: 10 min in Sol A.
5 min in distilled water
ImmunoCAP ISAC®: la reazione
immunologica
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Step 3.
Acquisizione dell'immagine
Il raggio laser dello scanner
eccita il fluoroforo che
riemette la radiazione luminosa
a una diversa lunghezza d'onda.
Il segnale viene poi elaborato dal software
per la creazione dell'immagine.
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Tempo di scansione: 2 min
Lunghezza d'onda di eccitazione: 532 nm
Lunghezza d'onda di emissione: 570 nm
Laser
ImmunoCAP ISAC®: la reazione
immunologica
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
ImmunoCAP ISAC®
Immuno Solid-phase Allergen Chip
E’ un supporto solido sul
quale differenti molecole
native e ricombinanti sono
state fissate in una precisa
disposizione così da
formare un array
microscopico.
Questo permette il
monitoraggio simultaneo e
in parallelo delle
Interazioni biologiche con
piccole quantità di campione
e di reagenti.
~ 100 picogrammi allergene / spot
> 100 allergeni / cm²
~ 200 µm dimensioni dello spot
0
65.535
112
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Microarray ISAC: referto…
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Allergologia molecolare: quale test?
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Nello studio sono stati arruolati:
• Soggetti con allergie respiratorie
• Polisensibili (almeno 2 positività dei test
allergologici, non correlate tra loro)
• Poliallergici
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Può sostituire i test di laboratorio attualmente in uso per
la diagnosi delle allergopatie respiratorie?
Quali vantaggi offre dal punto di vista dell’inquadramento
diagnostico e della gestione clinica del paziente allergico?
Quali criticità sono emerse durante l’utilizzo del microarray
ISAC?
Allergologia molecolare: microarray ISAC
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
Può sostituire i test di laboratorio
attualmente in uso per la diagnosi
delle allergopatie respiratorie?
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Allergologia molecolare: quale test?
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Può sostituire i test di laboratorio
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delle allergopatie respiratorie?
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Allergologia molecolare: quale test?
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Quali vantaggi offre dal punto di
vista dell’inquadramento
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Allergologia molecolare: caratterizzazione
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sensibilizzazione ad
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Allergologia molecolare: terapie
Netto aumento delle prescrizioni di ITS
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l’utilizzo del microarray ISAC?
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• Metodica attualmente non automatizzata (ma automatizzabile)
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prime 2 ore richiesta presenza dell’operatore
• Risposte semi-quantitative (ISU)
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AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
ImmunoCAP vs ISAC: conclusioni…
Può sostituire i test di laboratorio attualmente in
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ImmunoCAP vs ISAC: conclusioni…
Quali vantaggi offre dal punto di vista dell’inquadramento
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AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
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AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
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AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
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AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
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Allergome…in caso di bisogno
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
ImmunoCAP vs ISAC: conclusioni…
La diagnostica molecolare in campo allergologico è l’evoluzione
teorica ed applicativa più significativa dalla caratterizzazione
delle IgE.
Aumenta il livello di complessità di interpretazione dei test, per
cui necessita di valutazione da parte di specialista allergologo,
con specifica esperienza di allergologia molecolare.
La metodica microarray ISAC, nella sua versione attuale,
presenta limiti principalmente legati alla “giovinezza” della
tecnologia e dell’approccio allergologico molecolare stesso.
Già oggi questa metodica, utilizzata congiuntamente ai test
allergologici “tradizionali” (in vivo o in vitro) permette una
migliore definizione diagnostica, le cui potenzialità sono solo
parzialmente esplorate.
AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
fassio.filippo@gmail.com

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Quale test per la diagnosi delle Allergie?

  • 1. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Filippo Fassio AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari (Direttore Prof. E. Maggi) ImmunoCAP vs ISAC
  • 2. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Diagnostica allergologica: evoluzione…
  • 3. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Prick test ImmunoCAP (ImmunoCAP) ISAC Dosaggio IgE sieriche • Test di diagnostica “tradizionale” • Anche diagnostica molecolare, ma pochissimi allergeni disponibili • Test di diagnostica “tradizionale” • Anche diagnostica molecolare, con molti allergeni disponibili, da indicare singolarmente • Solo diagnostica molecolare • Pannello standard (immodificabile) di 112 molecole allergeniche Introduzione: metodiche…
  • 4. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test? ImmunoCAP Allergeni singoli da richiedere singolarmente Test ISAC (Immuno Solid-phase Allergen Chip) Pannello standard di 112 molecole
  • 5. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test? ImmunoCAP ISAC
  • 6. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: test ISAC Test ISAC (Immuno Solid-phase Allergen Chip) Pannello standard di 112 molecole • Test non automatizzato • Per l’esecuzione necessita di: • Vetrino • Scanner per microarray • Solo diagnostica molecolare
  • 7. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Step 1. Reazione Antigene - Anticorpo Gli anticorpi IgE presenti nel siero del paziente riconoscono epitopi specifici creando immunocomplessi con le molecole allergeniche sulla superficie del biochip. Dettagli pratici: Tempo di incubazione: 120 min Lavaggio: 10 min in Sol A. 5 min in acqua distillata ImmunoCAP ISAC®: la reazione immunologica
  • 8. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Step 2. Reazione con anticorpo secondario Gli anticorpi secondari anti-IgE vanno a legarsi all'immunocomplesso IgE-allergene fissato sulla superficie del chip. La reazione viene evidenziata dalla presenza di un fluoroforo sull'anticorpo secondario. Dettagli pratici: Tempo di incubazione: 30 min Lavaggio: 10 min in Sol A. 5 min in distilled water ImmunoCAP ISAC®: la reazione immunologica
  • 9. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Step 3. Acquisizione dell'immagine Il raggio laser dello scanner eccita il fluoroforo che riemette la radiazione luminosa a una diversa lunghezza d'onda. Il segnale viene poi elaborato dal software per la creazione dell'immagine. Dettagli pratici: Tempo di scansione: 2 min Lunghezza d'onda di eccitazione: 532 nm Lunghezza d'onda di emissione: 570 nm Laser ImmunoCAP ISAC®: la reazione immunologica
  • 10. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 ImmunoCAP ISAC® Immuno Solid-phase Allergen Chip E’ un supporto solido sul quale differenti molecole native e ricombinanti sono state fissate in una precisa disposizione così da formare un array microscopico. Questo permette il monitoraggio simultaneo e in parallelo delle Interazioni biologiche con piccole quantità di campione e di reagenti. ~ 100 picogrammi allergene / spot > 100 allergeni / cm² ~ 200 µm dimensioni dello spot 0 65.535 112
  • 11. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Microarray ISAC: referto…
  • 12. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 ImmunoCAP (ImmunoCAP) ISAC • Test di diagnostica “tradizionale” • Anche diagnostica molecolare, con molti allergeni disponibili, da indicare singolarmente • Solo diagnostica molecolare • Pannello standard (immodificabile) di 112 molecole allergeniche Allergologia molecolare: quale test?
  • 13. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013
  • 14. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Nello studio sono stati arruolati: • Soggetti con allergie respiratorie • Polisensibili (almeno 2 positività dei test allergologici, non correlate tra loro) • Poliallergici
  • 15. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Può sostituire i test di laboratorio attualmente in uso per la diagnosi delle allergopatie respiratorie? Quali vantaggi offre dal punto di vista dell’inquadramento diagnostico e della gestione clinica del paziente allergico? Quali criticità sono emerse durante l’utilizzo del microarray ISAC? Allergologia molecolare: microarray ISAC
  • 16. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Può sostituire i test di laboratorio attualmente in uso per la diagnosi delle allergopatie respiratorie?
  • 17. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test?
  • 18. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test?
  • 19. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test?
  • 20. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test?
  • 21. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test?
  • 22. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Può sostituire i test di laboratorio attualmente in uso per la diagnosi delle allergopatie respiratorie?
  • 23. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test?
  • 24. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Quali vantaggi offre dal punto di vista dell’inquadramento diagnostico e della gestione clinica del paziente allergico?
  • 25. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: caratterizzazione 12% Polisensibili con sensibilizzazione predominante 29% Polisensibili “veri” 25% Polisensibili con cross-reattività 88% Polisensibili “veri” 29% Polisensibili con sensibilizzazione ad alimenti ?
  • 26. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: caratterizzazione 12% Polisensibili con sensibilizzazione predominante 11% Polisensibili con sensibilizzazione predominante 29% Polisensibili “veri” 6% ? 88% Polisensibili “veri” 25% Polisensibili con cross-reattività 29% Polisensibili con sensibilizzazione ad alimenti
  • 27. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: terapie Netto aumento delle prescrizioni di ITS per allergeni inalanti
  • 28. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: quale test? Quali criticità sono emerse durante l’utilizzo del microarray ISAC?
  • 29. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: costi
  • 30. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Allergologia molecolare: criticità ISAC • Metodica attualmente non automatizzata (ma automatizzabile) • Time-consuming: durata complessiva circa 4 ore; almeno nelle prime 2 ore richiesta presenza dell’operatore • Risposte semi-quantitative (ISU) • Non possibile dosaggio delle IgE totali Sufficienti 30 μl di sangue (puntura capillare), utile specialmente per pazienti pediatrici
  • 31. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 ImmunoCAP vs ISAC: conclusioni… Può sostituire i test di laboratorio attualmente in uso per la diagnosi delle allergopatie respiratorie? per il pannello graminacee per tutti gli altri allergeni inalanti
  • 32. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 ImmunoCAP vs ISAC: conclusioni… Quali vantaggi offre dal punto di vista dell’inquadramento diagnostico e della gestione clinica del paziente allergico? migliore definizione diagnostica test multiplex migliore gestione terapeutica (?) ampio pannello di allergeni risultati inattesi (aspecifici?)
  • 33. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 ImmunoCAP vs ISAC: conclusioni… Molecole allergeniche  Pazienti
  • 34. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 …ma in natura ce ne sono DI PIU’… 89 allergeni (VBC genomics) 103 allergeni (Phadia) 112 allergeni (Thermo Fisher) Il microarray ISAC cresce…
  • 35. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 Conclusioni
  • 36. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 www.allergome.org Allergome…in caso di bisogno
  • 37. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 ImmunoCAP vs ISAC: conclusioni… La diagnostica molecolare in campo allergologico è l’evoluzione teorica ed applicativa più significativa dalla caratterizzazione delle IgE. Aumenta il livello di complessità di interpretazione dei test, per cui necessita di valutazione da parte di specialista allergologo, con specifica esperienza di allergologia molecolare. La metodica microarray ISAC, nella sua versione attuale, presenta limiti principalmente legati alla “giovinezza” della tecnologia e dell’approccio allergologico molecolare stesso. Già oggi questa metodica, utilizzata congiuntamente ai test allergologici “tradizionali” (in vivo o in vitro) permette una migliore definizione diagnostica, le cui potenzialità sono solo parzialmente esplorate.
  • 38. AOU Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Allergologia Molecolare – 18 Aprile 2013 fassio.filippo@gmail.com