Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang

Luận Văn Group hỗ trợ viết luận văn thạc sĩ,chuyên đề,khóa luận tốt nghiệp, báo cáo thực
tập, Assignment, Essay
Zalo/Sdt 0967 538 624/ 0886 091 915 Website:lamluanvan.net
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối
với TS. Trần Quang Hải - giảng viên khoa Hóa - Trường Đại học Công
Nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Tiến Đạt - Trung
tâm Nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn Lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thức
kinh nghiệm quý báu cho em.
Cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựa
tinh thần, nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn.
Trong quá trình làm báo cáo này mặc dù đã được sự giúp đỡ tận tình và
hết sức cố gắng nhưng do trình độ và thời gian nghiên cứu còn hạn chế nên
không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận được ý
kiến đóng góp chỉ bảo của các quý thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2020
Sinh viên
Phạm Thị Hoa

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...........................................................................2
1.1 TỔNG QUAN VỀ TANIN .........................................................................2
1.1.1 Khái niệm, tính chất .................................................................................2
1.1.2 Phân loại...................................................................................................2
1.1.2.1 Tanin thủy phân.....................................................................................2
1.1.2.2 Tanin ngưng tụ ......................................................................................5
1.1.2 Hoạt tính sinh học của tanin.....................................................................7
1.1.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn ..........................................................................7
1.1.2.2 Hoạt tính kháng vi-rút...........................................................................8
1.1.2.3 Hoạt tính chống viêm............................................................................8
1.1.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa .......................................................................8
1.1.3 Một số phương pháp định lượng tanin.....................................................9
1.1.3.1 Phương pháp chuẩn độ..........................................................................9
1.1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.............................................10
1.1.3.3 Phương pháp đo quang........................................................................11
1.2 CÁC THỰC VẬT CHỨA NHIỀU TANIN..............................................12
1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV - VIS ĐỊNH LƯỢNG TANIN......14
1.3.1 Phương pháp phân tích đo quang...........................................................14
1.3.1.1 Nguyên tắc của phép đo phổ UV - VIS ..............................................14
1.3.1.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy đo quang phổ ....................15
1.3.1.3 Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis ......................................17

1.3.1.4 Phương pháp định lượng.....................................................................18

1.3.2 Định lượng tổng hàm lượng tanin ngưng tụ trong thực vật bằng phương
pháp đo quang .................................................................................................21
1.4 GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ)
CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.............................................................22
1.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD)......................................................................22
1.4.2 Giới hạn định lượng (LOQ) ...................................................................24
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ...................................................................26
2.1 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT ....................................................................26
2.1.1 Hóa chất..................................................................................................26
2.1.2 Dụng cụ - thiết bị....................................................................................26
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................29
2.3 CHUẨN BỊ DÃY DUNG DỊCH CHUẨN ...............................................30
2.4 CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH...............................................................31
2.5 CHUẨN BỊ MẪU KHẢO SÁT GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ
GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP..........................31
2.6 XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................33
3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN ĐO QUANG .................................33
3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ XÂY DỰNG
ĐƯỜNG CHUẨN...........................................................................................34
3.3. KẾT QUẢ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH
LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP........................................................36
3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG TỔNG TANIN NGƯNG TỤ TRONG MỘT
SỐ MẪU CAO CHIẾT TRÀ HOA VÀNG....................................................38
KẾT LUẬN ....................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................41

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of detection)
LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid
chromatography)
UV: Tử ngoại
VIS: Khả kiến
ACN: Acetonitril
TFA: Trifluoroacetic
AOAC: Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of
Official Analytical Chemists).
MeOH: Methanol

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Liên kết hidro giữa tanin với protein ................................................2
Hình 1.2: Cấu tạo của axit gallic, axit m - digallic và axit m - trigallic ...........3
Hình 1.3: Cấu tạo của axit ellagic và corilagin.................................................4
Hình 1.4: Cấu tạo của các flavanol ...................................................................5
Hình 1.5: Cấu tạo của epigallocatechin gallate.................................................6
Hình 1.6: Cấu tạo của epicatechin gallate.........................................................7
Hình 1.7: Cấu tạo của gallocatechin gallate......................................................7
Hình 1.8: Một số loài thực vật chứa nhiều tanin.............................................13
Hình 1.9: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của máy đo quang phổ...........................17
Hình 1.10: Dạng đồ thị của phương pháp đường chuẩn .................................19
Hình 1.11: Đồ thị đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn ......................21
Hình 1.12: Nguyên lý phản ứng giữa tanin ngưng tụ với thuốc thử...............22
Hình 2.1: Hệ thống máy đo quang UV - Vis ..................................................27
Hình 2.2: Hệ thống máy cô quay chân không.................................................27
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình chiết mẫu lá trà hoa vàng ......................................29
Hình 3.1: Phổ hấp thụ của proanthocyanidin A2............................................33
Hình 3.2: Đường chuẩn của proanthocyanidin A2 .........................................35

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Hàm lượng tanin trong một số loài thưc vật...................................13
Bảng 1.2: Dãy dung dịch chuẩn của phương pháp thêm chuẩn......................20
Bảng 2: Bảng dãy đường chuẩn của proanthocyanidin A2.............................30
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quy trình định lượng.......35
Bảng 3.2: Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ) ..............................................................................................................37
Bảng 3.3: Kết quả phân tích hàm lượng tanin tổng trong một số mẫu cao chiết
trà hoa vàng .....................................................................................................38

Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước có thảm thực vật đa dạng và phong phú với
nhiều loài thực vật, được sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, cũng như bổ
dưỡng nâng cao sức khỏe cho con người. Có nhiều loài thực vật được ví như
là một loại dược liệu được dùng phổ biến trong y học dân gian làm thuốc. Các
nghiên cứu cho thấy, tanin có trong nhiều loài thực vật như: ổi, chè xanh,
măng cụt... Tanin có nhiều hoạt tính sinh học như: hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm, chống khối u, kháng virut... nên nó được ứng dụng khá rộng rãi
trong y học hiện đại ngày nay.
Ngày nay, để xác định hàm lượng của các chất trong nhiều loài thực
vật, nhiều kỹ thuật phân tích mới và hiện đại như quang phổ UV - Vis, HPLC,
quang phổ đạo hàm… đã được áp dụng vào việc phân tích. Trong đó, quang
phổ UV - Vis là phương pháp được sử dụng rộng rãi vì nó có độ nhạy cao,
phân tích thuận tiện.
Song song với việc tìm ra các kĩ thuật mới thì việc kiểm tra lại giá trị
của phương pháp phân tích với mục đích đảm bảo độ chính xác, độ tin cậy
của số liệu phân tích và tăng tính ứng dụng của phương pháp đó trong thực
tiễn cũng rất quan trọng. Vì vậy, tôi chọn đề tài “Xây dựng phương pháp
định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang’’.
Mục tiêu của đề tài: Xây dựng phương pháp và định lượng tanin tổng
trong một số mẫu cao chiết từ thực vật bằng phương pháp đo quang phổ.
Nội dung nghiên cứu:
- Xây dựng phương pháp định lượng tanin tổng trong thực vật bằng
phương pháp đo quang phổ. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới
hạn định lượng (LOQ) của phương pháp.
- Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng tanin tổng
trong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng.

SV: Phạm Thị Hoa 1 MSV: 1141120183

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ TANIN
1.1.1 Khái niệm, tính chất [1]
* Khái niệm:
Tanin được định nghĩa là ‘‘những hợp chất polyphenol có trong thực
vật, có vị chát được phát hiện dương tính với thí nghiệm thuộc da’’ và được
định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn. Cơ chế thuộc da
được giải thích do tanin có nhiều nhóm OH phenol, tạo nhiều dây nối hydro
với các mạch polypeptid của protein. Nếu phân tử tanin càng lớn thì sự kết
hợp với protein càng chặt. Khối lượng phân tử dao động từ 5000 - 20000 đvc.
NH
C O H O
Hình 1.1: Liên kết hidro giữa tanin với protein
* Tính chất:
Tanin thường là những chất rất phân cực, dễ tan trong dung môi phân
cực như cồn, aceton, methanol, propylene glycon, glycerin etylacetat …
không tan trong các dung môi kém phân cực như: hexan, benzen, dầu hỏa …
1.1.2 Phân loại
Dựa vào cấu trúc hóa học có thể chia tanin làm 2 loại chính: tanin thủy
phân và tanin ngưng tụ.
1.1.2.1 Tanin thủy phân [1]
Tanin thủy phân được còn được gọi là tanin pyrogallic. Loại này có
những đặc điểm sau: Khi thủy phân bằng axit hoặc bằng enzym tanase thì giải
phóng ra phần đường và phần không đường. Phần đường thường là glucose,

đôi khi gặp đường đặc biệt ví dụ đường hamamelose. Phần không phải đường
là các axit. Axit hay gặp là axit gallic. Các axit gallic nối với nhau theo dây
nối depsid để tạo thành axit m-digallic, m-trigallic v.v... Phần đường và phần
không phải đường nối với nhau theo dây nối este (không phải dây nối acetal)
nên người ta coi tanin loại này là những pseudo - glycosid. COOH
O O
HO
OH
HO
O OH
OH
HO
HO
OH
OH
Axit gallic
O
HO
Axit m - digallic
OH
OH
O
O
O OH
O
OH OH
OH OH
Axit m - trigallic
Hình 1.2: Cấu tạo của axit gallic, axit m - digallic và axit m - trigallic
Tính chất đặc trưng của tanin loại này là:
+ Khi cất khô ở 180 - 200°C sẽ thu được pyrogallol là chủ yếu.
+ Khi đun nóng với HCl sẽ cho axit gallic hoặc axit ellargic.
+ Cho kết tủa bông với chì axetat 10 %.

+ Cho kết tủa màu xanh đen với muối sắt (III).
+ Thường dễ tan trong nước.
* Ví dụ về cấu trúc của các tanin thủy phân, được phân lập trong thực
vật:
Năm 2005, Masturah Markom và các cộng sự đã nghiên cứu phân lập
được 3 loại của tanin thủy phân: axit gallic, axit ellagic, corilagin trong cây
Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria) [17].
O
HO O
HO OH
O OH
O
axit ellagic
OH
OH
O O
O
OH
O
HO
HO OH
O
O
O
HO
OH
HO OH
OH
corilagin

Hình 1.3: Cấu tạo của axit ellagic và corilagin
1.1.2.2 Tanin ngưng tụ [1]
Tanin ngưng tụ hay còn được gọi là tanin không thuỷ phân được, tanin
pyrocatechic hay phlobatanin. Các chất thuộc nhóm này là những
polyflavonoid thường được tạo thành do sự ngưng tụ từ các đơn vị flavan -3-
ol hoặc flavan-3,4- diol.
Tanin nhóm này có những đặc điểm sau:
- Dưới tác dụng của axit hoặc enzym dễ tạo thành chất đỏ tanin hay
phlobaphen. Phlobaphen rất ít tan trong nước là sản phẩm của sự trùng hiệp
hoá kèm theo oxy hoá, do đó tanin nhóm này còn được gọi là phlobatanin.
Phlobaphen là đặc trưng của một số dược liệu như vỏ Canh ki na, vỏ Quế.
- Khi cất khô thu được pyrocatechin là chính.
- Cho kết tủa màu xanh lá đậm với muối sắt (III).
- Cho kết tủa bông với nước brom.
- Khó tan trong nước hơn tanin pyrogallic.
Tanin ngưng tụ hay gặp trong các chi Acacia, Camellia, Cinchona,
Cinnamomum, Rheum, Salix ...
HO O
OH
OH
flavan - 3 - ol
OH
OH OH
OH
HO O
OH
OH OH
flavan - 3,4 - diol
Hình 1.4: Cấu tạo của các flavanol
* Ví dụ về cấu trúc của các tanin ngưng tụ, được phân lập trong thực
vật:

Năm 2000, Kang. J. H và các cộng sự đã nghiên cứu phân lập EGCG
(epigallocatechin gallate) có trong trà xanh (Camellia sinensis), ban đầu loại
bỏ caffein bằng chloroform. Sau đó sử dụng hai cột sắc ký lỏng áp suất cao
(HPLC) chuẩn bị rửa giải bằng hệ dung môi (axit axetic: acetonitril: nước) để
thu được EGCG với độ tinh khiết hơn 98%. [24]
OH
OH
HO O
OH
O
OH OH
O
OH
OH
Hình 1.5: Cấu tạo của epigallocatechin gallate
Năm 2001, Xueli Cao và các cộng sự đã nghiên cứu phân lập được hai
chất: GCG (Gallocatechin gallate), ECG (Epicatechin gallate) từ trà xanh
(Camellia sinensis) bằng cách sử dụng sắc ký phân bố ngược dòng với hai
hỗn hợp dung môi (ethyl acetate: ethanol: nước; hexane: ethyl acetate: nước).
[25]

OH
OH
HO O
O
OH OH
O
Hình 1.6: Cấu tạo của epicatechin gallate
OH
OH
HO O
OH
O
OH OH
O
OH
OH
Hình 1.7: Cấu tạo của gallocatechin gallate
1.1.2 Hoạt tính sinh học của tanin
Theo các nghiên cứu khoa học của nước ngoài thì tanin là hợp chất có
nhiều hoạt tính sinh học.
1.1.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn
Các hoạt tính kháng khuẩn của tanin đã được công nhận từ trước đây và
độc tính của tanin đối với vi khuẩn, nấm và nấm men đã được nhà khoa học
Scalbert nghiên cứu [6]. Các cơ chế được đề xuất cho đến nay để giải thích

hoạt tính kháng khuẩn của tanin bao gồm ức chế các enzym của vi khuẩn
ngoại bào, tác động trực tiếp lên quá trình chuyển hóa của vi khuẩn thông qua
sự ức chế quá trình photphoryl oxy hóa, sự khử ion kim loại gây ra sự thay
đổi hình thái của tế bào và tăng tính thấm của màng [7]. Các bằng chứng đã
chỉ ra rằng màng tế bào vi sinh vật là nơi chủ yếu tác động ức chế của tanin
[8]. Do tính kết tủa với protein là một tính chất phổ biến cho tất cả các tanin,
cho nên hoạt tính kháng vi khuẩn của các loài vi sinh vật có liên quan chặt
chẽ đến thành phần hóa học và cấu trúc của tanin.
1.1.2.2 Hoạt tính kháng vi-rút
Tanin đã được các nhà nghiên cứu chứng minh có hoạt tính đáng kể
chống lại một số loại vi- rút, như vi- rút gây suy giảm miễn dịch ở người
(HIV), vi- rút adeno và norovirus [9]. Vào năm 1991, tác giả G.T. Tan và các
cộng sự đã chứng minh tanin gây tác dụng ức chế HIV-1 bằng cách sao chép
ngược vi- rút [10]. Đến năm 2011, S. Ciesek và các cộng sự cũng đã chứng
minh epigallocatechin trong trà xanh ức chế được sự xâm nhập của vi- rút
viêm gan C [11]. Tanin có nhiều hoạt tính kháng vi- rút khác nhau tùy thuộc
vào thành phần và cấu trúc hóa học.
1.1.2.3 Hoạt tính chống viêm
Tanin có các hoạt tính chống viêm khác nhau. Các nghiên cứu in vitro
của tác giả X. Terra và các cộng sự năm 2007, đã chỉ ra rằng tanin từ hạt nho
làm giảm bệnh viêm thấp khớp [12]. Đến năm 2014, M. Park và các cộng sự
chứng minh tanin ngưng tụ chiết xuất từ hạt mâm xôi đen có khả năng chống
viêm, ức chế tế bào RAW 264.7 do lipopolysacarit gây ra trong quá trình sản
xuất NO một chất trung gian gây viêm [13].
1.1.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa
Các hợp chất phenolic đã được các nhà khoa học nghiên cứu là chất
chống oxy hóa hiệu quả [14]. Tanin với hầu hết là các nhóm hydroxyl sẽ dễ bị
oxy hóa nhất, do đó chúng sẽ có hoạt tính chống oxy hóa lớn nhất [15]. Hoạt

tính chống oxy hóa của tanin được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế để
ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, bệnh ung thư, bệnh loãng xương [16].
1.1.3 Một số phương pháp định lượng tanin
Có nhiều nhà khoa học trên thế giới tiến hành nghiên cứu để xác định
hàm lượng tanin trong nhiều đối tượng thực vật khác nhau. Sử dụng một số
phương pháp như: chuẩn độ, đo quang, sắc ký lỏng hiệu năng cao…
1.1.3.1 Phương pháp chuẩn độ [23]
Theo phương pháp của AOAC (1980), để định lượng tanin, phương
pháp được thực hiện như sau: Lấy 5 ml dịch chiết được hòa tan với 12,5 ml
dung dịch indigo-carmin và 375 ml nước. Hỗn hợp được chuẩn độ với dung
dịch KMnO4 làm dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu vàng với màu
hồng nhạt ở viền. Thể tích của dung dịch KMnO4 là tổng thể tích hàm lượng
tanin bao gồm cả các thành phần khác (Y). Để xác định thành phần khác
không phải tanin (X), lấy 50ml dung dịch chiết với 25 ml dung dịch gellatin.
Hỗn hợp được làm ấm cho đến khi gellatin được hòa tan hoàn toàn sau đó
được làm lạnh và định mức đến vạch với dung dịch muối bão hòa, thêm 50 ml
dung dịch axit và NaCl bão hòa và 5 g bột cao lanh. Hỗn hợp được lắc 15
phút và lọc qua màng lọc whatman 1. Lấy 12,5 ml dịch lọc trộn với 12,5 ml
thể tích dung dịch indigo carmin và 375 ml nước. Chuẩn độ với dung dịch
KMnO4 cho tới khi chuyển thành dung dịch màu hồng nhạt như trước. Thể
tích của dung dịch KMnO4 thực được sử dụng để chuẩn độ tanin được tính
theo giá trị của Y và X:
1mL dung dịch chuẩn KMnO4 = 0,595 ml dung dịch axit oxalic 0,1N
1mL dung dịch axit oxalic 0,1N = 0,0042 g tanin.
Năm 2015, tác giả Jyotismita Khasnabis và các cộng sự đã tiến hành
xác định hàm lượng tanin trong các loại trà khác nhau bằng phương pháp
chuẩn độ. Mẫu trà được chiết trong nước ở nhiệt độ 70oC trong 5 phút. Dịch
chiết được lọc qua màng Whatman.1 và được ly tâm với tốc độ 10000
vòng/15 phút. Dịch lọc được lưu trữ ở 4oC để định lượng bằng phương pháp

chuẩn độ với dung dịch KMnO4 với chất chỉ thị indigo-cacmin. Hàm lượng
tanin trong các loại trà được xác định: mẫu trà đen có hàm lượng tanin là
13,36%, trà xanh có hàm lượng tanin là 2,65%, trà ô long có hàm lượng
8,66%. [18]
Năm 2009, Maria Atanassova và Valentina Christova-Bagdassarian đã
tiến hành xác định hàm lượng tanin trong các loại thực vật khác nhau bằng
phương pháp chuẩn độ. Các loại mẫu được chiết trong nước cất khử ion trong
thời gian 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tiến hành lọc dịch chiết, dịch lọc thu
được chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 với chất chỉ thị indigo-cacmin. Hàm
lượng tanin của các loại thực vật lần lượt là: táo (0,58%), cherry ngọt
(1,25%), quả mộc qua (0,67%), hồ tiêu đỏ (0,69%). [26]
1.1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [3]
Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, có 4 phương pháp định
lượng thường dùng:
Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó
cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau
đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc
chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu
thử.
Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những
lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội. Từ những dữ kiện về: diện tích
(hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu
thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong
mẫu thử một cách chính xác.
Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của
các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến
hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu 9

thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng
của diện tích hoặc chiều cao pic.
Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất
trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic
của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
Tác giả Trupti P. Durgawale và các cộng sự đã sử dụng phương pháp
HPLC để xác định hàm lượng tanin trong loài cây họ Đậu vào năm 2016.
Công trình nghiên cứu sử dụng cột sắc kí C18, hỗn hợp methanol và nước
theo tỉ lệ thể tích 50:50 làm dung môi pha động với pH = 4,5, tốc độ pha động
là 1,0 ml/phút tại bước sóng 270 nm. Tổng thời gian chạy là 12 phút. Kết quả
thu được thời gian lưu là 3,1 phút. Phương pháp này đã được xác nhận và
tuyến tính của axit tannic trong phạm vi nồng độ 0-60 mg/ml. [19]
Tác giả Tushar Dhanani và các cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC
- PDA để xác định hàm lượng của 5 loại tanin thủy phân: axit gallic (GA),
axit corilagin (CL), axit chebulagic (CB), axit ellagic (EA) và axit chebulinic
(CN) trong vỏ quả cây chiêu liêu vào năm 2014. Công trình sử dụng cột sắc
ký C18, hỗn hợp dung môi ACN (acetonitril) và TFA (0,05%) trong nước, tốc
độ pha động là 1,0 ml/phút tại bước sóng 270 nm. Kết quả thu được thời gian
lưu của 5 loại tanin thủy phân lần lượt là: GA (2,91 phút), CL (12,09 phút),
CB (16,12 phút), EA (17,66 phút), CN (18,59 phút). LOD (giới hạn phát hiện)
của GA, CL, CB, EA và CN lần lượt là 1,0; 0,5; 1,0; 0,5 và 1,0 µg/ml. LOQ
(giới hạn định lượng) của GA, CL, CB, EA và CN lần lượt là 2,5; 1,0; 2,5; 1,0
and 2,5 µg/ml. [22]
1.1.3.3 Phương pháp đo quang
Tác giả Philip-Edouard Shay và các cộng sự sử dụng phương pháp đo
độ hấp thụ quang với thuốc thử butanol - HCl - sắt để xác định hàm lượng
tanin ngưng tụ trong các loài thực vật năm 2017. Mẫu khô được chiết bằng
dung môi methanol (300mL) và được axit hóa bằng axit trifluoroacetic (TFA)
0,05%. Các bước được tóm tắt như sau: 500 µl dịch mẫu chứa tanin ngưng tụ

cho tác dụng với 2000µl dung dịch thuốc thử butanol - HCl cho thêm 67mL
thuốc thử sắt (NH4Fe(SO4)2 2% trong HCl 2N) và để ủ trong khoảng thời gian
2,5h ở nhiệt độ 70°C. Màu của phản ứng được phát hiện trên máy quang phổ
ở bước sóng 550 nm. Hàm lượng tanin ngưng tụ được định lượng dựa trên độ
hấp thụ quang thu được của mẫu thí nghiệm đối chiếu với đường chuẩn
proanthocyanidin. [20]
Tác giả Oi-Wah Lau, Shiu-Fai Luk and Hsiao-Lan Huang đã tiến hành
xác định tanin mẫu chè vào năm 1989. Mẫu được chiết trong nước ở nhiệt độ
80oC, mẫu được lọc. Tanin trong mẫu, khử ion sắt (III) thành ion sắt (II) ở
nhiệt độ 80o
C trong 20 phút. Sau đó ion sắt (II) phản ứng với thuốc thử 1,10 -
phenanthrolin ở pH 4,4 tạo thành một phức màu. Đo độ hấp thụ quang của
dung dịch tại bước sóng 540 nm và xây dựng đường chuẩn trong khoảng 0-
5,5 µg/mL của axit tanic với độ dốc 0,213 A/ppm. Hàm lượng tanin trong chè
xác định được là 9,45%. [21]
1.2 CÁC THỰC VẬT CHỨA NHIỀU TANIN
Tanin là nhóm các hợp chất phân bố phổ biến trong thực vật bậc cao ở
những cây hai lá mầm, các họ thực vật hay gặp giàu tanin:
+ Rau răm (polygonaceae)
+ Đậu (Fabaceae)
+ Hoa hồng (Rosaceae)
+ Sim (Myrtaceae)
+ Cà phê (Rutaceae)
Tanin có mặt ở nhiều bộ phận của cây: rễ, thân rễ (Đại hoàng), vỏ
(Chiêu liêu), lá (Cây ổi), hoa (Hoa hồng), hạt (Cau), vỏ quả (Măng cụt) …
Một số cây chứa tanin quan trọng khác như: cây Sồi (Quercus sp.); cây Phong
(Betula sp.); cây Liễu (Salix carpea); cây Thông (Pinus sp.). Hàm lượng tanin
trong một số loài dược liệu thường khá cao chiếm từ 6 - 35 %, đặc biệt trong
Ngũ bội tử có thể lên đến 50 - 70 % chúng được ứng dụng nhiều trong lĩnh
vực y học và trong ngành công nghiệp thực phẩm.

Bảng 1.1: Hàm lượng tanin trong một số loài thưc vật [5]
Một số loài thực vật Hàm lượng tanin (%)
Vỏ quả (cây măng 7-13
cụt)
Lá (cây ổi) 7-10
Vỏ quả (lựu) 20-30
Vỏ quả (cây chiêu 20-40
liêu)
Ngũ bội tử 43,2
Lá (trà hoa vàng) 15-30
Hình 1.8: Một số loài thực vật chứa nhiều tanin

1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV - VIS ĐỊNH LƯỢNG TANIN
1.3.1 Phương pháp phân tích đo quang [2]
Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang học
dựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát
hoặc sự hấp thụ các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó.
1.3.1.1 Nguyên tắc của phép đo phổ UV - VIS
Phổ hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS (190 - 800 nm) là phổ hấp
thụ của các chất tan ở trạng thái dung dịch đồng thể của chất trong một dung
môi nhất định như nước, methanol, benzen, toluen, chloroform, hay một số
chất mà phân tử của nó trong điều kiện bình thường nó tồn tại ở trạng thái hơi
như khí CH4, NH3, CO2. Vì thế muốn thực hiện được phép đo phổ này chúng
ta phải thực hiện các công việc sau đây:
Chuẩn bị dung dịch mẫu:
Nếu các chất phân tích có hấp thụ quang UV-VIS: Trường hợp này ta
phải hòa tan nó vào trong một dung môi phù hợp, tạo ra dung dịch trong và
đồng thể, như một số chất hữu cơ: Benzen, phenol, nitrophenol, naphthalen,
anthracene. Các chất vô cơ như I2, các muối K2CrO4, K2Cr2O7 và KMnO4.
Những chất không có phổ hấp thụ quang UV-VIS: Trường hợp này chủ
yếu là các ion kim loại, hay các anion, chúng ta phải cho các chất này tác
dụng với một thuốc thử R nào đó trong một dung môi và ở điều kiện thích
hợp để tạo ra một hợp chất phức bền có khả năng hấp thụ quang UV-VIS
nhạy, sau đó đo phổ của dung dịch phức thu được.
Nếu mẫu phân tích là chất khí: Chúng ta phải chứa mẫu vào trong một
ống cuvet đóng kín để đặt vào buồng đo phổ. Hay bơm dòng khí mẫu qua
cuvet trong khi đo với một tốc độ hằng định (phương pháp đo dòng chảy).
Đo phổ:
Cho mẫu vào cuvet và chiếu chùm sáng kích thích phù hợp vào cuvet
có dung dịch mẫu của hợp chất cần phân tích, để cho các phân tử chất phân

tích hay sản phẩm phức của nó hấp thụ tia bức xạ , để tạo ra phổ hấp thụ
quang UV-VIS của nó. Vì thế chất phân tích (mẫu phân tích) cần được đựng
vào ống đo hay cuvet có bề dày nhất định (L = 0,5 đến 2 cm).
Ghi đo phổ:
Thu chùm sáng đi qua cuvet, phân ly phổ đó và chọn một tia sáng ở vị
trí hấp thụ cực đại của băng phổ của chất phân tích và đo cường độ hấp thụ
quang A ở max của chất đó trong các điều kiện đã chọn, hay quét (Scan) để ghi
cả một vùng phổ mong muốn.
Hiện thị phồ, kết quả đo:
Ghi giá trị độ hấp thụ quang A . Việc này có thể được thực hiện bằng
nhiều công cụ khác nhau, như đồng hồ đo năng lượng hấp thụ, máy tự ghi để
ghi độ hấp thụ A dưới dạng các pic hấp thụ, hay hiện kết quả đo A , bằng máy
hiện số (digital), hay ghi vào đĩa của máy tính, sau đó xử lý tiếp bằng các
chương trình theo yêu cầu cần kết quả đo ở dạng nào (độ hấp thụ quang A, độ
truyền qua T, nồng độ Cx chất phân tích).
1.3.1.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy đo quang phổ
a) Cấu tạo:
Máy đo quang phổ phân tử từ đơn giản đến hiện đại đều cần có các bộ
phận cơ bản chính sau đây:
+ Nguồn cung cấp chùm tia sáng vùng UV-VIS, hay chỉ UV hoặc VIS;
+ Buồng đặt cuvet và cuvet chứa mẫu để đo phổ;
+ Bộ đơn sắc (hệ quang) để thu phổ, phân ly và chọn tia sáng X cần đo;
+ Detector và modul điện tử;
+ Máy trang bị ghi nhận và chỉ thị kết quả đo phổ.
Ngoài ra, máy đo phổ còn được trang bị thêm các thiết bị như:
+ Bộ lấy mẫu tự động;
+ Hệ máy tính và phần mềm (hệ UV- VIS) hoàn chỉnh;

+ Các chương trình thuật toán.

Nguồn sáng:
Trong các máy đo phổ hấp thụ quang phân tử UV-VIS (phép đo quang
hấp thụ) người ta thường dùng loại đèn nguồn là D2-Lamp (đèn hồ quang
hydro), W-Lamp (đèn sợi điểm Wolfram).
Bộ phận tạo tia sáng đơn sắc:
Để tạo được tia sáng đơn sắc (hay chính xác là vùng sáng có vùng phổ
hẹp) trong máy đo quang người ta thường dùng lăng kính, cách tử hay kính
lọc sáng.
Cuvet:
Cuvet là dụng cụ chứa dung dịch phân tích hoặc dung môi. Trong thực
tế ta thường gặp cuvet hình trụ đáy vuông. Có các chất liệu hay sử dụng là
cuvet nhựa, thủy tinh hoặc thạch anh. Khi đo ở vùng phổ khả kiến nên chọn
cuvet nhựa hay thủy tinh, nhưng khi đo ở vùng phổ tử ngoại thì nhất thiết phải
dùng cuvet thạch anh vì thủy tinh hấp thụ tia tử ngoại. Không sử dụng cuvet
nhựa khi đo với dung môi hữu cơ. Khi làm việc với các dung môi bay hơi
phải đậy nắp cuvet.
Tế bào nhân quang điện:
Tế bào quang điện là bộ phận biến quang năng thành điện năng rồi
chuyển vào bộ phận ghi đo.
Detector:
Detector là bộ phận thu nhận chùm sáng và chuyển chúng thành tín
hiệu điện để đo cường độ chùm sáng đó. Các tín hiệu ghi, đo được xử lý và
cho ra kết quả giá trị độ hấp thụ quang tương ứng của dung dịch. Ngày nay
hầu hết các máy đo quang loại tốt đều có bộ phận ghi đo được kết nối với máy
tính.
b) Nguyên lý hoạt động:
Các đèn phát ra nguồn sáng chiếu vào hệ thống thấu kính (hệ gương hội
tụ) tạo ra chùm sáng trắng đi qua khe hẹp vào bộ phận tán sắc. Khi chùm sáng

trắng chiếu vào lăng kính ngay lập tức nó bị tán sắc thành các tia sáng đơn sắc
chiếu về mọi phía. Tia sáng phản xạ qua các thấu kính gương phẳng ra khỏi
buồng tán sắc đến bộ phận phân chia chùm sáng, bộ phận này sẽ hướng chùm
sáng đến các cuvet đựng mẫu nghiên cứu. Detector sẽ tiếp nhận và phân tích
các chùm sáng qua cuvet, chuyển tín hiệu ánh sáng thành tín hiệu điện và cho
hiện lên máy tính kết quả đo.
Hình 1.9: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của máy đo quang phổ
1.3.1.3 Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis
Phương pháp đo quang UV-Vis đã và đang được ứng dụng rất phổ
biến. Vì nó là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và máy móc lại không đắt
tiền, phù hợp cho việc phân tích định lượng nhiều chất với hàm lượng nhỏ, ví
dụ như:
- Để xác định các chất:
+ Phân tích các chất hữu cơ;
+ Phân tích thuốc, dược phẩm, sản phẩm nông nghiệp;
+ Phân tích các ion kim loại trong các đối tượng mẫu khác nhau.
- Xác định thành phần phức chất, độ phân ly, hằng số phân ly.
- Xác định hằng số bền của phức chất.

- Xác định nhóm chức trong phân tử chất.
Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis là: Trong y học, dược,
trong nông nghiệp, thực phẩm, phân tích nước, phân tích môi trường, công
nghiệp hóa học. Song phương pháp đo phổ UV-Vis có độ chọn lọc kém. Vì
một thuốc thử có thể tác dụng được với nhiều ion kim loại cùng cho phức
màu có cực đại hấp thụ trùng nhau, hay gần nhau.
1.3.1.4 Phương pháp định lượng
Trong phương pháp đo quang phổ, phương pháp thường dùng để định
lượng là: phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn
a) Phương pháp đường chuẩn:
* Cơ sở định lượng của phương pháp:
Dựa vào phương trình định luật Lambert - Beer:
A = .L.C
Trong đó: A là độ hấp thụ quang của dung dịch cần đo, là hệ số hấp thụ phân
tử, C là nồng độ chất, L là bề dày của lớp dung dịch (bề dày của cuvet).
* Cách tiến hành:
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn và các mẫu phân tích: Chuẩn bị một
dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác (thông thường chuẩn bị với 5 nồng
độ khác nhau nằm trong vùng tuyến tính của mối quan hệ A - Cx) cùng trong
điều kiện với mẫu phân tích, như chất nền, môi trường pH,...
- Chọn các điều kiện đo phổ: Nghiên cứu chọn điều kiện phù hợp nhất
để đo phổ UV-VIS của chất phân tích trong dãy dung dịch chuẩn và mẫu phân
tích, như các thông số máy đo Ax, điều kiện đo, thời gian đo, loại cuvet ...
- Đo phổ các mẫu chuẩn và mẫu phân tích: Đo phổ hấp thụ quang UV-
VIS của dãy dung dịch chuẩn và mẫu phân tích theo các điều kiện đã chọn.
- Dựng đường chuẩn và xác định nồng độ Cx: Từ các cặp giá trị A - C
tương ứng của các dung dịch chuẩn, ta dựng đường chuẩn trong hệ tọa độ A -
C, hàm Ax, = f(C).

A
Ax
O
Cx C
Hình 1.10: Dạng đồ thị của phương pháp đường chuẩn
Dựa vào phương trình đường chuẩn: y = ax + b, ta tính được nồng độ của các
mẫu phân tích
Trong đó: x, y lần lượt là nồng độ (Cx) và độ hấp thụ quang (A)
Cx =
A−
a
b
b) Phương pháp thêm chuẩn:
* Nguyên tắc:
Dùng ngay một mẫu phân tích đại diện (ví dụ mẫu Cx trong dãy mẫu
phân tích) làm chất nền để pha chế một dãy mẫu chuẩn
* Cách tiến hành:
Lấy một lượng nhất định mẫu phân tích (theo khối lượng hay theo thể
tích) và thêm vào đó những lượng nồng độ của chất phân tích C chính xác
theo cấp số cộng. Như vậy, nếu mẫu phân tích có nồng độ là Cx thì chúng ta
sẽ có dãy mẫu chuẩn là C0, C1, C2, C3, C4, C5 như bảng sau:

Bảng 1.2: Dãy dung dịch chuẩn của phương pháp thêm chuẩn
STT Dãy mẫu chuẩn Độ hấp thụ Aλ đo được
Dãy chuẩn
M0 C0= CX+ 0 A0
M1 C1= CX+ C1 A1
M2 C2= CX+ C2 A2
M3 C3= CX+ C3 A3
M4 C4= CX+ C4 A4
M5 C5= CX+ C5 A5
Các mẫu phân tích CX2 AX2
CX3 AX3
CX4 AX4
.... ....
CXn AXn
Đo các giá trị độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn vừa pha ở
bước sóng cực đại được các giá trị độ hấp thụ quang A tương ứng. Vẽ đồ thị
đường chuẩn theo dãy mẫu chuẩn mới lập, sau đó xác định nồng độ Cx theo 2
cách:
Cách 1: Kéo dài đường chuẩn về phía trái, cắt trục hoành tại đâu đó
chính là giá trị Cx cần tìm.
Cách 2: Từ gốc tọa độ kẻ đường thẳng song song với đường chuẩn, từ
điểm A0 kẻ đường thẳng song song với trục hoành cắt đường thẳng mới dựng
tại N, từ N kẻ vuông góc và cắt trục hoành tại điểm có giá trị chính là Cx cần
tìm.

A
A0
Cx O C1 Cx C2 C3 C4 C (mg/ml)
Hình 1.11: Đồ thị đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn
1.3.2 Định lượng tổng hàm lượng tanin ngưng tụ trong thực vật bằng
phương pháp đo quang
* Nguyên tắc:
Cho các hợp chất tanin trong mẫu cao chiết thực vật tác dụng với hỗn
hợp hai thuốc thử: thuốc thử butanol - HCl và thuốc thử sắt (NH4Fe(SO4)2)
trong dung dịch axit sẽ thu được dung dịch có màu đỏ. Đo màu của dung dịch
ở bước sóng 550 nm.
Sơ đồ phản ứng:
Tanin ngưng tụ + HCl đặc Dung dịch có màu đỏ
Butanol

HO O
+
Ar
OH Ar
OH
OH
H
+
, - R
R butanol,100o Anthocyanidin (màu đỏ)
HO Ar
O Ar
HO
OH
OH
R'
R’
Hình 1.12: Nguyên lý phản ứng giữa tanin ngưng tụ với thuốc thử
1.4 GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH [4]
1.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD)
- Định nghĩa:
Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn
độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất
phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được
(đối với phương pháp định lượng).
- Cách xác định:
Có nhiều cách xác định LOD khác nhau tùy thuộc vào phương pháp áp
dụng là phương pháp công cụ hay không công cụ. Các cách tiếp cận có thể
chấp nhận được bao gồm:
+ Dựa trên độ lệch chuẩn:

Cách 1: Làm trên mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần như mẫu thử
nhưng không có chất phân tích). Phân tích mẫu 10 lần song song, tính độ lệch
chuẩn. Độ lệch chuẩn này phải khác 0.
Tính LOD: LOD = x0 + SD0
SD0 = √∑(x
0 i
−x
0
)2
n−1
Trong đó:
x0 : trung bình của mẫu trắng SD0:
độ lệch chuẩn của mẫu trắng
Cách 2: Làm trên mẫu thử: Làm 10 lần song song. Nên chọn mẫu thử
có nồng độ thấp (ví dụ, trong khoảng 5 đến 7 lần LOD ước lượng).
Tính LOD: Tính giá trị trung bình x, và độ lệch chuẩn SD
LOD = 3 x SD
SD = √∑(xi−x)2
n−1
Đánh giá LOD đã tính được: tính R = x / LOD
• Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính
được là đáng tin cậy
• Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít
chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R
• Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng
dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
+ Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N):
Cách này chỉ áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công
cụ có nhiễu đường nền. Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các
phương pháp sắc ký, điện di.
Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ
thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại

khác 4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise
ratio),
trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích
N là nhiễu đường nền
+ Dựa trên đường chuẩn:
Chỉ áp dụng được cho các phương pháp có xây dựng đường chuẩn.
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn
của tín hiệu đo.
LOD =3,3×SD
a
Trong đó:
SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu
a: Độ dốc của đường chuẩn
Giá trị a có thể dễ dàng tính được từ đường chuẩn, giá trị SD có thể
được tính theo nhiều cách khác nhau, bao gồm:
- Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng: Phân tích mẫu trắng lặp lại 10
lần và tính SD tương ứng;
- Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD,
lặp lại 10 lần (xem phần kiểm tra ở phía trên) và tính SD;
- Dựa trên hệ số chặn của đường chuẩn, làm nhiều lần để tính SD của
giá trị b (intercept);
- Dựa trên độ lệch chuẩn của khoảng cách các giá trị đo thực với đường
chuẩn.
1.4.2 Giới hạn định lượng (LOQ)
- Định nghĩa:
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể
định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong
muốn. LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng. Giống như LOD,

có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp
cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp.
- Cách xác định:
Việc bố trí thí nghiệm để xác định LOQ thường kết hợp với tính LOD.
Có nhiều cách khác nhau để tính LOQ như sau:
+ Dựa trên độ lệch chuẩn: Có hai trường hợp như trong phần tính LOD
là thực hiện trên mẫu trắng và thực hiện trên mẫu thử.
Các công thức tính toán như sau:
Tính trên mẫu trắng: LOQ = x 0+SD0
Tính trên mẫu thử: LOQ = 10.SD
+ Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu:
Cách này chỉ áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công
cụ có nhiễu đường nền. Cách tính toán hoàn toàn tương tự như trong phần
tính LOD. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20
lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N = 10.
+ Dựa trên đường chuẩn: Cách tính tương tự như trong phần LOD
nhưng theo công thức sau:
LOQ =10×SD
a

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1 Hóa chất
* Chất chuẩn:
Proanthocyanidin A2, độ sạch 97,5%, được phân lập từ vỏ măng cụt tại
Phòng Nghiên cứu và ứng dụng Hóa sinh, trung tâm Nghiên cứu và Chuyển
giao Công nghệ, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
* Dung môi:
Methanol
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Nước cất
n - butanol
Ethanol 90 %
* Các hóa chất khác:
Axit clohidric (HCl) đậm đặc - 37 %
Amoni sắt (III) sunfat tinh thể - NH4Fe(SO4)2.12H2O
Các hóa chất, dung môi trên đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
2.1.2 Dụng cụ - thiết bị
* Thiết bị:
Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS _EMCLAB, Đức
Cuvet thủy tinh
Cân phân tích Sartorius, Đức (độ chính xác 0,0001 g)
Bể siêu âm
Bể điều nhiệt DH WB000106 Haihan
Máy cô quay chân không Buchi, R-300, Thụy Sĩ

Hình 2.13: Hệ thống máy đo quang UV - Vis
Hình 2.14: Hệ thống máy cô quay chân không

* Dụng cụ:
Micropipet: 100 - 1000 l ; 20 - 200 l
Ống đong: 100 ml
Ống nghiệm chịu nhiệt
Bình đựng thuốc thử
Eppendroff: 1,5 ml
Pipet: 5 ml
Qủa bóp cao su
Bình định mức 100 ml
Phễu chiết
* Pha thuốc thử:
Thuốc thử BuOH - HCl (tỷ lệ 95: 5): Lấy chính xác 190 ml n - butanol,
sau đó thêm vào 10 ml axit clohidric đặc (37%).
Thuốc thử sắt (NH4Fe(SO4)2 2% / HCl 2N):
Pha HCl 2N: Lấy 16,6 ml axit clohidric đặc, nồng độ 37%,
thêm nước cất định mức đến 100 ml.
Hòa tan 2,0 g NH4Fe(SO4)2.12H2O - trong thể tích 100 ml
HCl 2N vừa pha.
* Pha chế dung dịch:
Pha dung dịch chuẩn gốc proanthocyanidin A2 : Cân 4 mg bột chất
chuẩn proanthocyanidin A2 vào ống eppendroff rồi pha trong DMSO
(dimethyl sulfoxide) 800 l thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 5
mg/ml.
Pha dung dịch chuẩn proanthocyanidin A2: Pha loãng 180 l dung dịch
chuẩn gốc trong vừa đủ 1620 l MeOH thu được dung dịch chuẩn có nồng độ
500 g/ml.

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các mẫu Trà hoa vàng sử dụng trong nghiên cứu được xác định tên khoa học
(Camellia chrysantha), là các mẫu được mua trên thị trường.
Quy trình chiết mẫu:
Mẫu trà hoa vàng (phần lá)
Rửa sạch, thái nhỏ, sấy
khô mẫu ở to
= 60o
C
Nghiền nguyên liệu thành
dạng bột
+ Ngâm với EtOH 90% theo tỷ lệ 1/20
+ Siêu âm (t = 15 phút)
Lọc
Thu lấy bã, loại bỏ dịch lọc
Sấy bã nguyên liệu ở to = 60oC
Chiết bã với dung môi
MeOH theo tỷ lệ 1/20, t =
90 phút
Loại bỏ bã, thu lấy dịch chiết
Dịch chiết tanin
Thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không
Cao MeOH (trà hoa vàng)
Hình 2.15: Sơ đồ quy trình chiết mẫu lá trà hoa vàng

2.3 CHUẨN BỊ DÃY DUNG DỊCH CHUẨN
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm 9 nồng độ là 0, 20, 60, 100, 150,
200, 300, 400,500 µg/ml.
Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn 500
g/ml: Hút chính xác V ( l) MeOH lần lượt vào các ống nghiệm chịu nhiệt, tiếp
đó thêm vào tiếp chính xác V0 ( l) dung dịch chuẩn tương ứng với các nồng
độ C ( g/ml). Mẫu trắng được chuẩn bị song song với dãy mẫu chuẩn. Cụ thể
cách pha loãng như trong bảng sau:
Bảng 2: Bảng dãy đường chuẩn của proanthocyanidin A2
STT C0 ( g/ml) C ( g/ml) V0 ( l) VMeOH ( l) Vtổng
( l)
1 500 0 0 500 500
2 500 20 20 480 500
3 500 60 60 440 500
4 500 100 100 400 500
5 500 150 150 350 500
6 500 200 200 300 500
7 500 300 300 200 500
8 500 400 400 100 500
9 500 500 500 0 500
Trong đó:
Co : Nồng độ của dung dịch proanthocyanidin A2 chuẩn ( g/ml);
C : Nồng độ của dung dịch proanthocyanidin A2 chuẩn làm việc (
g/ml);
V0 : Thể tích dung dịch proanthocyanidin A2 gốc được pha vào ( l);
VMeOH : Thể tích methanol ( l);

V: Tổng thể tích cần pha ( l).
Thêm vào 500 l mỗi dung dịch 3000 l thuốc thử BuOH - HCl trộn đều
rồi thêm tiếp 100 l thuốc thử sắt. Trộn thật đều rồi ủ các dung dịch ở 90oC
trong thời gian 60 phút.
2.4 CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH
Năm mẫu cao chiết methanol của các mẫu Trà hoa vàng (Camellia
chrysantha) tại phòng Nghiên cứu và Ứng dụng Hóa sinh, trung tâm Nghiên
cứu và Chuyển giao công nghệ, viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam được cân chính xác khối lượng và hòa tan hoàn toàn trong methanol tới
nồng độ 1 mg/ml.
Cân 5 - 10 mg cao chiết của 5 mẫu trà hoa vàng rồi pha trong V (µl)
MeOH thu được mẫu có nồng độ 1 mg/ml. Hút chính xác 500 µl của mỗi mẫu
trên, sau đó thêm 3000 µl thuốc thử BuOH-HCl, trộn đều rồi thêm tiếp 100 µl
thuốc thử sắt. Các dung dịch cũng được ủ trong thời gian và nhiệt độ giống
như các dung dịch chuẩn.
2.5 CHUẨN BỊ MẪU KHẢO SÁT GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN
ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP.
Tiến hành đo 10 lần song song với proanthocyanidin A2 (20 g/ml). Hút
chính xác 480 µl MeOH lần lượt cho vào các ống nghiệm chịu nhiệt, rồi thêm
tiếp vào 20 µl dung dịch làm việc của proanthocyanidin A2 (500 g/ml). Thêm
3000 µl thuốc thử BuOH-HCl, trộn đều rồi thêm tiếp 100 µl thuốc thử sắt.
Dung dịch cũng được ủ trong thời gian 60 phút và ở nhiệt độ 90o
C, rồi tiến
hành đo độ hấp thụ quang của 10 mẫu.
Xác định giới hạn phát hiện LOD như sau: Tính giá trị trung bình x và
độ lệch chuẩn SD
LOD =3,3×SD
a
SD = √∑(xi−x)2
n−1

Công thức tính LOQ:
LOD =10×SD
a
SD = √∑(xi−x)2
n−1
2.6 XỬ LÝ SỐ LIỆU
Kết quả đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn được xử lý trên
phần mềm Excel. Từ các giá trị nồng độ và độ hấp thụ quang của dãy dung
dịch proanthocyanidin A2, xây dựng được đường chuẩn có dạng y = a.x+b,
trong đó: x,y lần lượt là nồng độ và độ hấp thụ quang của dung dịch
proanthocyanidin A2, a là độ dốc của đường chuẩn, b là hệ số chặn.
Dựa vào phương trình đường chuẩn và độ hấp thụ quang của các dung
dịch mẫu thử, có thể xác định hàm lượng tanin tổng tương đương
proanthocyanidin A2 trong mẫu đo theo công thức:
TC =
Ai
−b
a .C
Trong đó:
Ai là độ hấp thụ quang của mẫu thử i
a, b là hệ số độ dốc và hệ số chặn của đường chuẩn y = a.x + b
C là nồng độ mẫu thử (mg/ml)
TC: hàm lượng tanin tổng tương đương proanthocyanidin A2, mg
ProA2E /g mẫu cao chiết.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN ĐO QUANG
Dựa trên tài liệu tham khảo [27] và thực nghiệm sử dụng về thể tích
thuốc thử phản ứng, lượng chất phân tích, nhiệt độ và thời gian phản ứng, pha
loãng bằng MeOH, để lựa chọn điều kiện phản ứng tạo sản phẩm có khả năng
hấp thụ quang cao nhất. Điều kiện cụ thể như sau:
+ Chuẩn bị thuốc thử như mục 2.3.1 và dung dịch chuẩn gốc, dung dịch
chuẩn như mục 2.3.2
+ Phản ứng tạo màu định lượng tanin tổng: Lấy 500 l dung dịch mẫu,
sau đó thêm vào 3000 µl thuốc thử BuOH-HCl, trộn đều rồi thêm tiếp 100 µl
thuốc thử sắt. Tiến hành ủ ở nhiệt độ 90o
C trong thời gian 60 phút, để nguội ở
nhiệt độ phòng.
Quét phổ hấp thụ trong khoảng 400 - 800 nm với mẫu trắng là MeOH
(được làm phản ứng tương tự như mẫu thử). Phổ hấp thụ của
proanthocyanidin A2 thu được ở hình 3.1
Hình 3.16: Phổ hấp thụ của proanthocyanidin A2

Kết quả khảo sát bước sóng cho thấy phổ UV-VIS của tanin có hấp thụ
cực đại tại bước sóng λ = 550 nm, pic thu được khá cân đối. Vì vậy chọn điều
kiện đo quang xác định tanin là:
- Lượng chất phân tích: 500 µl
- Thể tích thuốc thử: 3000 µl thuốc thử BuOH - HCl, 100 µl thuốc thử
sắt.
- Nhiệt độ phản ứng: to = 90oC
- Thời gian phản ứng: t = 60 phút
- Bước sóng đo độ hấp thụ: = 550 nm
3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG
CHUẨN
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với độ hấp thụ
quang của proanthocyanidin A2 chuẩn.
Sau khi tiến hành pha một dãy các dung dịch tiêu chuẩn để xây dựng
đường chuẩn ta tiến hành đo độ hấp thụ quang ở các điều kiện đã chọn. Kết
quả được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.2:

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quy trình định lượng
STT C (µg/ml) Độ hấp thụ quang (A)
1 20 0,0949
2 60 0,1933
3 100 0,3335
4 150 0,4566
5 200 0,5561
6 300 0,7726
7 400 0,9637
8 500 1,1967
Khoảng định lượng 20 - 500 (µg/ml)
R2 0,9952
1.4
1.2
f(x) = 0 x + 0.09
(A)
1 R²=1
quang
0.8
0.6
thụ
Độ
hấp
0.4
0.2
00 100 200 300 400 500 600
Nồng độ C ( g/ml)
Hình 3.17: Đường chuẩn của proanthocyanidin A2

Mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang (A) và nồng độ của proanthocyanidin A2
(C) được thể hiện qua phương trình: y = 0,0022 x + 0,0853
Trong đó :
y là độ hấp thụ quang của dung dịch,
x là nồng độ của proanthocyanidin A2 chuẩn.
Hệ số tương quan : R2
= 0,9952.
Nhận xét:
Dựa trên đồ thị ta thấy khoảng nồng độ từ 20 - 500 g/ml có sự tuyến
tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang là đảm bảo. Đồng thời so sánh hệ số
tương quan R của đồ thị với giới hạn chấp nhận hệ số tương quan theo tài liệu
tham khảo [4], ta thấy R2
= 0,9952 ≥ 0,995 đạt yêu cầu. Vậy khoảng tuyến
tính của phương pháp nằm trong khoảng từ 20 - 500 g/ml.
3.3. KẾT QUẢ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG
(LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP
Kết quả xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp được trình bày theo bảng 3.2:

Bảng 3.4: Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới
hạn định lượng (LOQ)
STT Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ quang (A)
1 20 0,0949
2 20 0,0939
3 20 0,1011
4 20 0,0896
5 20 0,1002
6 20 0,0903
7 20 0,1015
8 20 0,1006
9 20 0,0983
10 20 0,1001
Độ lệch chuẩn (SD) 0,0043
LOD (µg/ml) 6,45
LOQ (µg/ml) 19,54
* Tính kết quả:
Độ lệch chuẩn:
SD = √∑ (xi−x)2
n−1
x =
x1 +x2 +x3 +…+xn
= 0,09705 (n = 10)
n
SD = 0,0043
Giới hạn phát hiện (LOD):

LOD = 3,3×SD = 3,3× 0,0043 = 6,45(µg/ml)
a 0,0022
Giới hạn định lượng (LOQ):
LOQ = 10× SD =10× 0,0043 = 19,54 (µg/ml)
a 0,0022
Nhận xét:
Vậy khoảng giới hạn phát hiện (LOD) của phép đo là 6,45 µg/ml và
giới hạn định lượng (LOQ) của phép đo là 19,54 µg/ml điều này phù hợp với
khoảng giá trị nồng độ mà thực nghiệm đã tiến hành.
3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG TỔNG TANIN NGƯNG TỤ TRONG MỘT SỐ MẪU
CAO CHIẾT TRÀ HOA VÀNG
Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng hàm lượng
tổng tanin ngưng tụ có trong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng. Tiến hành
chuẩn bị mẫu như mục 3.2.3 và phân tích như các mẫu chuẩn. Kết quả xác
định hàm lượng tổng tanin ngưng tụ trong trà hoa vàng được trình bày theo
bảng 3.3:
Bảng 3.5: Kết quả phân tích hàm lượng tanin tổng trong một
số mẫu cao chiết trà hoa vàng
Nồng độ của Hàm lượng tanin
Ký Nồng độ Độ hấp các mẫu đo tổng trong mẫu cao
hiệu (mg/ml) thụ (A)
từ đường chiết (mg ProA2E/g)
mẫu
chuẩn
(µg/ml)
TV1 1,00 0,3371 114,45 114,45
TV2 1,00 0,1892 47,23 47,23
TV3 1,00 0,1378 23,86 23,86
TV4 1,00 0,0975 5,55 5,55
TV5 1,00 0,2517 75,64 75,64

Nhận xét:
Từ kết quả trong bảng 3.3, ta thấy mẫu trà hoa vàng (TV1) có hàm
lượng tanin tổng cao nhất 114,45 (mg ProA2E/g) và mẫu trà hoa vàng (TV4)
có hàm lượng tanin tổng thấp nhất 5,55 (mg ProA2E/g). Hàm lượng mẫu trà
hoa vàng (TV1) cao gấp 108,9 lần so với mẫu trà hoa vàng (TV4). Điều này
phản ánh chất lượng của các mẫu không giống nhau, không đồng đều, mặc dù
các mẫu này đều là sản phẩm mua trên thị trường.

KẾT LUẬN
Qua thời gian nghiên cứu và thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp “Xây
dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật
đo quang’’, em đã thu được một số kết quả sau:
1. Xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích với
lượng proanthocyanidin A2 chuẩn nằm trong khoảng từ 20 - 500 g/ml.
2. Xây dựng đường chuẩn của proanthocyanidin A2: y = 0,0022 x +
0,0853 với R² = 0,9952.
3. Xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương
pháp phân tích:
LOD = 6,45 g/ml,
LOQ = 19,54 g/ml
4. Xác định hàm lượng tanin tổng trong 5 mẫu cao chiết trà hoa vàng.
Kết quả cho thấy hàm lượng tanin tổng trong 5 mẫu nghiên cứu nằm trong
khoảng từ 5,55 - 114,45 (mg ProA2E/g).

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]: Trần Công Luận (2016), Giáo trình Dược liệu học, Trường Đại học
Tây Đô, tr. 109 -112.
[2]: Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích phổ phân tử, Nhà xuất
bản Bách khoa Hà Nội, tr. 57 - 108.
[3]: Bộ Y tế - Vụ khoa học và đào tạo (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm,
Nhà xuất bản Y học, tr. 104 - 110.
[4]: Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010),
Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản
khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr. 32 - 39.
[5]: Viện dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, tập II, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
Tài liệu tiếng Anh
[6]: A. Scalbert, (1991), “Antimicrobial properties of tannins”,
Phytochemistry, 30, pp. 3875-3883
[7]: X.L. Liu, Y.Q. Hao, L. Jin, Z.J. Xu, T.A. McAllister, Y. Wang,
(2013), Anti-Escherichia coli O157: H7 properties of purple prairie clover and
sainfoin condensed tannins, Molecules, 18, pp. 2183-2199
[8]: T.A. Mcallister, T. Martinez, H.D. Bae, A.D. Muir, L.J. Yanke,
G.A. Jones, (2005), “Characterization of condensed tannins purified from
legume forages: chromophore production, protein precipitation, and inhibitory
effects on cellulose digestion”, J Chem Ecol, 31 (9), p. 2049.
[9]: F. Uchiumi, T. Hatano, H. Ito, T. Yoshida, S. Tanuma, (2003),
“Transcriptional suppression of the HIV promoter by natural compounds”,
Antivir Res, 58 (1), pp. 89-98
[10]: G.T. Tan, J.M. Pezzuto, A.D. Kinghorn, S.H. Hughes, (1991),
“Evaluation of natural products as inhibitors of human immunodeficiency
virus type 1 (hiv-1) reverse transcriptase”, J Nat Prod, 54 (1), p. 143

[11]: S. Ciesek, T. von Hahn, C.C. Colpitts, L.M. Schang, M. Friesland, J.
Steinmann, et al, (2011), “The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate,
inhibits hepatitis C virus entry”, Hepatology, 54, pp. 1947-1955
[12]: X. Terra, J. Valls, X. Vitrac, J.M. Mérrillon, L. Arola, A.
Ardèvol, et al, (2007), “Grape-seed procyanidins act as antiinflammatory
agents in endotoxin-stimulated RAW 264.7 macrophages by inhibiting NFkB
signaling pathway”, J Agric Food Chem, 55, pp. 4357-4365
[13]: M. Park, H. Cho, H. Jung, H. Lee, K.T. Hwang, (2014),
“Antioxidant and anti-inflammatory activities of tannin fraction of the extract
from black raspberry seeds compared to grape seeds”, J Food Biochem, 38
(3), pp. 259-270
[14]: C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga, (1996), “Structure-
antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids”, Free
Radic Bio Med, 20 (7), pp. 933-956
[15]: W.F. Hodnick, E.B. Milosavljevic, J.H. Nelson, R.S. Pardini,
(1988), “Electrochemistry of flavonoids”, Biochem Pharmacol, 37, pp. 2607-
2611
[16]: P.C.H. Hollman, M.B. Katan, (1999), “Dietary flavonoids: intake,
health effects and bioavailability”, Food Chem Toxicol, 37 (9-10), pp. 937-
942
[17]: Masturah Markom, Masitah Hasana, Wan Ramli Wan Daudb,
Harcharan Singh, Jamaliah Md Jahim, (2007), “Extraction of hydrolysable
tannins from Phyllanthus niruri Linn.: Effects of solvents and extraction
methods”, Separation and Purification Technology, 52, pp. 487-49
[18]: Jyotismita Khasnabis, Chandan Rai, Arindam Roy, (2015),
“Determination of tannin content by titrimetric method from different types of
tea”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 7 (6), pp. 238 - 241.
[19]: Trupti P. Durgawale, Pratik P. Durgawale, Chitra C. Khanwelkar,
(2016), “Quantitative estimation of tannins by HPLC”, Scholars Research
Library, 8 (3), pp. 123 - 126.

[20]: Philip-Edouard Shay, J. A. Trofymow, C. Peter Constabel,
(2017), An improved butanol-HCl assay for quantification of water-soluble,
acetone: methanol-soluble, and insoluble proanthocyanidins (condensed
tannins), (63), pp. 1 - 11.
[21]: Oi-Wah Lau, Shiu-Fai Luk, Hsiao-Lan Huang, (1989),
“Spectrophotometric determination of tannins in tea and beer samples with
iron (III) and 1,10-phenanthroline as reagents”, (5), Analyst, pp. 631 - 633.
[22]: Tushar Dhanani, Sonal Shah, Satyanshu Kumar, (2015), “A
validated high-performance liquid chromatography method for determination
of tannin-related marker constituents gallic acid, corilagin, chebulagic acid,
ellagic acid and chebulinic Acid in four Terminalia species from India”,
Journal of Chromatographic Science, 53 (4), pp. 625 - 632.
[23]: AOAC (1980), Official Methods of Analysis. Association of
Analytical Chemists, Arlington, USA.
[24]: J. H. Kang, S. T. Chung, J. H. Go, K. H. Row, (2000),
“Separation of epigallocatechin gallate from Korean green tea by RP-HPLC”,
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, (23), pp. 2739 -
2749.
[25]: Xue-Li Cao, Yu Tian, Tian-You Zhang, Yoichiro Ito, (2001),
“Separation and purification of three individual catechins from tea polyphenol
mixture by CCC”, Journal of Liquid Chromatography &
RelatedTechnologies, (24), pp.1723 - 1732.
[26]: Maria Atanassova, Valentina Christova-Bagdassarian, (2009),
“Determination of tannins content by titrimetric method for comparison of
different plant species”, Journal of the University of Chemical Technology
and Metallurgy,44 (4), pp. 413 - 415.
[27]: Porter, L.J., Hrstich, L.N., Chan, B.G., (1986), “The conversion
of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin”,
Phytochemistry (25), pp.223 - 230.

Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang

Similar to Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang (20)

More from lamluanvan.net Viết thuê luận văn

More from lamluanvan.net Viết thuê luận văn (20)

Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang