La presentazione dello stato di avanzamento del progetto IBERNAT-NBL - Identificazione di bersagli molecolari per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il neuroblastoma in occasione dell'evento intermedio.

1. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
IBERNAT-NBL
“ Identificazione di bersagli molecolari per lo sviluppo di nuove
strategie terapeutiche per il neuroblastoma”
Progetto Cluster “Top-Down” finanziato da Sardegna Ricerche
con fondi POR FESR 2014/2020
ASSE PRIORITARIO I “RICERCA SCIENTIFICA, SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE
Evento Intermedio
Stato di avanzamento del progetto
Pierluigi Onali
Dipartimento di. Scienze Biomediche,
Universita’ degli Studi di Cagliari

2. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Imprese che partecipano al Cluster
Prigen (Pula, CA)
Biomedical Research (Pula, Ca)
be biotech (CA)
Technical Project Service (CA)
Microbiol (Macchiareddu, CA)
Kinetika Sardegna (Quartu S. Elena, CA)
Ardea (CA)

3. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
PERCHE’ STUDIARE IL NEUROBLASTOMA ?
1) e’ il tumore solido extracranico piu’ frequente in eta’ pediatrica ed
e’ la prima causa di morte per malattia in eta’ prescolare;
2) la sopravvivenza a 5 anni delle forme ad alto rischio e’ del 40-50 %;
3) circa il 50-60 % dei pazienti con forme ad alto rischio sottoposti a
terapia tradizionale presentano una recidiva per la quale non vi
sono opzioni terapeutiche curative;
4) vi e’ quindi la necessita’ di sviluppare nuove strategie terapeutiche
dotate di maggiore efficacia e selettivita’ nelle forme ricorrenti o
refrattarie di neuroblastoma.

4. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Obiettivo del progetto
produrre a livello preclinico le basi razionali per lo sviluppo
di un nuovo approccio farmacologico del neuroblastoma
basato sull’ induzione di bersagli molecolari utilizzabili
come biomarcatori ed aggredibili con anticorpi coniugati a
farmaci citotossici (immunotossine)

5. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Articolazione del progetto
Sviluppo di una piattaforma biotecnologica per::
a) indurre la sovra-espressione di bersagli molecolari specifici
nelle cellule di neuroblastoma;
b) studiare una immunotossina diretta verso un bersaglio
molecolare specifico di superficie e capace di indurre un effetto
citotossico selettivo sulle cellule di neuroblastoma.

6. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Sviluppo di una piattaforma biotecnologica per::
Modelli cellulari di neuroblastoma umano utilizzati
Linea cellulare N-MYC status mut. Alk
------------------------------------------------------------------
LAN-1 ampl F1174L
Kelly ampl F1174L
BE(2C) ampl
IMR-32 ampl
NB1 ampl ampl.
SH-SY5Y no ampl. F1174L

7. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Sviluppo di una piattaforma biotecnologica per::Farmaci epigenetici
Una nuova classe di farmaci capaci di influenzare
l’espressione di proteine agendo sui meccanismi
epigenetici che regolano la trascrizione genica

8. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Sviluppo di una piattaforma biotecnologica per::

9. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Sviluppo di una piattaforma biotecnologica per::
Modified from: Bolden et al., 2006
La famiglia delle deacetilasi degli istoni (HDAC)
e loro inibitori
( )

10. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Sviluppo di una piattaforma biotecnologica per::
acido valproico & inibitori di HDAC
recettori Trk delle
neurotrofine
ALK
p75NTR & sortilin

11. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
. Recettori Trk, p75NTR e sortilin

12. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Sviluppo di una piattaforma biotecnologica per::
.
1) L’acido valproico aumenta l’espressione di p75NTR e
sortilin in diverse linee cellulari di neuroblastoma;
2) L’effetto dell’acido valproico e’ riprodotto da altri inibitori
delle deacetilasi degli istoni e dal knock-out della HDAC1;
3) L’acido valproico aumenta l’espressione di p75NTR e
sortilin nella membrana cellulare.
Induzione dell’ espressione di p75NTR e sortilin

13. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Morte
cellulare
anticorpo anti-p75NTR coniugato a tossina
Impiego di un anticorpo anti-p75NTR coniugato a tossina per indurre la morte
delle cellule di neuroblastoma che sovra-esprimono p75NTR

14. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
AttivitaAttivita’’ svolte in collaborazione con lsvolte in collaborazione con l’’ Impresa PrigenImpresa Prigen::
a) messa a punto di saggi per lo studio della melanogenesi
e della attivita’ della tirosinasi in estratti cellulari;
b) sviluppo di metodiche per lo studio della produzione di
matrice extracellulare in colture di fibroblasti umani.

15. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
IBMX + veicolo IBMX + acido kojico
Melanogenesi nelle cellule di melanoma murino B16-F1

16. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
Produzione di collageno 1a in fibroblasti isolati dalla cute umana

17. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese
be.biotech e Te.Pro. Service
Analisi di biomarcatori tumorali in esosomi

18. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Gli esosomi sono microvescicole che vengono secrete da
diversi tipi cellulari nel terreno di coltura e che si ritrovano
in abbondanza nei liquidi biologici (sangue, saliva, urine, e
latte materno).
Contengono proteine e materiale genetico (RNA)
Caratteristiche degli esosomi
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster

19. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
Secrezione cellulare di esosomi e microvescicole
Da: Raposo G. & Stoorvogel W., J. Cell. Biol. 200, 373-383, 2013

20. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
Trasferimento intercellulare di proteine ed RNA tramite vescicole extracellulari
Da: Raposo G. & Stoorvogel W. J. Cell. Biol. 200,373-383, 2013

21. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
Isolamento di esosomi dal terreno di coltura delle cellule di neuroblastoma con il kit
“Total exosomes isolation-Invitrogen”

22. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Risultati:
1) Il trattamento con acido valproico aumenta i livelli di
proteine HSP70, p75NTR e TrkC nelle cellule di
neuroblastoma, come indicato dagli esperimenti di
Western blot e dall’ analisi proteomica.
2) Gli esosomi isolati dal terreno di coltura delle cellule
trattate con acido valproico hanno mostrato un maggior
contenuto di HSP70, p75NTR e TrkC.

23. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Conclusioni:
Questi risultati suggeriscono il possibile impiego
degli esosomi come biomarcatori della risposta del
neuroblastoma al trattamento con farmaci
epigenetici.

24. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con l’Impresa Microbiol
Sviluppo di terreni e supplementi per la coltura di linee
cellulari di mammifero

25. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
Sviluppo di un clone cellulare capace di produrre e
secernere nel terreno di coltura il fattore neurotrofico
FAM150B (ALKAL2; augmentor α)
Il peptide FAM150B e’ un potente attivatore del
recettore ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) che
stimola la crescita e sopravvivenza cellulare.

26. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
cellule trasfettate
con cDNA di controllo
cellule trasfettate
con cDNA per FAM150B
terreno di coltura terreno di coltura
incubazione delle cellule
di neuroblastoma
incubazione delle cellule
di neuroblastoma
Analisi del terreno di coltura condizionato dai cloni delle cellule HEK293
esame delle risposte cellulari

27. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Attivita’ svolte in collaborazione con le Imprese del Cluster
Risultati
I risultati ottenuti utilizzando inibitori selettivi indicano che
il terreno di coltura condizionato dal clone trasfettato con il
gene FAM150B attiva il recettore ALK ed esercita effetti
anti-apoptotici nelle cellule NB1 ed SH-SY5Y

28. Universita’ degli Studi
di Cagliari
Dipartimento di
Scienze Biomediche
Conclusioni:
Lo sviluppo di un terreno di coltura contenente
FAM150B puo’ facilitare lo studio dell’ azione di
nuovi farmaci anti-tumorali sulla crescita e
proliferazione stimolate dal recettore ALK nel
neuroblastoma ed in altre neoplasie

29. Inibitori delle deacetilasi degli istoni e soppressione
dell’espressione di TrkB, un marcatore di aggressività del
neuroblastoma
Simona Dedoni
Dipartimento di Scienze Biomediche e Farmacologia Clinica,
Università degli Studi di Cagliari
Progetto Cluster “Top-Down” IBERNAT-NBL
Evento intermedio 26 Settembre 2019

30. Il Neuroblastoma e recettori per le neurotrofine
• L‘ espressione di diversi recettori tirosin-chinasici per le
neurotrofine (TrkA, TrkB e TrkC) svolge un ruolo importante
nella biologia e nell’ evoluzione clinica del neuroblastoma
• l’ espressione di TrkA nel neuroblastoma è un fattore
associato a regressione spontanea del tumore
• anche il recettore TrkC è espresso principalmente in tumori
con bassa stadiazione che si risolvono con esito favorevole

31. TrkB e aggressività nel neuroblastoma
• l’ espressione di TrkB nei tumori è indice di aggressività
determinando proliferazione e sopravvivenza delle cellule
tumorali ed è associata ad una prognosi sfavorevole.

32. Farmaci epigenetici: nuovi strumenti
nella terapia dei tumori
• agiscono sui meccanismi epigenetici che regolano la
trascrizione genica
• numerosi inibitori delle deacetilasi degli istoni (HDAC)
hanno mostrato efficacia verso diversi tumori ematologici
• diversi inibitori delle HDAC causano apoptosi delle cellule
di neuroblastoma

33. Effetti cellulari degli inbitori di HDAC

34. L’ acido valproico come inibitore delle HDAC
• L’acido valproico (VPA), un farmaco stabilizzante dell umore e
anti-epìlettico, si è recentemente rivelato come un potente inibitore
delle acetilasi degli istoni di classe I e lla ed è stato sperimentato
per la cura di diverse forme tumorali.
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

35. Il VPA riduce l’espressione del recettore TrkB
SH-SY5Y
SH-SY5Y
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

36. L’inibizione del TrkB è dipendente dal tempo e dalla
concentrazione di VPA
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

37. Riduzione della segnalazione intracellulare del
TrkB indotta da VPA
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

38. Riduzione della segnalazione intracellulare del TrkB
indotta da VPA in linee cellulari di neuroblastoma
con amplificazione del gene MYCN
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

39. Inibizione dell’espressione e la segnalazione di TrkB
da parte di inibitori di diverse forme di HDAC
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

40. Il silenziamento genico di HDAC1 aumenta
l’acetilazione degli istoni e riduce l’espressione di TrkB
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

41. Quali sono i meccanismi
coinvolti nella riduzione
dell’espressione di TrkB da
parte del VPA e degli altri
inibitori di HDAC?

42. L’ acido valproico sopprime l’espressione di TrkB
tramite il fattore di trascrizione RUNX3
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

43. L’acido valproico e il knock-down di HDAC1 riducono i
livelli di EZH2, un inibitore dell’espressione di RUNX3
Da: Dedoni S. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 370, 490-503

44. Meccanismi epigenetici coinvolti nella inibizione
dell’espressione di TrkB indotta dall’ acido valproico

45. Conclusioni
• farmaci epigenetici come gli inibitori delle HDAC
riducono l’espressione del recettore TrkB che è un
marker di prognosi negativa nel neuroblastoma
• l’effetto di inibizione esercitato su questo complesso
recettoriale può costituire una proprietà importante
nell’attività anti-neuroblastoma di questi farmaci

46. Università degli Studi di Cagliari
DIPARTIMENTO DI SCIENZE DELLA VITA E DELL’AMBIENTE‐ SEZIONE BIOMEDICA‐ LABORATORIO DI BIOCHIMICA
IBERNAT‐NBL
“ Identificazione di bersagli molecolari per lo sviluppo di nuove
strategie terapeutiche per il neuroblastoma”
Progetto Cluster “Top‐Down”
Progetto finanziato con fondi POR FESR 2014/2020 ‐ ASSE PRIORITARIO I “RICERCA SCIENTIFICA,
SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE.
Evento intermedio-26 Settembre 2019

47. APPROCCIO SPERIMENTALE
2DE‐PAGE/HR‐MS

48. Inibitori delle
deacetilasi degli
istoni (Ac. valproico)
LISI CELLULARE
obiettivi

49. Prima dimensione :
IEF Range pH 3‐10
Seconda dimensione : SDS‐PAGE
T% = 4‐20

50. 103
250
150
100
75
50
37
25
20
Taglio degli spot dal gel
Digestione triptica
15
10

51. ”Spettrometro di Massa LTQ-
Orbitrap Elite,
Thermo Fisher Scientific”
CESAR “Lab CR24
Spettrometria di Massa proteomica”
Università degli Studi di Cagliari

52. ANALISI DEGLI SPETTRI DI MASSA MEDIANTE SOFTWARE PROTEOME DISCOVERER

54. spot
Swiss Prot
code protein MW pI
2 P14625 Endoplasmin 92.4 4.84
4 P11142 Heat shock cognate 71 kDa
70,9
60,37 5.52
5
O95302
P20700
Peptidyl‐prolyl cis‐trans isomerase
FKBP9 Lamin‐B1 63 5.80
6 P08238 Heat shock 90 alfa 83.1 4.96
7 P07900 Heat shock 90 beta 84.5 4.94
8
P38646
P08133
Stress‐70 protein, mitochondrial
Annexin 6
73,6
75,8
6,16
5,60
9 P30101 Protein disulfide isomerase A3 56.7 6.35
11 P10809 Heat shock 60 61.0 5.87
12
P07437
P04350
P06576
P08670
Tubulin beta chain
Tubulin beta chain 4A
ATP sintase subnit beta
Vimentin
49,6
49,6
56,5
53,6
4,89
4,88
5,40
5,12
13
P06576
P09104
ATP sintasi subunit beta
gamma enolase
56.5
47.20
5.40
5.03
15 P29777 Calreticulina 48.1 4.44
16 Protein disulfide isomerase 48.1 5.08
21 P62258 14-3-3 protein epsilon 29.2 4.74
25 Q9BY22 L‐lactate dehydrogenase A‐like 6B 41.9 8.65

55. spot
Swiss Prot
code protein MW pI
25 Q9BY22 L‐lactate dehydrogenase A‐like 6B 41.9 8.65
26 Ubiquitin carboxyl hydrolase L1 isozime 24.8 5.48
28 P00441 Superoxide dismutase 15.9 6.13
29 P19876 C‐X‐C motif chemokine 3 11.3 10.37
31 P04792 Heat shock B‐1 22.8 6.4
32 Q99497 Protein/nbucleic acid deglycase DJ 19.9 6.79
33 P30041 Peroxiredoxin 6 25.0 6.38
34
P81605
P31151
Dermicidin
S100A7
11.3
11.5
6.54
6.77
35 P06733 alpha‐ enolase 47.1 7.39
36 P15121 Aldolase reductase 35.8 6.98
37
P60174
P18669
Phosphoglycerate mutase 1
Triosephoshate isomerase
28,8
30,8
7,18
5,92
38 Q15819 Ubiquitin E2 variant 2 16.4 8.09
39 P62937 peptidyl‐prolyl cis‐trans isomerase A 18.0 7.81
40
P23528
Q9Y281
Cofilin 1
Cofilin 2
18,5
18.70
8,09
7.88
42
P21796
P22626
Voltage‐dependent anion selective channel
protein 1
30,8
37,4
8,54
8,95
44 P07195 L‐lactate dehydrogenase B chain 36.6 3.05
47 P07195 L-lactate dehydrogenase B chain 36.50 5.72

56. 103
250
150
100
75
50
37
25
20
250
150
100
75
50
37
25
20
3 10
Valutare differenze statisticamente significative nel
livello delle proteine precedentemente identificate
ChemiDoc (BIORAD)

58. 250
150
100
75
50
37
25
20
3 10 Controllo Trattato
In totale il software identifica
52/1200 proteine variate
(p<0.05, fold change >1.2):
• 27 proteine con livelli
aumentati
•25 proteine con livelli ridotti

59. Alcuni dei quali precedentemente identificati mediante 2‐DE/MS
Protein Swiss
Prot
Spot
Endoplasmin P14625 2
78 kDa
glucose‐
regulated
protein
P11021 4‐5
Heat shock
cognate 71
kDa
P11142 4‐5
Lamin‐B1
P20700 5
Peptidyl‐prolyl
cis‐trans
isomerase
O95302 5
Stress‐70
protein,
mitochondrial
P38646 8
Annexin A6 P08133 8
L‐lactate
dehydrogenas
e A‐like
Q9BYZ2 25
Eterogenea
nuclear
ribonucleoprot
ein A2/B1
P21796 42
Eterogenea
nuclear
ribonucleoprot
ein A1
P09651 42
Voltage‐
dependent
anion‐selective
channel
P21796 42
Protein Swiss
Prot
Spot
Vimentin P08670 12
Tubulin β‐2A chain Q13885 12
Tubulin beta‐4B chain P68371 12
Tubulin alpha‐1B P68363 12
C‐X‐C mptif chemokine 3 P19876 29
N‐acetylglucosamine‐1
phosphotransferase γ
Q9UJJ9 29

60. Gene Ontology è un progetto bioinformatico atto a unificare la descrizione delle
caratteristiche dei prodotti dei geni in tutte le specie. In particolare clusterizza i prodotti
genici in base alla localizzazione cellulare e alla funzione biologica.

61. Protein Swiss
Prot
Spot
Endoplasmin P14625 2
78 kDa
glucose‐
regulated
protein
P11021 4‐5
Heat shock
cognate 71
kDa
P11142 4‐5
Lamin‐B1
P20700 5
Peptidyl‐
prolyl cis‐
trans
isomerase
O95302 5
Stress‐70
protein,
mitochondria
l
P38646 8
Annexin A6 P08133 8
L‐lactate
dehydrogen
ase A‐like
Q9BYZ2 25
Eterogenea
nuclear
ribonucleopr
otein A2/B1
P21796 42
Eterogenea
nuclear
ribonucleopr
otein A1
P09651 42
Voltage‐
dependent
anion‐
selective
channel
P21796 42
Proteine con livelli AUMENTATI nelle cellule trattate

62. Protein Swi
ss
Pro
t
Spo
t
Vimentin P0867
0
12
Tubulin β‐2A
chain
Q1388
5
12
Tubulin beta‐4B
chain
P6837
1
12
Tubulin alpha‐1B P6836
3
12
C‐X‐C mptif
chemokine 3
P1987
6
29
N‐
acetylglucosamine
‐1
phosphotransfera
se γ
Q9UJJ
9
29
Proteine con livelli DIMINUITI nelle cellule trattate

63. Prima dimensione : IEF
Range pH 4‐7
Seconda dimensione :
SDS‐PAGE T% = 10‐20

64. 4
250
150
100
75
50
37
25
20
7
RT: 0.00 - 45.00 SM: 7G
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
RelativeAbundance
13.52
12.40
11.78 20.10
19.0917.87
21.30 21.64
14.28 24.29 33.47 36.0428.25
36.2710.97 31.26
10.06 38.537.59 40.46 42.221.29 2.41 5.34
NL:
8.54E8
TIC F: FTMS
+ p NSI Full
ms
[350.00-
1500.00] MS
A14
Profilo TIC
Analisi degli spettri di massa:
•Automatizzata con PD
•Manuale
Analisi del lisato cellulare del campione trattato

65. CodiceUniP
rot del
p75NTR 10 20 30 40 50 60
kE ACPTGLYTHS GECCKACNLG EGVAQPCGAN
70 80 90 100 110 120
QTVCEPCLDS VTFSDVVSAT EPCKPCTECV GLQSMSAPCV EADDAVCRCA YGYYQDETTG
130 140 150 160 170 180
RCEACRVCEA GSGLVFSCQD KQNTVCEECP DGTYSDEANH VDPCLPCTVC EDTERqlrEC
190 200 210 220 230 240
TRWADAECEE IPGRWITRST PPEGSDSTAP STQEPEAPPE QDLIASTVAG VVTTVMGSSQ
250 260 270 280 290 300
PVVTRGTTDN LIPVYCSILA AVVVGLVAYI AFKrWNSCKq nkQGANSRPV NQTPPPEGEK
310 320 330 340 350 360
LHSDSGISVD SQSLHDQQPH TQTASGQALK GDGGLYSSLP PAKrEEVEKL LNGSAGDTWR
370 380 390 400 410 420
HLAGELGYQP EHIDSFTHEA CPVRALLASW ATQDSATLDA LLAALRriqr ADLVESLCSE
STATSPV

66. Digestione in silico del p75NTR
4
250
150
100
75
50
37
25
20
7

67. Spot8_Nano_09112018_XT_00001_MHp_ #2 RT: 2.00 AV: 1 NL: 1.50E5
F: FTMS + p NSIFull ms [300.00-2000.00]
1840 1860 1880 1900 1920 1940 1960
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
RelativeAbundance
1837.767
1932.014
1860.950
1891.931 1905.943
1965.9751937.927
1887.959
Spot8_Nano_09112018_XT_00001_MHp__190924114614 #2 RT: 2.00 AV: 1 NL: 6.26E5
F: FTMS + p NSIFull ms [300.00-2000.00]
1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
RelativeAbundance
1248.594
1154.581
1189.649
1250.672
1211.575
1220.705
1193.564 1238.6471185.631 1204.686 1227.655 1253.588
Spot8_Nano_09112018_XT_00001_MHp__190924114819 #2 RT: 2.00 AV: 1 NL: 7.34E5
F: FTMS + p NSIFull ms [300.00-2000.00]
1245 1250 1255 1260 1265 1270 1275 1280 1285 1290
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
RelativeAbundance
1263.656
1261.686
1252.598
1244.614
1272.674
1285.6851267.6071254.747 1277.727
Spot3_Nano_09112018_XT_00001_MHp__190924115032 #2 RT: 2.00 AV: 1 NL: 1.26E6
F: FTMS + p NSIFull ms [300.00-2000.00]
1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
RelativeAbundance
1706.825
1765.883
1601.800
1894.966
2178.0531629.904
1655.791
1805.777
2049.0191822.901
2009.0241947.9121728.892 2082.0231873.966 2164.147
Spettri di deconvoluzione dei frammenti triptici sperimentali di p75NTR

68. QGANSRPVNQTPPPEGEK
User AA Formula 1: C2 H3 N1 O1
Elemental Composition: C79 H129 N26 O29
MH+1
(av) MH+1
(mono)
1907.0625 1905.9413
[–] Main Sequence Ions
b y
--- 1 Q 18 ---
186.0873 2 G 17 1777.8828
257.1244 3 A 16 1720.8613
371.1674 4 N 15 1649.8242
458.1994 5 S 14 1535.7812
614.3005 6 R 13 1448.7492
711.3533 7 P 12 1292.6481
810.4217 8 V 11 1195.5953
924.4646 9 N 10 1096.5269
1052.5232 10 Q 9 982.4840
1153.5709 11 T 8 854.4254
1250.6236 12 P 7 753.3777
1347.6764 13 P 6 656.3250
1444.7292 14 P 5 559.2722
1573.7717 15 E 4 462.2195
1630.7932 16 G 3 333.1769
1759.8358 17 E 2 276.1554
--- 18 K 1 147.1128
Attribuzione della
sequenza
amminoacidica

69. 10 20 30 40 50 60
KEACPTGLYT HSGECCKACN LGEGVAQPCG ANQTVCEPCL DSVTFSDVVS ATEPCKPCTE
70 80 90 100 110 120
CVGLQSMSAP CVEADDAVCR CAYGYYQDET TGRCEACRVC EAGSGLVFSC QDKQNTVCEE
130 140 150 160 170 180
CPDGTYSDEA NHVDPCLPCT VCEDTERQLR ECTRWADAEC EEIPGRWITR STPPEGSDST
190 200 210 220 230 240
APSTQEPEAP PEQDLIASTV AGVVTTVMGS SQPVVTRGTT DNLIPVYCSI LAAVVVGLVA
250 260 270 280 290 300
YIAFKRWNSC KQNKQGANSR PVNQTPPPEG EKLHSDSGIS VDSQSLHDQQ PHTQTASGQA
310 320 330 340 350 360
LKGDGGLYSS LPPAKREEVE KLLNGSAGDT WRHLAGELGY QPEHIDSFTH EACPVRALLA
370 380 390
SWATQDSATL DALLAALRRI QRADLVESLC SESTATSPV
Versante EXTRACELLULARE
Versante INTRACELLULARE
Protein Coverage p75NTR = 15%

70. Obiettivi futuri:
•Completare l’identificazione delle proteine
con diversi livelli di espressione tra campione
trattato e non trattato.
•Confermare i diversi livelli di espressione del
p75NTR tra controllo e campione trattato.
GRAZIE PER L’ATTENZIONE

71. IBERNAT-NBL
“ Identificazione di bersagli molecolari per lo sviluppo
di nuove strategie terapeutiche per il neuroblastoma”
Regolazione dell’espressione genica
indotta da farmaci epigenetici
Relatori: Prof.ssa Angela Ingianni
Dott.ssa Luisa Marras
Universita’ degli Studi di Cagliari
Progetto Cluster “Top-Down” finanziato da Sardegna Ricerche
con fondi POR FESR 2014/2020
ASSE PRIORITARIO I “RICERCA SCIENTIFICA, SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE
Evento intermedio

72. Lisi del campione con
Lysis Buffer + 2-
mercaptoetanolo
Aggiunta di
etanolo 70%
Inserire la cartuccia
con la membrana
per legare l’RNA
Lavaggi
o con
soluzion
e
tampone
Eluizione
RNA
Trattamento
con Dnase
Linee cellulari di
neuroblastoma
umano (SH-SY5Y,
LAN-1, Kelly..)
Prelievo
cellule in
coltura
Estrazione RNA
- lisi
-deproteinizzazione
- trattamento con DNasi
-eluizione colonnina
- quantizzazione
Sintesi cDNA
ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE RNA
Metodica

73. Lettura
spettrofotometrica
Diluizioni
cDNA
VERIFICA della
purezza e della
quantità dei cDNA
A 260/ A 280 = 1.8 -
2
RT- PCR
Relative
Quantification
Miscela di reazione
- SYBR® Green master mix
- Primer fwd
- Primer rev
- 100 ng/µL cDNA
- H2O distilled
RT- PCR
housekeeping gene: Actina β umana
target
Metodica
Actβ-FWD 5’ CACCATTGGCAATGAGCGGTTC 3’ Actβ-REV 5’ AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT 3’
TrkB-FWD 5’ ACAGTCAGCTCAAGCCAGACAC
3’
TrkB-REV 5’ GTCCTGCTCAGGACAGAGGTTA 3’
p75NTR-FWD 5’ TGGGCAGGACCTCAGAGTCC 3’ p75NTR-REV 5’ TTCCTCCCTCTGAGTCTCTG 3’
Sortilin-FWD 5’ CTGGGTTTGGCACAATCTTT 3’ Sortilin-REV 5’ CACCTTCCTCCGGTCAAA 3’
Alk-FWD 5’ AGATCTCTGTTCGAGTCCCT 3’ Alk-REV 5’ TCTGTAAACCAGGAGCCGTA 3’

74. RT- PCR
La cinetica di formazione dell’amplificato
viene visualizzata graficamente mediante
degli istogrammi
Dopo ogni rilevamento i segnali
di fluorescenza vengono
processati da un software
Cicli di reazione
Incremento segnali
fluorescenza Rn
Metodica

75. Riduzione dei livelli di mRNA per TrkB in cellule
SH-SY5Y trattate con acido valproico (VPA)
0
25
50
75
100
vehicle VPA
*
TrkBmRNA
(%control)
Risultati
45% ± 5% (P < 0.001, N = 3)
acido valproico

76. Aumento dei livelli dei mRNA per p75NTR e Sortilin indotto
dall’ acido valproico nelle cellule di neuroblastoma
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
p75N
TR
sortilin
***
*
mRNA
(foldincrease)
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
p75N
TR
sortilin
∋
***
*
mRNA
(foldincrease)
SH-SY5Y LAN-1
Risultati

77. Meccanismi di attivazione e di
segnalazione del recettore ALK
Kelly
Riduzione dei livelli di mRNA per ALK in cellule di
neuroblastoma trattate con acido retinoico (RA).
Risultati
ALK tyrosine kinase receptor o CD246, è un recettore
tirosin chinasico transmembrana umano codificato dal
gene ALK
Gioca un ruolo importante nello sviluppo cerebrale e
in generale nello sviluppo neuronale del sistema
nervoso centrale
Riarrangiamenti, mutazioni o amplificazioni del gene
ALK sono associati all’insorgere del neuroblastoma
L’identificazione di ALK come bersaglio
terapeutico rappresenta un importante passo nella
ricerca avanzata in questo tumore infantile.