Downloaded 37 times
Uploaded byPongsak Sarapukdee
Electrochemical Detection Of Nitric Oxide In Biological Fluids
This document describes a method for electrochemically detecting nitric oxide (NO) in biological fluids using platinum wire electrodes coated with ruthenium and Nafion. Rabbit aortic blood was suspended in drops and exposed to changing gas mixtures. The electrodes detected NO oxidation signals 200-400 seconds after exposure to decreased oxygen, indicating NO release from blood cells in response to lower oxygen levels. While the study demonstrated sensitive NO detection, further validation is needed to confirm results using other methods and better control experimental conditions.
More Related Content
Similar to Electrochemical Detection Of Nitric Oxide In Biological Fluids
Electrochemical Detection Of Nitric Oxide In Biological Fluids
- 1. Electrochemical Detection ofElectrochemicalDetection of Nitric Oxide in Biological FluidsNitric Oxide in Biological Fluids METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. BARRY W. ALLEN, JIE LIU, and CLAUDE A. PIANTADOSI
- 2. Nitric Oxide inBlood Name Description Neuronal NOS (nNOS or NOS1) Produces NO in neuronal tissue in both the central and peripheral nervous system. Inducible NOS (iNOS or NOS2) Can be found in the immune system used by macrophages in immune defence against pathogens. Endothelial Three isoforms of NO synthase (NOS) Furchgott R, Zawadzki J (1980).
- 3. Nitric Oxide inBlood epentdent Vasodilator (Acetylcholine, Bradyk r stress matory xia
- 4. Nitric Oxide inBlood • NO has a half-life of about 4 s in biological fluids and is oxidized to nitrite and nitrate anions
- 5. Nitric Oxide inBlood NO may be present in the blood in at least 2 active Forms 1. Aqueous form as a dissolved gas The half life of aqueous NO in red cell-free plasma in vitro is around 1 min (Rassaf et al., 2002). 2. Nitrosothiols or RSNOs
- 6. Nitric Oxide inBlood (oxyhaemoglobin) (methaemoglobin) (nitrate) J. P. Wallis (2005)
- 7. (Adrian J. Hobbs,2002) Nitric Oxide in Blood
- 8. Why Detection ofNO in Blood Diseases or Conditions Associated with Abnormal NO Production and Bioavailability • Hypertension • Obesity • Dyslipidemias (particularly hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia) • Diabetes (both type I and II) • Heart failure • Atherosclerosis • Cigarette smoking • Septicemia • Etc.
- 9. Introduction •Electrochemistry –fluids in realtime and in situ •NO electrodes can be made small enough to be used in vivo •NO in biological fluids that are maintained in contact with a gaseous environment, •Release of NO from blood cells as they move between regions
- 10. Materials and Methods HelixDiameter 1.85 mm 100 µM in diameter , 3 mm long. Suspended a 20 µL drop of rabbit aortic blood
- 11. Electrodes •Platinum wires, 100µM in diameter •Multiwalled carbon nanotubes •Coated with ruthenium •Coated with Nafion
- 12.
- 13. Gas flow •Air–CO2 mixture(20% O2, 5% CO2, 75% N2) •CO2–nitrogen mixture (5%CO2, 95% N2) Gas flow was maintained at constant rate
- 14. Blood Samples •Rabbit aorticblood 3 mL •Containing 7 units of lyophilized heparin •kept on ice for up to 30 min before use.
- 15. Chemical Reagents •Prepared 100µM solutions in deionized water –ascorbate –L-cystine –2,3-diphospho-D-glyceric acid (DPG) –sodium nitrite
- 16. Electrochemical Methods •Amperometry •BAS 100B/W potentiostat equipped •+675 mV (vs. Ag/AgCl,) •The electrodes were activated electrochemically b y applying alternating potent ials of 200 and 800 mV for 2
- 17. The data werenot used •the composite resistance of the electrochemical cell was measured three times, final average was more than 10% greater than the initial avera ge, fouled or that the blood d rop had dried, •The bloodwas not fluid
- 18. Results • Selectivity ofthe Sensor for Nitric Oxide 100 µM solutions in deionized water
- 19. Responses to ChangingGas Mixtures Change Gas mixed 350 s NO oxidation Control
- 20. Responses to Changing GasMixtures •Responses to Changing Gas Mixtures –NO oxidation signals were first detected from 200 to 400 s after the flowing gas was chang ed –spike was followed by a continuous signal of 1–2 nA
- 21. Discussion • The blood-droppreparation described here may represent a useful approach for further investigation of the response of NO levels
- 22. Discussion • limiting thepotential or by applying coatings to the electrode that exclude spe cies that have certain characteristics of ch arge or size • always useful to confirm anyexperimental result by using other nonelectrochemical methods
- 23. Conclusions •A highly sensitive electrochemicalsystem can b e designed to detect nM concentrations of NO activity •From 200 to 400 s after a suspended drop of rabbit arte rial blood was exposed to a d ecrease in ambient PO2 •an experimental condition—
- 24. Conclusions •we did notmeasure the change in either ambient PO2 or blood-drop PO2 in this deliberately kept low in order to prevent drying of the blood drop, PO2 will change slowly. • we cannot assign this
Editor's Notes
- #3 NO เป็นก๊าซโมเลกุลขนาดเล็กที่ถูกสร้างขึ้นจาก NO Synthase ซึ่งมีอยู่ 3 Isoform Neuronal NOS คือเอ็นไซม์ที่ เส้นประสาทสังเคราะห์ NO ที่ทำหน้าที่เป็นสารสื่อประสาท Inducible NOS คือเอ็นไซม์ที่ macrophage สังเคราะห์ NO ที่ทำหน้าเป็นภูมิคุ้มกัน ทำลายสิ่งแปลกปลอม Endothelial NOS คือเอ็นไซม์ที่อยู่ใน Endothelial cell ที่บุผนังหลอดเลือด ทำหน้าที่ควบคุมการไหลของกระแสเลือด
- #4 ขั้นตอนการสังเคราะห์ NO นั้นเริ่มต้นที่ ตัวกระตุ้น NOS ให้เปลี่ยนจากรูปจาก inactive เป็น active เช่น สารกลุ่ม NO-depentdent Vasodilator เช่น Acetylcholine Bradykinin เป็นต้น จับกับ receptor ที่อยู่บนผิวของ Endotherail cell เกิดการเปิดของ Ca ion chanel , Ca ion ในเซลที่เพิ่มขึ้นจะทำให้ NOS ทำงานโดยเปลี่ยนอะมิโนเอซิต L-arg เป็น L-Citruline ได้ผลิตภัณฑ์อีกตัวออกมาคือ NO เนื่องจาก NO เป็นก๊าชที่มีความไวต่อปฏิกิริยาสูงมาก จะเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็ว 1. Aq NO ละลายอยู่ใน 2. Nitrite ,Nitrate 3. Nitrosothiols คือจะไปจับตัวกับสารที่มี กลุ่ม thial อยู่เช่น Albumin haemoglobin glutathione 4. Peroxynitrite รวมตัวกับ Super Oxide
- #6 แต่ form active คือที่สามารถทำงานได้คือ NO ที่สะลายอยู่ในของเหลว กับ กลุ่ม Nitrosothiols ซึ่งมีงานวิจัยหนึ่งรายงานว่า Aq NO นั้นมีครึ่งชีวิตประมาณ 1 นาที
- #7 ตัวอย่าง NO ที่รวมตัวกับ Hb โดยจะเขาไปจับกับ Oxy. เปลี่ยนเปลี่ยนเป็น Meth. และ nitrite
- #8 Nitric Oxide ที่รวมตัวอยู่กับ Hb นั้นสามารถที่จะปล่อยออกมาได้เมื่อปริมาณของ PO2 ต่ำ
- #9 ความดันโลหิตสูง โรคอ้วน ภาวะไขมันโคเลสเตอรอลสูง โรคเบาหวาน โรคหัวใจขาดเลือด หลอดเลือดอุดตัน สูบบุหรี่ ติดเชื้อในกระแสเลือด
- #10 Electrochemistry เป็นวิธีที่เหมาะสมที่ใช้วัดในสิ่งตัวอย่างที่มาจากสิ่งมีชีวิต เพราะสามารถวัดได้แบบ Real time และ วัดได้จากจุดที่หลั่งได้ NO Electrode ที่ใช้ในการวัดแบบ in vivo มีการผลิตค่อนข้างน้อย งานวิจัยนี้จะเป็นโมเดลให้กับการทดลองต่อๆไป การวัดในครั้งนี้สิ่งตรวจที่มาจากสิ่งมีชีวิต นี้จะควบคุมปริมาณแก็สที่อยู่โดยรอบ โดยกระตุ้นการหลั่ง NO จาก RBC โดยการเปลี่ยนปริมาณของออกซิเจน
- #11 การออกแบบของงานวิจัยนี้เพื่อใช้ในการวัดเลือดที่ได้จากกระต่าย โดยให้ Working Electrode/Counter Electrode ทำจาก Pt อยู่ตรงกลางมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 µm ยาว 3 mm Ref Electrode ทำจาก Ag เคลือบด้วย Ag/AgCl ทำเป็นเกลียวเส้นรอบวง 1.85 mm Sample Blood หยดลงตรงกลางปริมาณ 20 µL
- #12 การเตรียม Electrode ในเหมาะสมกับ NO ใช้ Pt เส้นผ่านศูนย์กลาง 100 um เคลือบด้วย carbon nanotubes เคลือบด้วย ruthenium และสุดท้ายเคลือบด้วย Nafion
- #13 จากนั้นมีการตรวจสอบว่าสารต่างๆที่เคลือบนั้น หลังจากทำการเคลือบแล้วมีการติดที่ Electrode จริงเลยมีการ ใช้ Scanning electron micrograhy ส่องดู ก็พบว่ามีการเคลือบของสารต่างๆเกิดขึ้น
- #14 ก๊าซที่ใช้ในการควบคุมการจำลองปรากฏการ hypoxia เมื่อ NO จับอยู่กับสารอื่นเมื่ออยู่ในสภาวะขาดออกซิเจนหรือสภาวะ hypoxia ก็จะถูกปล่อยออกมา จากนั้น electrode ก็จะทำการตรวจวัด NO ที่ถูกปล่อยออกมา
- #15 การเก็บตัวอย่างเลือดใช้เลือดกระต่าย เก็บมา 3 ml ในสารกั้นเลือดแข็ง Heparin และแช่ในน้ำแข็ง เป็นเวลา 30 นาทีก่อนนำมาทดสอบ
- #16 กลุ่มสารรบกวนต่างๆที่คาดว่าจะมีผลต่อการวัด NO ก็จะเตรียมในความเข้มข้น 100 uM มี
- #17 ใช้หลักการ Amperometry โดยในแรงดันแล้ววัดกระแสที่เกิดขึ้น ใช้เครื่อง BAS 100 B/W เป็นเครื่องในการให้แรงดันและวัดแส ใช้ แรงดัน +675 mV ก่อนการวัดทำการ activate electrode ด้วยกระแสไฟฟ้าสลับ 200 mV และ 800 mV อย่างละ 250 ms และ 500 ms ตามลำดับ และทำทั้งหมด 120 s
- #18 การคัดเลือก Data มาวิเคราะห์ วัดความต้านทานของ electrode ก่อนทำการวัดและหลังการวัดอย่างละ 3 ครั้ง ถ้าหลังมากว่า 10 % แสดงว่าเลือดแห้ง เลือดแห้งไม่ใช้ data นั้น เลือดไม่อยู่ในเกลียว
- #19 ผลของการวัดกับสารรบกวนเทียบกับ NO
- #20 การวัดเมื่อเปลี่ยน gas mixed แกนตั้งคือกระแสหน่วย nA แกนนอนเป็นเวลา กราฟ A ลูกศรคือช่วงที่มีการเปลี่ยนก๊าซเมื่อเวลาผ่านไป 350 s พบว่าเกิด peak ของสัญญาณขึ้น กราฟ B คือ Sample blood เหมือนกันแต่ไม่เปลี่ยนก๊าซ
- #21 จากการศึกษาดังกล่าวพบว่า peak จะเกิดขึ้นหลังเปลี่ยนก๊าซประมาณ 200-400 s Peak ที่เกิดขึ้นวัดกระแสได้ประมาณ 1-2 nA
- #22 จากการเก็บตัวอย่างเลือดอาจจะทำให้เกิดผลกระทบปริมาณของ NO ได้
- #23 วิธีที่วัดคือการวัดการ transfer ที่ electrone ดังนั้นเราไม่อาจแน่ใจได้ว่าตัวที่ transfer ให้ นั้นมาจาก NO การเลือก selective membran และการ limite แรงดันสามารถช่วยแก้ปัญหานี้ได้ 2. ควรจะเพิ่มการวัดด้วยวิธีอื่นเพื่อใช้ในการเปนียบเทียบด้วย
- #24 สามารถผลิต electrode ที่มีความไวต่อ NO ได้ หลังจากเปลี่ยนปริมาณ PO2 ไปแล้วประมาณ 200-400 s จะเกิดปฎิกิริยาเกิดขึ้น ในการทดลองนี้ได้ใช้การจำลองภาวะ Hypoxia เพื่อกระตุ้นให้มีการปล่อย NO
- #25 1.ไม่สามารถที่จะทำการลดปริมาณ PO2 ให้เหมือนจริงได้ เพราะถ้าทำช้าจะทำให้ เลือดแห้ง 2. ไม่สามารถระบุตำแหน่งได้ว่า ออกมาจาก เม็ดเลือด หรือ plasma