Analisis Molekuler Genotipe Parasit Untuk Melihat Potensi Terjadinya Zoonosis menjelaskan tentang isolasi DNA parasit, amplifikasi DNA menggunakan PCR, sekuensing DNA, dan analisis hasil sekuensing untuk melihat kekerabatan antar spesies parasit guna mengetahui potensi terjadinya penularan dari hewan ke manusia.

1. “Analisis
Molekuler
Genotipe Parasit
Untuk Melihat
Potensi Terjadinya
Zoonosis”
Kuliah Umum Prodi D3 Teknologi Laboratorium Medis
Poltekkes Kemenkes Mataram
Oleh : Marlina Kamelia, M. Sc. Mataram, 3
September 2022

2.  WHO (1981):
Penyakit dan infeksi yang secara alami dapat ditularkan di
antara hewan vertebrata dan manusia
ZOONOSIS ?

3. Klasifikasi Zoonosis
1. Tipe agen penyakit
2. Tipe siklus hidup agen penyakit
3. Arah penularan
4. Spesies hewan vertebrata

4. Tipe agen penyakit
a. Zoonosis bakterial
b. Zoonosis mikotik
c. Zoonosis viral
d. Zoonosis parasitik

5. Zoonosis kausa bakteri
Antraks
Tuberkulosis
Salmonelosis
Bruselosis
Botulisme
Leptospirosis
Kolibasilosis
Listeriosis
Yersiniosis

6. Zoonosis kausa mikotik
 Aspergillosis
 Dermatomycosis
 Candidiasis

7. Zoonosis kausa parasit
Taeniasis dan Sistiserkosis
Trichinellosis

8. Zoonosis kausa virus
Rabies
AI
Orf
Japanese B. encephalitis

9. Zoonosis kausa protozoa
Toksoplasmosis

10. Tipe siklus hidup agen
penyakit
a. Orthozoonosis
b. Cyclozoonosis
c. Metazoonosis
d. Saprozoonosis

11. a. Orthozoonosis /
Direct zoonosis
 Zoonosis di mana untuk siklus hidup agen penyakitnya dibutuhkan
hospes 1 spesies vertebrata
 Contoh: anthrax, brucellosis, candidiasis, dermatomycosis, rabies,
influenza, trichinosis, toxoplasmosis

12. contoh: Rabies

13. Manusia tertular melalui:
1. Kontak langsung dengan:
 Hewan terinfeksi
 Jaringan terinfeksi
 Ekskresi
2. Kontak tidak langsung dengan:
 Inhalasi droplet
 Inhalasi aerosol
 Inhalasi /ingesti benda-benda

14. b. Cyclozoonosis
 Zoonosis di mana untuk siklus hidup agen penyakitnya
dibutuhkan hospes > satu spesies vertebrata
 Contoh: hydatidosis, taeniasis & cysticercosis

15. anjing
contoh:Hydatidosis
V1
V2
V2

16. c. Metazoonosis
 Zoonosis di mana untuk siklus hidup agen penyakitnya
dibutuhkan hospes vertebrata dan invertebrata
 Contoh: babesiosis, trypanosomiasis, schistosomiasis

17. Contoh: Babesiosis
inv
v

18. 4 tipe metazoonosis
 Tipe I : dibutuhkan hospes vetebrata dan 1 invertebrata
 Contoh: Jungle Yellow Fever
nyamuk
kera
inv
V

19.  Tipe II: dibutuhkan hospes 1 vertebrata dan 2 invertebrata
 Contoh: paragonimiasis
(inv1)
(inv2)
(v)

20.  Tipe III : dibutuhkan hospes 2 vertebrata dan 1 invertebrata
 Contoh: Chlonorchiasis
v2
Inv
v1

21.  Tipe IV : dibutuhkan hospes 1 vertebrata, 1 Invertebrata dan
penularan di antara invertebrata secara transovarial.
 Contoh: Boutonneuse fever
v
inv
transovarial
inv
v
v

22. d. Saprozoonosis
 Zoonosis di mana untuk siklus hidup agen penyakitnya
dibutuhkan hospes vertebrata dan reservoir non-hewan
 Contoh: coccidioimycosis, histoplasmosis,
visceral larva migrans.
 Reservoir non-hewan:
tempat berkembangnya agen penyakit selain pada hewan,
yaitu air, tanah, tanaman dan bahan-bahan organik
seperti makanan.

23. Contoh:
(coccidioimycosis)
RNH
v

24. 3 tipe Saprozoonosis
 Tipe I : dimana agen penyakitnya memperbanyak diri dalam
reservoir non-hewan. Contoh: Histoplasmosis
multiplikasi
v
RNH

25.  Tipe II : di mana agen penyakitnya mengalami perkembangan
esensiil tanpa memperbanyak diri dalam reservoir non hewan
 Contoh: visceral larva migrans
(telur ccg.)
V
2
RNH
(larva st.II)
RNH

26.  Tipe III: (Saprometazoonosis):
Zoonosis di mana untuk siklus hidup agen penyakitnya dibutuhkan
hospes vertebrata, invertebrata dan reservoir non-hewan. Contoh:
Fascioliasis
（inv）
RNH
V
V

27. Menurut arah penularan
a. Anthropozoonosis
b. Zooanthroponosis
c. Amphixenosis

28. a. Anthropozoonosis
 Zoonosis yang ditularkan oleh hewan vertebrata kepada
manusia dan hewan vertebrata lainnya.
 Contoh: brucellosis, rabies, hydatidosis, visceral larva
migrans
hewan
vertebrata
hewan vertebrata
lain
manusia

29. b. Zooanthropozoonosis
 Zoonosis yang ditularkan oleh manusia kepada hewan
vertebrata dan manusia lainnya.
 Contoh: amebiasis, diphteria, tbc. manusia
hewan
vertebrata
manusia
manusia lain

30. c. Amphixenosis
 Zoonosis yang ditularkan oleh manusia kepada hewan
vertebrata dan sebaliknya.
 Contoh: staphyloccocis,
streptococcosis
manusia manusia
hewan
vertebrata
hewan
vertebrata

31. Menurut SPESIES Hewan Vertebrata
 Zoonosis di antara manusia dan hewan liar
contoh: Rabies, Jungle Yellow Fever
 Zoonosis di antara manusia dan hewan piara
contoh: Brucellosis, Leptospirosis
 Zoonosis di antara manusia dan hewan
rumah
contoh: Amebiasis, Coccidioimycosis

32. Analisis Molekuler Genotipe Parasit
Isolasi DNA PCR Sekuensing Analisis

34. Isolasi DNA
 Merusak/membuka sel /lysyis dinding sel (phisik atau kimia)
 Memisahkan lipid (membran sel) dengan penambahan detergen
(Buffer)
 Mengeliminasi protein dengan penambahan enzim protease
 Precipitasi DNA dengan alkohol — biasanya etanol atau isopropanol
yang didinginkan. Karena DNA tidak larut di dalam alkohol, maka akan
mengumpul atau menjadi pelet bila disentrifugasi.
 Pemurnian dengan mengulang metode yang sama.
 Larutkan dengan air atau buffer.
 Jumlah DNA yang diekstrak : mg/ml atau ug/ml

35. DNA Isolasi/ekstraksi DNA dari
Jaringan/sel ( organel apa ?)
 Eliminasi RNA dengan enzyme RNA-se
 Kuantifikasi dengan spektrophotometer pada absobent
260 nm.
 DNA disimpan dan dapat digunakan sewaktu-waktu,
disebut dengan template
 DNAPenyimpanan: 4oC, -20oC, atau -80oC (tergantung
tujuan)

40. DNA Purification &
Quantification
 Memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya (protein,
lipid, RNA, dll.)
 Menghindari fragmentasi molekul DNA oleh endogenous
nucleases (DNase enzymes)
 Membuat DNase tidak aktif menggunakan pemanasan
atau chelating agents.

41. Ekstraksi DNA Langkah
langkah: Melisis sel Protein
 Melisis sel Protein
 Menyingkirkan kontaminan
Protein
RNA
Makromolekul lain
 Menentukan konsentrasi DNA yang sudah dimurnikan

42. 1. Lisis Sel

43. 2. Memisahkan DNA
DNA harus dipisahkan dari protein dan debris seluler.
Metode pemisahan :
a) Organic extraction
phenol: chloroform digunakan untuk ekstraksi DNA.
b) Salting out
Pada konsentrasi garam yang tinggi, protein mengalami
dehidrasi  kehilangan kelarutan  mengendap
Biasanya digunakan : sodium chloride, potassium acetate
or ammonium acetate.
Protein yang terpresipitasi disingkirkan dengan
sentrifugasi
DNA terdapat dalam supernatan.

45. Kesimpulan isolasi DNA
Ada 3 tahapan dasar dan dua tahapan tambahan dalam
ekstraksi DNA yaitu :
 lisis sel, untuk mendapatkan DNA
 menyingkirkan membran sel  menambahkan detergen
atau surfaktan
 menyingkirkan protein dengan menambahkan protease
 menyingkirkan RNA dengan menambahkan RNAse
 mempresipitasikan DNA dengan alkohol biasanya ice cold
ethanol  untai DNA akan beraggregasi  pellet pada
sentrifugasi

46. Polymerase Chain Reaction
(PCR)
 Tehnik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode
amplifikasi (penggandaan) fragmen DNA secara in vitro.
 PCR merupakan proses yang berulang dan terdiri dari tiga
tahapan utama:
1. Denaturasi DNA template menggunakan pemanasan
2. Annealing atau penempelan primer (berupa oligonukleotida
rantai tunggal dan pendek)
3. Extension atau pemanjangan primer menggunakan enzim taq
polimerase

47. Komponen Esensial Proses
Polymerase Chain Reactions
 Enzim DNA polymerase (taq polymerase) yang tahan dan stabil
pada suhu tinggi untuk mengkatalisis terjadinya proses elongasi
primer pada DNA template.
 Primer (tunggal atau sepasang oligonukleotida rantai pendek untuk
menginisiasi terjadinya proses ekstension oleh enzim taq
polymerase.
 Deoxynucleoside triphosphate (dATP, dTTP, dCTP, and dGTP)
berupa basa nitrogen yang dibutuhkan dalam proses PCR
 Kofaktor enzim taq polymerase (MgCl2)
 Buffer untuk mempertahankan pH (Buffer TAE atau TBE untuk
mempertahankan pH 8,3 – 8,8 pada suhu ruangan)
 Template DNA (cetakan molekul DNA dalam proses PCR)

63. Sekuensing DNA
 Merupakan suatu metode untuk mengetahui
urutan basa nukleotida pada suatu gen atau
genom
 Ditemukan oleh Frederick Sanger tahun 1977
 Disebut juga dengan nama Chain Termination
Methods
 Pada Human Genome Project, sekuensing dengan
metode Sanger

64. Metode Sanger
 Memiliki prinsip seperti reaksi PCR
 Tetapi terdapat salah satu bahan unik yang ditambahkan,
yaitu dideoksinukleotida (ddNTP)
 ddNTP memiliki mirip dengan deoksinukleotida (dNTP)
yang biasa (adenin, guanine, sitosin dan timin), hanya
saja tidak memiliki gugus hidroksil pada molekul gula

65. ddNTP vs dNTP

66. Metode Sanger
 Akibat tidak adanya gugus hidroksil pada molekul gula,
pemanjangan pita DNA akan terhenti
 Karena gugus hiroksil ini seperti “jangkar” tempat tautan
nukleotida baru ditambahkan

67. DNA dalam
satu untaian

68. Metode Sanger
 Pada ddNTP juga ditambahkan pewarna flouresens, yang
dapat berendar jika ditembakkan laser

69. Metode
Sanger

70. Metode Sanger

71. Metode Sanger
1. https://www.youtube.com/watch?v=ONGdehkB8jU
2. https://www.khanacademy.org/science/biology/biotec
h-dna-technology/dna-sequencing-pcr-
electrophoresis/a/dna-sequencing

72. Next Generation Sequencing
(NGS)
 Merupakan metode sekuensing yang terbaru
dapat mensekuen DNA yang panjang (whole
genome) melalui proses paralel
 Sehingga dapat memangkas waktu dan biaya
pengerjaan
 Dengan menggunakan Metode Sanger sekuensing
genome manusia memakan waktu 10 tahun,
sedangkan dengan NGS hanya memerlukan waktu 1
hari

74. Keunggulan Metode NGS
1. Mendapatkan sekuen dari DNA berukuran besar
2. Harga reaksi per basa lebih murah dibandingkan dengan
metode Sanger

75. Penggunaan NGS

76. Penggunaan NGS
 Penemuan anti kanker
 Sekuensing whole genome bakteri
 Melihat interaksi DNA/RNA-protein
 Analisis variasi genetik pada spesies
 dll

77. Kelemahan Metode NGS
1. Data yang dihasilkan sangat besar, memerlukan sarana
yang memadai untuk penyimpanan
2. Harga mesin sangat mahal

78. Analisis Hasil Sekuensing
Analisa untuk melihat tingkat
kekerabatan antar spesies
melalui pensejajaran sekuens
menggunakan urutan gen
didasarkan pada akses yang
tersedia di Gene Bank

79. Penelitian Genotipe Parasit