Recommended
Recommended
More Related Content
Featured
Featured (20)
Comparison of Symptoms, Whole Genome Sequencing, and Phylogenetic Analysis of Isolates of Citrus tristeza virus from Mazandaran and Fars Provinces in Iran
- 1. Research Article Vol. 37, No. 3, Fall 2023, p. 237-258 Comparison of Symptoms, Whole Genome Sequencing, and Phylogenetic Analysis of Isolates of Citrus tristeza virus from Mazandaran and Fars Provinces in Iran N. Rouhani1, M. Zakiaghl 2* , M. Mehrvar 3 Received: 24-06-2023 Revised: 09-09-2023 Accepted: 13-09-2023 Available Online: 13-09-2023 How to cite this article: Rouhani, N., Zakiaghl, M., & Mehrvar, M. (2023). Comparison of symptoms, whole genome sequencing, and phylogenetic analysis of isolates of Citrus tristeza virus from Mazandaran and Fars provinces in Iran. Journal of Iranian Plant Protection Research, 37(3), 237-258. (In Persian with English abstract). https://doi.org/10.22067/jpp.2023.83109.1152 Introduction Citrus tristeza virus (CTV) is one of the most devastating citrus diseases in Iran. The CTV genome is a positive single-stranded RNA molecule with a size of 19.3 kb containing 12 open reading frames (ORFs). CTV encodes two different coat proteins, of which the small coat protein (CPm) covers only the 3' end of the genome. CTV infected trees show symptoms such as stunting, yellows, reduced vigor and death. In addition, CTV generates three typical disease syndromes, including quick decline, stem pitting and seedling yellows. In total, more than 259 thousand hectares of citrus are grown in the north and south of Iran. Considering the lack of the complete genome sequence of Iranian CTV isolates and the different climatic conditions in citrus cultivation in the north and south of Iran, the genome of CTV isolates from Iran was determined for the first time and their phylogenetic relationships with other CTV isolates were studied. Materials and Methods In spring and fall 2015, 30 samples from Mazandaran province in northern Iran and 25 samples from Fars province in southern Iran were collected from trees suspected of being infected with CTVs. Total RNA was extracted using the RNX-Plus kit according to the manufacturer's instructions. CTV was identified using the specific primer pair CPF (5AAAGAAGGCGACGATGTTGT3) and CPR (5AGCTCCGGTCCAAGAAATCTG3) designed based on the coat protein gene of CTV. Reverse transcription was performed using MMuLV reverse transcriptase (Pars Tuos, Iran) and PCR reaction was performed using Amplicon 2x PCR Master Mix (Amplicon, Denmark). Infected samples were grafted onto sour orange seedlings. sRNAs were extracted using a protocol developed by Carra et al. (2006), and sRNA libraries were prepared according to the CATS protocol (Turchinovich et al., 2014). One microgram of each library was sequenced on the Illumina HiSeq2500 platform from Macrogen, South Korea. The CTV strains were determined by virtual replication and digestion or alignment of the region between the small coat protein (Cpm) and coat protein (Cp) genes. The phylogenetic tree was constructed by the maximum likelihood method using the T92+I nucleotide substitution model with 500 bootstrap repeats by MEGA7. The nucleotide and amino acid similarity matrix was calculated using SDTv.1.2 software. Potential recombination events in the genome were determined using RDP v.5.5. 1, 2 and 3- Ph.D. Gratuated in Plant Pathology and Associate Professors, Department of Plant Pathology, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran, respectively. (*- Corresponding Author Email: zakiaghl@um.ac.ir) https://doi.org/10.22067/jpp.2023.83109.1152 Journal of Iranian Plant Protection Research https://jpp.um.ac.ir
- 2. 238 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402 Results and Discussion CTV infection was detected in 17 samples from Mazandaran province (56% of samples) and in 8 samples from Fars province (33% of samples) using a CPF/R-specific primer pair. CTV symptoms were mild to severe stunting, chlorosis, yellowing, vein yellowing, and severe decline in the citrus samples from the north of Iran, while CTV symptoms in the samples from the south of Iran were stunting, chlorosis, dieback and quick decline. Three months post inoculation, symptoms of severe stunting and chlorosis appeared in seedlings inoculated with isolates from the north, while mild stunting and yellowing appeared in seedlings of sour orange inoculated with CTV isolates from the south. By assembling the contigs obtained from the RNA-seq data, the complete genomes of IR-North1, IR-North2, IR-South1, and IR-South2 isolates were reconstructed with lengths of 19296, 19302, 19252, and 19251 nucleotides, respectively. The Iranian CTV isolates had nucleotide similarity in the range of 95.2-77.5% with other CTV isolates deposited in GenBank. The polymerase, P65, and coat protein genes of the Iranian CTV isolates showed identity at the amino acid level of 80.6-94.1%, 88-93.9%, and 92.4-96.4%, respectively, with other CTV isolates. Analysis of the CTV strains revealed that IR-North1 resembles the severe decline strain belonging to genotypic group T36, while IR-South2, IR-North2, and IR-South1 belong to the stem pitting and seedling yellows strains of genotypic group VT/T3 and are similar to strains T3, SY, and T318A, respectively. In the phylogenetic tree based on the full length of the CTV genome, three subclades were designated: VT, T68, and T36. IR-North2, IR-South1, and IR-South2 isolates were grouped into VT, and IR- North1 isolate was grouped into T36. Like the reference CTV isolate, the four Iranian CTV isolates had 12 open reading frames. Examination of the Replicase, RdRp, P65, P61, CPm, and CP proteins revealed 280 amino acid substitutions in 33 conserved motifs in Iranian CTV isolates. The isolate IR-North1 had only five substitutions; however, 97, 85, and 93 substitutions occurred in the isolates IR-North2, IR-South1, and IR-South2, respectively. Most substitutions were found in the replicase and p61 proteins, which are involved in virus replication and assembly, respectively. RdRp and p23 proteins had the least amino acid substitutions. No known conserved motif was observed in P33, P6, P18, P13, and P20 proteins. In addition, IR-North1, IR-North2, and IR-South1 were recombinant. In IR-North1, 1426 nucleotides in the P65 gene and 773 and 2444 nucleotides in the replicase gene were recombinant in IR-North2 and IR-South1 isolates, respectively. Conclusion An analysis of symptoms, nucleotide diversity, dominant strains, and the phylogenetic relationship of the four Iranian CTV isolates sequenced in this study revealed that two isolates from northern Iran were quick decline and seedling yellows strains, falling within the genotypic groups T36 and VT. These groups were distinguished by distinct symptoms and a separate phylogenetic position. Conversely, the two southern CTV isolates were closely associated with CTV stem pitting strains, classified into genotypic groups VT and T3, sharing a close phylogenetic position. Keywords: Citrus, Quick decline, NGS, Race, Seedling yellows, Stem pitting
- 3. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 239 نشریه پژوهش ایران گیاهان حفاظت های https://jpp.um.ac.ir پژوهشی مقاله جلد 37 شماره 3 پاییز ، 1402 .ص ، 258 - 237 فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه جدایه از مرکبات تریستزای ویروس های استان فارس و مازندران های 1 روحانی ندا 1 - عقل زکی محمد 2 * - مهرور محسن 3 :دریافت تاریخ 03 / 04 / 1402 :بازنگری تاریخ 18 / 06 / 1402 :پذیرش تاریخ 22 / 06 / 1402 چکیده و یروس تر یستزای ( مرکبات Citrus tristeza virus-CTV ) یکی ب از یماری های کار مرکبات اغلب در مرکبات درختان مهم ی ها ی ا یران .است ا در ین تحق یق توال ی و کامل یروس تر یستزای مرکبات منطقه دو از مرکبات خیز مازندران استان و اتارس استتان تع یتین برخت و ی ب صتاات یولتوییکی و مولکول ی آن با ها یکدیگر مقا یسه .اس شده 56 نمونه از درصد های جمع آوری و مازندران استان از شده 32 نمونه درصد ها ی ته یه اتارس استان از شده زنج آزمون در یره ا ی پل ی و به آلوده مراز یروس تر یستزای عال بودند مرکبات یم CTV نمونه در ها ی م رکبات مازندران استان کوتولگ ی خا یت شتد تتا ،ید سرخشک ،یدگی زرد ،ی ز ردی سر زوال و رگبرگ یع حتال در بود ی کته نمونته در هتا ی اتارس استتان عال یتم CTV کوتتولگ ، ،ی سبزخشتک ،یدگی زرد ،ی و سرخشک یدگی شاخه ما از پس ماه سه بود ها یه زنی ن یز کوتولگ عالئم ی شد ،ید روشن رگبرگ ،ی زرد ی ر و یزبر گی در ن هال ها ی ما یه زن ی جدا با شده یه هتا ی مازندران استان عال و یم کوتولگ ی خ ، ای روشن رگبرگ ،ی زرد ی ر و یزبرگی نهال در ها ی بذر نارنج ی ما یه زن ی جدا با شده یه ها ی اارس استان ا یجاد شتد تر به آلوده مرکبات درختان از یستزا استان از های نمونه مازندران و اارس بردار ی از و کتابخانه آنها sRNA ته یه توال و ی یابی نتا شدند یج کته داد نشتان ب کامل ینوم طول ازسازی بترا شده ی جدا یته هتا ی IR-North1 ، IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 بته ترت یتب 19296 ، 19302 ، 19252 و 19251 نوکلئوت ید نوکلئوت سطح در و .اس یدی سا با یر جدا یه های CTV ین بانک در موجود ب ین 5 / 77 - 2 / 95 بررست داشتتند .شتباه درصتد ی تتوال ی پروتئ ین ها نشان وجود دهنده 280 جایگزینی در 33 موت ی جدا در یه ها ی توال ی یابی شده CTV کمتر بود ین تغ ییترات جدا در یته IR-North1 پتنج بتا جا یگزینی جدا در بود یه ها ی IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 به ترت یب 97 ، 85 و 93 جا یگزینی ب بتود ااتاده اتااق یشتترین جتا یگزینی در چارچوب های ین ی ORF1a و p61 بو د تع یین سو یه جدا یه ها همانندساز با ی مجاز هضم و ی همردی و ناح سازی یته بت ین ین هتای پروتئ پوشت ینتی ( کوچک Cpm پروتئ پوش و ) ینی جدا که داد نشان یه IR-North1 مشابه نژاد های سر زوال مولد یع سو و یه T36 جدا و یه هتای IR-South2 ، IR- North2 و IR-South1 از نژاد های مول د ساقه آبله ای زرد و ی به و نهالچه ترت یب ستو بتا مشابه یه T3 ، SY و T318A ا .درخت در هستتند یلتوینی ترس یم ن ینوم کامل طول اساس بر شده یز جدا سه یته IR-North2 و IR-South1 و IR-South2 گتروه در ، VT و جدا یته IR-North 1 گتروه در T36 همچن گراتند قرار ین بررس ی نوترک وقوع یبی اح تمالی در جدایه های ا یرانی که داد نشان جدایه ها ی IR-North1 ، IR-North2 و IR-South1 ین در ها ی رپل یکاز و P65 نوترک یب نتا هستند یج بررس ی توال و عالئم ی چهار کامل جدایه نشان آمده .بدس داد کته د و جدایته از آمتده .بدست استتان مازندران جا و عالئم نوع لحاظ از یگاه ا یلوینی هم از متااوت ول هستند ی دو جدایه اارس استان ا نظر از یلوینی ینوت و یپی با یکدیگر دارند .قراب واژه های :کلیدی توالی جدید نسل یابی ، ساقه ،سریع زوال ،نهالچه زردی آبله ،ای نژاد ،مرکبات 1 ، 2 و 3 - به ترت ی ب دان آموخته د ک ت ر ی بیماری شناسی گ ی اه ی و د ا ن ش ی اران گرو ه گ ی ا ه پزشک ی ، د انشکد ه کشاورز ی ، د انشگا ه اردو س ی ا ،مشهد ،مشهد ی ران *( - نو ی سند ه :مسئول Email: zakiaghl@um.ac.ir ) https://doi.org/10.22067/jpp.2023.83109.1152
- 4. 240 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402 مق دمه ( تات تمرکب تتزای تتریس تروس توی Citrus tristeza virus-CTV ) جتتنس بتته متعلتتق Closterovirus ختتانواده از Closteroviridae ، بزرگ مخترب و شده شناخته گیاهی ویروس ترین مهتم و تترین تترین پیکره .اس جهانی گسترش با مرکبات بیماری های CTV رشته با ای اندازه nm 11 × 2000 می ینوم باشد شامل مولکتول یک RNA تتک حتدود اندازه با و .مثب رشته 19.3 kb حتاوی 12 ختوان چتارچوب ( 1 ORF تالقوه تب تد تتولی تا تب ) 17 ته تترجم تل تغیرقاب ته تناحی دو و تروتئین تپ ( 2 NTR انتهای در ) ' 5 و ' 3 می باشد CTV پوششی پروتئین دو دارای ( کوچک پوششی پروتئین و .اس متااوت وزن با CPm انتهت تنهتا ) ای ' 3 ( دهتد متی پوش را ینوم Satyanarayana et al., 2004 نتر ) نیمه در نوکلئوتیدی تنوع ' 5 تتوالی بیشتر و زیاد ینوم .محااتت هتای نیمه در شده ' 3 ( دارنتد قرار Albiach-Marti et al., 2000b نتر ) ی تنوع ین از یک هر نتیکی ینوم در ها از ولی .اس متااوت CP ، p23 ، p20 ، p27 گتروه برای بنتدی جدایته هتای CTV متی استتااده شتود ( Herrera-Isidron et al., 2009 ) CTV با همراه بیماری آشکار سندروم سه بی تعداد الگوی شماری می ایجاد متااوت سندرو سه کند م CTV ( ستریع زوال شتامل 3 QD ،) آبله ساقه ( ای 4 SP می گیاهچه زردی سندروم و ) در ززم زمتان و باشد ( .اس متااوت سندروم هر عالئم توسعه Ruiz-Ruiz et al., 2006 ) . سویه از برخی به آلودگی در زوال سندروم های CTV پایه در بیشتر و مشاهده نارنج حساس می آبله ساقه سندروم شود پرتقتال در بیشتر ای می ایجاد حالی در شود گریپ که را ستندروم ایتن ایجتاد .قابلیت اروت و نتدارد زیادی .اهمی اقتصادی لحاظ از نهالچه زردی سندروم ندارد را رشتد کامتل توقت گتاهی و برگی کلروز ،کوتولگی شامل عالئمی می نشان مشخ .بسرع گلخانه در و دهد متی ص شتود ( Dawson et al., 2015 ) ویروس CTV سویه دارای بتر کته .است مختلاتی های میزبان در شده ایجاد عالئم مبنای ( مختل های et Pool - Ramírez ., 2022 al ( شتته توستش انتقتال .قابلی ،) Yokomi, 2019 نقشته ،) ( پپتیتدی ., 2000 et al Martı́ - Albiach بتا سترولوییکی واکتن ،) تادی تب تی تآنت ( تال تمنوکلون تای ته ., 2021 et al Iftikhar توی تالگ و ) dsRNA ( Moshe and Munir, 2000 با ) این دارند تااوت یکدیگر سویه جدایه ایلوینی .درخ در ها های CTV ینتوتیپی گتروه .ها در شتامل T36-Like ، RB و HA18-9 ، VT-Like ، HA16-5 ، B165 و B18 - NZ ، M16 - NZ و Like - T30 تی تم ترار تق تد تگیرن ( Pais da 1- Open reading frame 2- non translational region 3- Quick decline 4- Stem pitting ., 2021 et al Cunha ) مر درختان .طبیع در معموز از بی به کبات از ستویه یک CTV متی آلتوده ( شتوند Yokomi et al., 2019 امتا ) ستویه .جمعی در توازن ایجاد چگونگی از چندانی اطالعات وجتود هتا سویه ندارد می منطقه یک در غالب و آب شترایش یر تتا .تحت توانتد ( کند تغییر هوایی Cowell et al., 2016 ) مرکبات عمده ناحیه سه ایران در استان شامل کاری و گیالن های در مازنداران مازندران استان ، نواحی مرکزی استان مانند های اارس و مرکبات و کرمان کاری استان در ایران جنوبی نوار های های خوزستتا ن مجم در که دارد وجود بلوچستان و سیستان تا حتدود مساحتی وع 259 ،کشاورزی جهاد (آمارنامه دارند هکتار هزار 1400 ایتران در تریستتزا ) ( میکروستکپی ایمینتوالکترون از استتااده با بار اولین ISEM ) توستش ( نینهتاوس و .نسب ابراهیمی Nesbat and Nienhaus, - Ebrahim 1978 شد گزارش ) سویه سپس ، زردی غالب سویه عنوان به گیاهچه شد مشخص مازندران استان در شته توسش انتقال قابل توالی بررسی جدایته پروتئینتی پوش ین هتای CTV از مازنتدران استتان بیتانگر .شباه 97 ستویه بتا آنها درصدی آبلته ستاقه ( شتدید ای SY568 و ) ( یاپن گیاهچه زردی سویه NUagA ) ولتی بود بتین چنتدانی تاتاوت جد ایه های مازندران استان ( نشتد .یاا اارس استان و Barzegar et al., 2006 ( همکتاران و علتوی ) Alavi et al., 2005 .هات نیتز ) جدایه جمع آوری از شده مازندران استان در عالئتم استاس بر را ایران میزبان در د مختل های آبله ساقه مولد گروه دو ر و ،شتدید زوال و ای که دادند قرار گیاهچه زردی مولد جدای ه توسش اول گروه های Aphis gossypi تحلیتل و تجزیته استاس بر محققین این بودند انتقال قابل ین ایلوینتیک CP جدای ه از مستتقل منشتا دو ،مازنتدران شترق هتای CTV مطا نمودنتد پیشنهاد را ایران در روی بتر ینتیکتی تنتوع لعتات جدایه این نیز کرمان استان های جدایه داد قرار متمایز گروه دو در را ها ( Ahmadi et al., 2006 ( همکاران و .نی پاک ) 2002 آلتودگی نیز ) به CTV استان تمام در را حتالی در ،نمودند گزارش ایران جنوبی های ه نتوانستند که ردیابی نواحی این در را ویروس این از شدیدی نژاد یچ کنند ویروس شناسایی و ردیابی برای پیشتر ( سیر در ها Wylie et al., 2014 ( الال ،) Jo et al., 2017 ( گالبتی ،) Jo et al., 2016 ا ،) نگتور ( Coetzee et al., 2010 ستیب ،) ( شتیرین زمینتی Kashif et al., 2012 ( ارنگی گوجه ،) Li et al., 2012 ( مرکبتات و ) Matsumura et al., 2017 توال تکنیک از ) ی .اس شده استااده جدید نسل یابی بتا جدایه ینوم کامل توالی اقدان به توجه ایرانتی هتای CTV شترایش و مرکبات مناطق متااوت اقلیمی خیز مازنتدران استان ،اتارس استتان و ،تایی تشناس ،تابی تردی .ت تجمعی تی تینتیک توع تتن تی تبررس CTV تین تتعی و سویه روش با ویروس این های پیشراته آزمایشگاهی های می ضروری توالی روش از استااده با تحقیق این در بنابراین باشد جدیتد نسل یابی
- 5. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 241 جدایه ینوم کامل ترادف های CTV کتاری مرکبات عمده دومنطقه از ایلوینی رابطه و مولکولی ،بیولوییکی خصوصیات برخی و تعیین ایران .اس شده مقایسه یکدیگر با آنها روش و مواد ها نمونه برداری د سال پاییز و بهار اصول ر 1395 مرکبات درختان برگ و ساقه از تعداد مرکبات تریستزای بیماری به مشکوک عالئم دارای 30 نمونته شهرهای از بهشهر و نکا ،ساری ،قائمشهر ،بابل و مازنتداران استان در 25 نمونه اارس استان در زر و جهرم ،خار شهرهای از نمونه بترداری نمونه شد ها جعبه در شدند منتقل آزمایشگاه به خشک یخ حاوی های اسید نوکلئیک استخراج چینی هاون درون عالئم دارای گیاه رگبرگ و دمبرگ از گرم یک استخراج سپس شد پودر مایع ازت از استااده با RNA استااده با کل .ت تکی از RNX Plus ( EX6101 تتورالعملتدس تابقتمط )تیناکلون تس انجا سازنده .شرک شد م شناسایی CTV اختصاصی آغازگر از استفاده با نمونه در تریستزا اولیه تشخیص جمع های استااده با ،شده آوری از اختصاصتتتتتتتتتتتتتتتی آغتتتتتتتتتتتتتتتازگر .جاتتتتتتتتتتتتتتت CPF(5AAAGAAGGCGACGATGTTGT3)/CPR(5AG CTCCGGTCAAGAAATCTG3) قطعه که ، پوشت ین از ای شتمار (رس تریستزا ویروس پروتئینی NC001661 را ) همانند ستازی می شد انجام ،کند ( Harper and Pearson, 2015 ) معکوس ترانویسی واکن 1 .رونوشت آنتزیم با معکتوس بترداری MMuLV )ایران ،توس (پارس ستازنده .شترک دستتورالعمل مطابق مدت به آنزیم 20 دمای در دقیقه 42 درجته ستانتی شتد انجتام گتراد تن تواک PCR .ت تغلظ تا تب تن تواک توش تمخل از تتااده تاس تا تب 2 تر تبراب یک صورت به واکن دمایی پرواایل شد انجام )دانمارک ،(آمپلیکون .واسرش چرخه در اولیه سازی 94 درجه سانتی دقیقه؛ سه مدت به گراد 35 .واسرش شامل چرخه در سازی 94 سانتی درجه متدت به گراد 30 در آغازگر اتصال ،انیه 57 درج سانتی ه مدت به گراد 45 بستش و انیه در 72 سانتی درجه مدت به گراد 60 در نهایی بسش چرخه یک و انیه 72 سانتی درجه مدت به گراد 10 بود دقیقه واکتن محصتول PCR حتاوی درصتد یتک آگتارز یل در DNA Green Viewer (Safe Stain Dye) )ایران ،توس (پارس ولتای .تح 80 الکترواتور ،.ولت و ز واکن محصول شد آشکارسازی PCR پس خالص از سازی ک با .یت 1- RT-PCR یل از استخراج .شترک به توالی تعیین .جه )ایران ،آزما تجهیز (یکتا توالی نتیجه شد ارسال جنوبی کره ماکروین یابی از استتااده بتا ابتزار BLAST ترادف با های شد مقایسه ین بانک در موجود نوکلئوتیدی مایه به زنی محک گیاه پیوندک به آلوده های CTV بر روی (گتواهی ستالم بتذری نهتال پیونتد )ساری مستضعاان بنیاد مرکبات نهال پرورش مرکز توسش شده نهال و شد زده مایه های دمای با گلخانه شرایش در شده زنی 28 درجه سانتی نگه گراد شدند داری از کتابخانه ساخت RNA کوچک های کتا .ساخ برای ابتدا ،بخانه 2 sRNA کتار روش به ها ا همکتاران و ( 2007 آگارز یل در و استخراج دمبرگ و رگبرگ از ) 2 % آشکارستازی قطعات و 20 - 30 .کیت از استتااده بتا نوکلئوتیدی و یل از استتخراج محصول تخلیص PCR آگتارز یل از )ایران ،آزما تجهیز یکتا .(شرک کتابخانه .ساخ شدند استخراج sRNA به ر وش CATS شتد انجام ( Turchinovich et al., 2014 میکروگترم یتک کتابخانته هتر از ) توالی .جه اترم .پلت در یتابی HiSeq2500 Illumina .شترک بته شد ارسال جنوبی کره ماکروین تحلیل و تجزیه داده ها درکتابخانه خوان .کیای بررسی های sRNA توالی شده یابی با از استااده نرم اازار FastQC 0.11.05 شد انجام و ختوان بتا هتای ( پایین .کیای Phred quality ≥20 از کمتر طول و ) 18 بتا نوکلئوتید نرم اازار Alien trimmer 0.4.0 داده از توالی های شتدند حتذف یابی خوان سویه با شده پازی های مرجع های CTV بانتک در موجتود ی نرم از استااده با ن اازار UGene همردی تتوالی شتدند سازی هتایی پوشانندگی بیشترین که 3 آنهتا توااقی توالی و شدند انتخاب داشتند را آمد .بدس ویروس سویه تعیین سویه تعیین جدا یه شترایش در بررستی متورد هتای in Silico بتا همانندسازی همردی و مجازی هضم و ستازی ی بتین ناحیته ن هتای ( کوچک پروتئینی پوش Cpm پروتئینتی پوش و ) ( Cp روش بته ) یوکومی و ساپوناری ( Saponari and Yokomi, 2010 ) شتد انجتام تازی تهمانندس تان تامک تدا تابت در ته تقطع ته تس تازی تمج 78 ، 235 و 816 از نوکلئوتیدی Cpm و Cp آغازگرهتای بوستیله P27 ، DDE و SSP 2- smallRNA 3- coverage
- 6. 242 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402 ( Saponari and Yokomi, 2010 شد بررسی ) قطعه سپس 78 شتامل نوکلئوتیدی 25 انتهتای نوکلئوتیتد 3 ین پروتئینی پوش کوچک و 53 نوکلئوتید بتین ناحیه پوشت ین ینتی (نوکلئوتیتد بزرگ پروتئینی پوش ین و کوچک پروتئینی 16063 تتا 16114 ،رارنس جدایه در شمار رس U16304 جدایه از ) تتوالی هتای ستویه در آن متنتاتر قطعته بتا شده یابی شتده شتناخته هتای CTV همردی سازی قطعته مجتازی هضم همچنین شد 235 نوکلئوتیتدی پروتئینتی پوش ین از حاصل کوچتک بتزرگ پروتئینتی پوشت و (نوکلئوتید 15987 تا 16222 شمار رس ،رارنس جدایه U16304 بتا ) استاا از ده آنزیم DdeI سویه تاکیک های VT و T3 ا ،شتد انجام یتن حال در ی که .اس سویه سایر در ناحیه این در های CTV بترش محل قطعه مجازی هضم همچنین ندارد وجود آنزیم این 816 نوکلئوتیتدی آنهتا ینی بین ناحیه و بزرگ و کوچک پروتئینی پوش ین از حاصل (نوکلئوتید 15884 تا 16700 جد شمار رس ،رارنس ایه U16304 بتا ) برشی آنزیم از استااده SspI سویه شناسایی برای خایت هتای CTV ( دارد کاربرد Saponari and Yokomi, 2010 توالی همردیای ) و ها شبیه همانند سازی سازی نترم در آنزیمی هضم و ااتزار Vector NTI 10.3.1 (Invitrogen) شد انجام فیلوژنی روابط و نوکلئوتیدی شباهت بررسی ترسیم از استااده با ایلوینی .درخ توالی های CTV آمتده .بدس توالی و تحقیق این در جدایته برخی کامل ین بانتک در موجتود هتای ( تدول تج 1 ) روش ته تب Maximum likelihood تدل تم از تتااده تاس تا تب ن جانشینی وکلئوتیدی T92+I با 500 در استتر بوت آزمون در تکرار بسته نرم اازاری MEGA7 شد انجام چارچوب و ینوم در آمینواسیدی و نوکلئوتیدی .شباه میزان هتای جدایه در ینی های CTV همردی با در سازی نرم اازار SDTv.1.2 در الگوریتم MUSCLE چارچوب شناسایی شد محاسبه های موجود ینی نرم از استااده با ینوم در اازار CLC Genomics Workbench v.21 الگوریتم از استااده با سپس شد انجام BlastP موتی .محااظ های پتروتئین تتوالی بتا و مشتخص ین هر پروتئینی توالی در موجود شده مرجتتع ینتتوم CTV شتتمار (رس U16304 شتتد مقایستته ) ردیتتابی نوترکیب د موجود احتمالی های جدایه ینوم ر توالی های نیتز شتده یابی نرم از استااده با اازار RDP v.5.5 شد انجام جد ول 1 - جدایه مشخصات های فیلوژنی بررسی در استفاده مورد CTV ژن بانک در موجود Table 1- Characteristics of the CTV isolates used in the phylogenetic analysis available in the gene bank منبع Reference منطقه Location ژنوم طول Genome length سویه Strain شمار رس Accession number Suastika, 2000 Japan 19302 SY AB046398 Albiach-Marti and Dawson, 2000 USA 19259 T30 AF260651 Abdelmaksoud and Gamal El-din, 2003 Egypt 19296 T36 AY340974 Ruiz-Ruiz et al., 2005 Spain 19252 T318A DQ151548 Weng et al., 2007 USA 19251 VT EU937519 Harper et al., 2009 New Zealand 19251 SP EU857538 Melzer et al., 2009 USA, Hawaii 19245 HA18-9 GQ454869 Sindhvajiva et al., unpublished data Thailand 19302 A18 JQ798289 Matsumura et al., 2017 Brazil 19251 CSL01 KY110737 Matsumura et al., 2017 Brazil 19243 CSL02 KY110738 Yokomi et al., 2017 USA 19248 S1 KU589212 Cook et al., 2016 South Africa 19270 RB KU883265 Cook et al., 2016 South Africa 19280 HA16-5 KU883267 Cook et al., 2020 South Africa 19246 T68 MK033511 Pappu et al., 1994 USA 19296 T36, Quick decline U16304 Vives et al., 1999 Spain 19259 mild Y18420 نتایج عالیم به آلوده درختان CTV قبیل از عالئمی پریتدگی رنگ ،کوتولگی برگ ، عمومی ضع و ریزبرگی ، سرخشکیدگی و زردی ( داشتند شکل 1 ) غالب عالیم CTV نمونه تمام در شتامل اراوانی بترتیب ها زردی ، ر ،برگ یزش ر و یزبرگی کوتولگ عالیتم بتود ی CTV نمونته در هتای جمع آ کاری مرکبات از شده وری مازندران استان های شامل کوتتولگ ی خا تا ی شد ،ید سرخشک ،یدگی رنگ پریتدگی بترگ هتا ، زرد ،ی زرد ی رگبرگ ، ر ،یزبرگی ر یزش برگ ، کوچک ی م ،یوه زوال شد ید سر و بود یع اراوانتی بترتیتب غالب عالیم و شتامل زردی ، ر و یزبرگتی کوتتولگ ی ته تنمون در تود تب ت تخای تم تعالی تارس تا تتان تاس تای ته CTV تورت تبص کوتولگ ،ی سبزخشتک رنتگ ،یدگی پر ،زردی ،یتدگی ر ،یزبرگتی ر یتزش برگ ، سرخشک شاخه یدگی غالب عالیم و ها شامل ر یتزش بترگ و هتا سبزخشک بود یدگی نمره با نمونه عالیم به باینری دهی بته آلتوده های CTV و رستم کالدوگرام UPGMA نمونه ).اس نشده داده نشان (اطالعات بتر هتا نمونه اول گروه در شدند تقسیم گروه سه به عالیم اساس های خاتر ،
- 7. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 243 جهرم ، قائمشهر ، سار غالتب عالیتم بتا نکا ،ی زرد ،ی ر یتزش بترگ و سبزخشک در سریع؛ زوال یا یدگی نمونه دوم گروه های ستار ،جهترم ،ی ش عالیم و نکا ،خار ایع کوتولگ ی خا ، ی زرد ،ی ر در و یزبرگتی گتروه نمونه سوم از هایی سار عالیم با ی کوتولگ ی شتد یتا ید سرخشتک یدگی ،شاخه زرد و ی ر داشتند قرار یزبرگی شکل 1 - .مرکبات تریستزای با همراه عالیم A )(نکا سالم تامسون پرتقال درخت : B زر ،شدید کوتولگی : پرتقال درخت در سرخشکیدگی و دی ،)(ساری خونی C ،)(نکا تامسون رقم پرتقال درخت در ریزبرگی و خفیف زردی ،کوتولگی : D خونی پرتقال درخت در ریزبرگی و خفیف زردی : ،)(ساری E ،)(ساری والنسیا رقم پرتقال درخت در خفیف زردی و میوه شدن کوچک ،کوتولگی : F و خفیف زردی ،کوتولگی : درخت در ریزبرگی )(نکا تامسون رقم پرتقال G ،)(نکا پرتقال درخت در زوال و سرخشکیدگی : H خونی پرتقال درخت در برگ ریزش و ریزبرگی ،سرخشکیدگی : ،)(ساری I )(ساری خونی پرتقال درخت در سرخشکیدگی و شدید زوال : J ،)(خفر لیمو درخت در برگ ریزش و کوتولگی ،سبزخشکیدگی : K : سبزخ ،)(خفر لیمو درخت در برگ ریزش و ریزبرگی ،شکیدگی L .)(جهرم عمانی لیمو درخت در برگ ریزش و سرخشکیدگی ،سبزخشکیدگی : Figure 1- Symptoms associated with citrus tristeza disease. A: Healthy Thomson orange tree (Neka), B: Severe stunting, yellowing, and die back on blood orange tree (Sari), C: Stunting, mild yellowing, and small leaves on Thomson orange tree (Neka), D: Mild yellowing and small leaves on blood orange tree (Sari), E: Stunting, small fruit size, and mild yellowing on Valencia orange tree (Sari), F: Stunting, mild yellowing, and small leaves on Thomson orange tree (Neka), G: Decline and dieback on orange tree (Neka), H: Dieback, small leaves, and defoliation on blood orange tree (Sari), I: Severe decline and dieback on blood orange tree (Sari), J: Green decline, stunting, and defoliation on lemon tree (Khafr), K: Green decline, small leaves, and defoliation on lemon tree (Khafr), L: Green decline, small leaves, and defoliation on Omani lemon tree (Jahrom) به آلودگی میزان بررسی CTV قطعه تکثیر 500 بتازی .جا پروتئینتی پوشت ین از CTV در آزمون RT-PCR از استتااده بتا آلتودگی بیتانگر اختصاصتی آغتازگر نمونه بود مرکبات تریستزای ویروس به ها از کته داد نشتان نتایج 30 جمع نمونه ، مازنتدران استتان از شده آوری 17 از و نمونته 25 نمونته اارس استان 8 تریستتزای ویتروس بته آلوده نمونه هستتند مرکبتات A B C D H G F E I J K L
- 8. 244 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402 توالی محصول یابی PCR توالی با آن مقایسه و بانتک در موجتود های شتده ستازی هماننتد قطعته کته داد نشان ین 514 ین از نوکلئوتیتد پروتئینی پوش CTV .اس انتقال نمونه هایی به آنها آلودگی که CTV آزمتون در RT-PCR تاییتد نهال بروی بود شده پیوند بذری نارنج های از پتس متاه سته شد زده مایه عالئم زنی کوتولگی شد ، خایت تتا ید روشتن رگبترگ ،ی زرد ی و ر نهال در یزبرگی جدایه با شده زنی مایه های و مازنتدران استتان های عالیتتم کوتتتولگ ی خا ، یتت روشتتن رگبتترگ ،ی زرد ی ر و در یزبرگتتی نهال مایه نارنج های جدایه با شده زنی اتارس استتان های شتد ایجتاد ( شکل 2 ) نهال آلودگی مایه های بته شده زنی CTV آزمتون در RT- PCR شد تایید نیز ویروس اختصاصی آغازگرهای از استااده با شکل 2 - جدایه عالیم های CTV .زنی مایه از پس ماه سه سالم بذری نارنج روی A برگ پریدگی رنگ : مایه از ناشی شدید کوتولگی و زنی جدایه IR-North1 ، B جدایه زنی مایه از ناشی رشد کاهش : IR-North2 ، C مایه از ناشی کوتولگی و زردی : جدایه زنی IR-South2 ، . D و زردی عالئم : مایه از ناشی رشد کاهش جدایه زنی IR-South1 . Figure 2- Symptoms of CTV isolates on healthy sour orange seedlings three months after inoculation. A: Leaf chlorosis and severe stunting caused by inoculation with IR-North1isolae, B: Growth reduction caused by inoculation with IR-North2 isolate, C: Yellowing and stunting caused by inoculation with IR-South2 isolate, D: Symptoms of yellowing and growth reduction caused by inoculation with IR-South1 isolate. توالی نتایج داده و یابی آمده بدست های تتوالی از حاصتل خام خوان تعداد کتابخانته یتابی IR-North1 ، 5689557 پتازی از پتس حاصتل نهتایی ختوان تعداد که بود باز خوان ها 3860046 تتوالی از بتود بتاز کتابخانته یتابی IR-North2 2798702 پازی از پس که آمد .بدس خام خوان باز 234833 باز توالی حاصل خام خوان تعداد شد حاصل کتابخانه یابی IR-South1 کتابخانه و IR-South2 بته ترتیتب 5446649 و 1906835 بتود بتاز خوان کتابخانته دو پتازی از پتس نهایی های IR-South1 و IR- South2 به ترتیب 3443895 و 1305760 درصد بود GC هر برای 4 کتابخانه 44 % بود بازسازی کامل ینوم طول جدایه برای شده های IR- North1 ، IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 بتتتته ترتیتتتتب 19296 ، 19302 ، 19252 و 19251 جدایه بود نوکلئوتید های تتوالی - یتتتابی تمارهای تشتت رس بتتتا شتتتده OR192037 ، OR192038 ، OR192039 و OR192040 بانک در شدند .ب ین A B C D
- 9. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 245 جدایه سویه تعیین ها جدایتتته در IR-North1 آغازگرهتتتای DDE و SSP امکتتتان همانندسازی آغازگر ولی داشتند را نظر مورد قطعه P27 اتصال امکان قطعات .نداش را ینوم به 235 و 816 محل ااقد بترتیب نوکلئوتیدی آنزیم های برشتی DdeI و SspI ( بودنتد جتدول 2 ، شتکل 3 نتتایج ) همردی قطعه سازی 78 جدایه که داد نشان نوکلئوتیدی IR-North1 گروه از T36 ( .اس شکل 3 جدایه بنابراین ) IR-North1 مشخصات ( سریع زوال سویه با مشابهی نتژاد T36 شتمار رس ، U16304 دارد ) جدایه در هتای IR-North2 ، IR-South1 آغازگرهتای P27 و DDE همانند امکان سازی آغازگر ولی داشتند را نظر مورد قطعه SSP امکان همانندسازی قطعه 816 قطعه .نداش را نوکلئوتیدی 235 نوکلئوتیدی برشی آنزیم محل دارای جدایه دو هر در DdeI ( بود جدول 2 ، شتکل 3 همردی نتایج بعالوه ) قطعه سازی 78 کته داد نشتان نوکلئوتیتدی گروه اعضای با مشابه جدایه دو این VT/T3 جدایته بنتابراین هستند های IR-North2 ، IR-South1 از نژاد ساقه مولد های آبله زردی و ای سویه با مشابه و نهالچه SY ( سویه AB046398 ستویه و ) T318A ( DQ252548 هستند ) جدایه در IR-South2 آغازگرهای P27 ، DDE و SSP ب ه ترتیب همانندستازی امکان قطعتات 78 ، 235 و 816 قطعته داشتتند را 235 برشی آنزیم محل دارای نوکلئوتیدی DdeI قطعه و 816 نوکلئوتیتدی برشی آنزیم محل ااقد SspI ( بود جدول 2 ، شتکل 3 نتتایج بعتالوه ) همردی سازی قطعه 78 ایتن کته داد نشتان جدایته این نوکلئوتیدی گروه به متعلق VT/T3 .اس ( شکل 3 جدایته بنابراین ) IR-South2 از نیز نژاد ساقه مولد های آبله ستویه با مشابه و نهالچه زردی و ای T3 ( EU857538 .اس ) اقدا برشی آنزیم محل ن SspI جدایه در های IR-North1 و IR- South2 قطعه در 816 نشتان نوکلئوتیدی ایتن کته .است آن دهنتده جدایه سویه از ها های خای CTV در بعتالوه شتوند نمتی محستوب قطعه توالی 78 جدایه از یک هیچ در نوکلئوتیدی توالی های شتده یابی گروه در شده الحاق نوکلئوتید ش T30 .نداش وجود نوکلئوتیدی شباهت نوکلئوتیتدی .شتباه ماتریکس در جدایته هتای CTV طتول در بین ینوم کامل 5 / 77 - 2 / 95 ( داشتند .شباه درصد جدول 3 میتزان ) ین نوکلئوتیدی .شباه های RdRp ، p65 جدایته پوششتی پروتئین و های CTV محتدوده در ترتیتب به 7 / 95 - 7 / 77 ، 97 - 3 / 85 و 6 / 96 - 4 / 91 به .شباه میزان آمینواسیدی سطح در و بود درصد بتین ترتیتب 1 / 94 - 6 / 80 ، 9 / 93 - 88 و 4 / 96 - 4 / 92 ( بود درصد جتدول 3 جدایته ) IR-North1 ترتیب به ینوم کامل طول در 78 % ، 9 / 77 % و 5 / 77 % با جدایتته هتتای IR-North 2 ، IR-South1 و IR-South 2 .شتتباه .داش شکل 3 - قطعه همردیفی 78 شامل نوکلتوتیدی 25 ژن ناحیه انتهای نوکلئوتید p27 ژن ژنی بین ناحیه ابتدای و های p27 و p25 جدایه در های توالی یابی سویه و شده رفرنس های CTV جدایه ژنوتیپی گروه تعیین برای های توالی ایرانی یابی شده Figure 3- Alignment of a 78-nucleotide fragment containing the 25 nucleotides at the end of the p27 gene and the beginning of the intergenic region between p27 and p25 genes in the sequenced strains and reference strains of CTV for determining the genotypic group of Iranian CTV strains
- 10. 246 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402 جدول 2 - سویه تفکیک های همانندسازی از استفاده با مرکبات تریستزای ویروس ژن بین ناحیه های Cp و Cpm واکنش در مختلف آغازگرهای با شبیه و مجازی مراز پلی ای زنجیره سازی همانندسازی قطعه آنزیمی هضم برشی آنزیم با شده Table 2- Differentiation of Citrus tristeza virus strains using in silico amplification of the intergenic region between Cp and Cpm genes with different primers and virtual enzymatic digestion of the amplified fragment with the restriction enzyme جدایه/سویه Strain/Isolate شمار رس Accession No. واکنش محصول مراز پلی ای زنجیره مجازی Virtual PCR product مجازی آنزیمی هضم Virtual enzymatic digestion شماره آمینه اسید 124 پروتئین در پوششی Amino acid at position 124 in coat protein P27 primer DDE primer SSPI primer DdeI SspI T30 AF260651 78 235 825 NF 197-628 Tyrosine VT EU937519 78 234 NF 80-154 NF Phenylalanine T3 EU857538 78 234 NF 80-154 NF Phenylalanine SY AB046398 78 234 NF 80-154 NF Phenylalanine T36 U16304 NF 235 816 NF NF Phenylalanine IR-North1 NF NF 235 816 NF NF Phenylalanine IR-North2 NF 78 234 NF 80-154 NF Phenylalanine IR-South1 NF 78 234 NF 80-154 NF Phenylalanine IR-South2 NF 78 234 816 80-154 NF Phenylalanine NF: not found جدایته .شتباه IR-North 2 جدایته دو بتا IR-South1 و IR- South2 ترتیب به نیز ینوم کامل طول در 2 / 95 % و 4 / 89 % ینوم بود جدایته دو IR-South1 و IR-South 2 یکتدیگر بتا 3 / 90 % .شتباه جدایه .داش IR-North1 جدایته با را .شباه بیشترین U16304 از میزان به الوریدا 3 / 96 % حال در .داش جدایه .شباه بیشترین یکه IR- North 2 جدایه با AB046398 میزان به یاپن از 5 / 97 % جدایه بود IR-South1 تا تب 6 / 97 % تهتجدای و IR-South2 تا تب 6 / 96 % تترین تبیش بتته را .شتتباه ستتویه بتتا ترتیتتب T318A شتتمار (رس استتپانیا از DQ151548 جدایتته و ) T3 شتتمار (رس نیوزیلنتتد از EU857538 ) در داشتند جدایته ایرانتی هتای CTV جدایته ، IR-North1 کمتترین ( .شباه 5 / 77 % جدایته بتا را ) هتای MK033511 و GQ454869 از جدایه .داش هاوایی و جنوبی آاریقای IR-North2 .شباه کمترین ( 5 / 77 % جدایه با را ) AY340974 جدایه و مصر از های IR-South1 و IR-South2 بت را نوکلئوتیتدی .شباه کمترین ه میتزان بته ترتیتب 4 / 78 % و 1 / 78 % جدایه با های AY340974 و U16304 داشتند فیلوژنی تحلیل و تجزیه سته ،ینتوم کامتل طتول اساس بر شده ترسیم ایلوینی .درخ در نام به شاخه های گروه VT گروه ، T68 گروه و T36 بتوت .حمایت با ( بود شناسایی قابل باز استر شتکل 4 جدایته سته ) IR-North2 و IR-South1 و IR-South2 جدایته با همراه ،استپانیا ،یاپتن از هتایی گروه در تایلند و نیوزیلند ،الوریدا ،برزیل VT جدایته و IR-North 1 جدایه با همراه هایی آاریقای ،هاوایی ،مصر ،الوریدا از برزیتل و جنوبی گروه در T36 ک طول در گراتند قرار گروه .شباه ینوم امل T36 بتا گروه دو VT و T68 بته نوکلئوتیدی سطح در ترتیتب 5 / 6 ± 5 / 85 و 57 / 6 ± 86 گتتروه بتتود درصتتد VT گتتروه بتتا نیتتز T68 ستتطح در نوکلئوتیدی 8 / 4 ± 3 / 88 .داش .شباه موتیف تحلیل و تجزیه چاارچو در شده حفاظت های هاای ژنی جدایه چهار CTV توالی ا در شده یابی جدایته هماننتد ،تحقیق ین مرجع CTV دارای 12 ( بودند ینی چارچوب شکل 5 ) ینی چارچوب ORF1a بطول 9374 نوکلئوتیتد پتروتئین رپلیکتاز ویروس را کنتد متی رمزگتذاری متیتل ناحیته سته پتروتئین ایتن در ( ترانساراز MTR ،) Zemlya ( هلیکاز و HEL ) دا وجتود ( .شت شتکل 5 ) آمینه اسید از های 1036 تا 1370 شت ترانستاراز متیل ناحیه در جدایه در موتی چهار در که شد .یاا موتی های IR-North2 ، IR- South1 و IR-South2 تاتاوت رارنس جدایه به .نسب هتایی وجتود ( .داش شکل 5 ، جدول 4 در ) موتی MTR I جانشتینی N1075M ، موتی در MTR IIa جانشینی سه I1157V ، Y1162F و E1165D موتی در ، III جانشینی I1185V موتیت در و MTRIV جانشتینی C1246Y در جدایه سه IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 و جانشینی R1248C جدایه در IR-South2 شتد مشتاهده موتیت در های MTR Ia و MTR II جدایه توالی های مرجع جدایه با شده یابی آمینه اسید نداشتند وجود تااوتی های 1707 تا 1812 ناحیه Zemlya بود بازساز در که ی غشاها ی آندوپالسم شبکه آلودگی طی در ی نقت دارد ( Gushchin et al., 2017 دارای و ) ت تموتی تار تچه .ت تاس در موتی Zemlya aA جانشتینی هتای L1708M و L1718S هتر در چهار جدای جانشتینی و ه I1716M سته در جدایت ه IR-North1 ، IR- North2 و IR-South1 شد مشاهده
- 11. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 247 جدول 3 - پروتئین آمینواسیدی شباهت میزان های جدایه شده رمزگذاری ایرانی های CTV مر نژادهای و یکدیگر با مرکبات تریستزای ویروس جع Table 3- Similarity of the encoded protein amino acids of Iranian CTV strains with each other and reference strains of Citrus tristeza virus 3'UTR P23 P20 P13 P18 P25 P27 P61 P65 P6 P33 RdRp polymerase 5'UTR Full length شمار رس Accession number جدایه/سویه Strain/Isolate 98.5 96.7 96.9 99.7 99.2 99.7 98.2 98.3 98.2 99.4 96.4 97 95.9 100 97 U16304 T36 IR-North1 96 87.8 87.8 91.1 92.7 92.6 87.7 86.8 87.6 87.8 82.5 78.3 70.2 68 78.5 EU937519 VT 96.3 88.6 88.7 90.3 92.5 92.6 88.5 86.1 87.2 87.2 82.2 78 70.6 63.5 78.7 AB046398 SY 96 88.9 88.5 90.8 91.9 92.6 87.6 86.3 87.5 87.2 82.9 78.4 70.4 61.9 78.7 DQ151548 T318A 96 87.8 88.2 90.6 92.3 92.6 86.7 86.8 87.4 87.8 81.7 77.8 70.1 71.2 78.4 EU857538 T3 95.6 87.8 87.4 91.1 94.6 92.9 92.1 93.3 92 88.5 81.7 77.1 70.2 54.8 79.6 AF260651 T30 95.6 87.1 88.9 89.2 92.1 92.6 88.4 85.5 86.6 87.2 81.3 77.7 70 62.5 78 - IR-North2 96 88.7 87.8 90.8 91.1 91.4 87.6 85.8 85.9 87.2 81.5 77.6 69.9 61.9 77.9 - IR-South1 94.9 87.9 88 90 92.1 91.7 85.9 86 85.4 87.2 80.3 76.8 69.4 71.2 77.5 - IR-South2 97.1 90 89.6 88.9 92.5 92.7 88.5 86 87.8 87.8 83.2 79.4 71.6 63.5 79.4 U16304 T36 IR-North2 97.4 92.9 94.7 92.2 95.4 96.6 95.9 93.6 97.5 98.1 97.4 96.5 92.7 97.1 94.1 EU937519 VT 99.3 97.1 97.5 98.3 99.2 100 98.2 98.3 98.9 100 97.8 98.2 97.9 100 98.2 AB046398 SY 98.2 96 96.5 96.7 97.4 97.5 96.4 96.4 97.5 100 96.2 97.2 95.5 96.2 96.1 DQ151548 T318A 97.4 92.1 94.4 91.1 95.6 96.4 93.6 93.1 96.9 98.1 88.7 90.1 88.5 81.1 91.1 EU857538 T3 97.1 86.7 91.6 89.2 93.5 93 88.8 86.6 87.9 92.9 84.6 90.1 88.4 78.6 88.6 AF260651 T30 97.8 94.9 96 96.7 96.6 96.3 96.4 96.1 96 100 95.3 96.2 94.2 96.2 95.1 - IR-South1 94.9 91.1 93.8 91.1 95 95.5 93.2 92.6 95.1 97.4 86.5 88.8 86.4 81.1 89.4 - IR-South2 96.3 90 89.6 91.1 91.9 91.7 88.7 86.5 86.6 87.8 83.8 79.4 71.7 61.9 79.4 U16304 T36 IR-South1 97.4 92.1 94.9 94.7 94.8 94.9 95.7 94.2 96.2 98.1 94.7 96.6 94 97.4 94.7 EU937519 VT 97.8 95.4 96.9 98.3 97.4 96.3 98.1 96.9 96 100 95.8 96.9 95.2 96.2 96 AB046398 SY 98.9 96.5 97.8 100 99.2 98.8 100 98.8 97.4 100 97.6 98.1 98 100 98.2 DQ151548 T318A 97.4 91 94.5 93.6 94.8 95.5 95 93.8 95.6 98.1 88.6 90 89.3 85.8 91.4 EU857538 T3 96.3 86.3 91.4 90.8 92.3 91.5 89.6 86.9 86.7 92.9 84.9 89.9 89.2 78.8 88.9 AF260651 T30 94.9 90.5 94.2 93.1 94.6 96.3 93.6 93.6 95.5 97.4 86.8 88.8 87.7 85.8 90.3 - IR-South2 94.9 90.1 89.1 90.3 92.5 92 86.6 86.5 85.7 87.8 81.7 78.2 70.6 71.2 78.6 U16304 T36 IR-South2 97.4 95.6 96 97.8 97 97.3 96.5 96.7 95.4 98.1 87.8 89.7 90.1 90 91.4 EU937519 VT 95.6 92.7 94.9 92.2 95.6 95.5 93.9 93.3 95.4 97.4 87.5 89.4 87.2 81.1 90.3 AB046398 SY 96 92.5 94.7 93.1 95 95.4 100 93.6 95.7 97.4 88.2 89.4 87.9 85.8 90.7 DQ151548 T318A 97.4 97.6 98 99.4 99.4 99 98.2 98.6 97.5 99.4 96.9 97.5 96.5 100 97.3 EU857538 T3 96.3 88.1 89.6 89.4 92.5 92.6 87.4 86.8 86.6 94.2 83 88.7 87.3 75.7 87.7 AF260651 T30 موت سایر در ی ها ی ناحیته این در جدایته IR-North1 تتوالی بتا .نداشتت تاتتاوت مرجتتع موتیتت در Zemlya aB جانشتتینی هتتای V1736I ، R1744A ، F1753Y و L1754C جدایتتته ستتته در IR- North2 ، IR-South1 و IR-South2 جانشینی و هتای A1739R و A1746P جدایه در IR-North2 موتیت در شتد ردیتابی Zemlya aC جانشینی T1769A ، R1779E و P1780A جدایته سته هتر در IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 جانشتتینی .داشتت وجتتود R1779E ته تجدای در IR-North2 و R1779S ته تجدای در تای ته S1 و S2 جتایگزینی موتیت ایتن در همچنین .داش وجود VSMVL بته CKYGV .ت تموقعی در 1778 - 1774 ته تجدای در IR-North2 ت توج ود موتی در .داش Zemlya aD جانشینی ، هتای A1789G ، I1806V و L1807F جدایته سه در IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 تینی تجانشتت و V1802I تهتجدایتت دو در IR-North2 و IR-South1 شد ردیابی امینته اسید 2984 - 2716 .هات حتاوی و هلیکتاز ناحیته ت تموتی در ته تک تود تب ت تموتی تای ته HEL I ، HEL Ia و HEL IV جدایه توالی های یابی شده نداشتند تااوتی مرجع جدایه با حالی در کته موتی در های HEL II ، HEL III ، HEL V و HEL VI بته ترتیتب جانشینی هتای I2803V ، K2825R ، R2951K و V2974T سته در جدایه IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 .داش وجود
- 12. 248 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402 شکل 4 - فی درخت جدایه کامل ژنوم نوکلئوتیدی توالی از استفاده با شده ترسیم لوژنی های توالی ایرانی یابی شده جدایه کامل ژنوم و های CTV ژن بانک در موجود روش به .درخ رسم Maximum likelihood نوکلئوتیدی جایگزینی مدل با و Tamura-3- parameters تکرار با 500 بست در استر بوت آزمون در نرم ه اازاری MEGA7 جدایه مشخصات و شمار رس .اس شده انجام های CTV جدول در ین بانک در موجود 1 جدایه .اس شده ذکر های توالی یابی با تحقیق این در شده ▲ داده نشان شده اند Figure 4- A phylogenetic tree drawn using the nucleotide sequences of complete genomes of Iranian strains and complete genomes of CTV strains available in the gene bank The tree was constructed using the Maximum Likelihood method and the Tamura-3-parameters nucleotide substitution model with 500 bootstrap replicates in the MEGA7 software package. The accession numbers and characteristics of the CTV strains available in the gene bank are listed in Table 1. The sequenced strains in this study are indicated by▲ شکل 5 - پروتئین در موجود شده محافظت نواحی و ژنومی سازمان از شماتیک تصویر های بوسیله شده رمزگذاری CTV تغییر و مشخصات جدایه در شده .محااظ نواحی در های ایرانی CTV در جدول 4 .اس شده ذکر Figure 5- Schematic representation of the CTV genome organization and the conserved motifs found in CTV-encoded proteins The characteristics of the motifs and variation of amino acids in conserved regions in Iranian CTV isolates are shown in Table 4.
- 13. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 249
- 14. 250 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402
- 15. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 251
- 16. 252 نشریه پژوهش های حفاظت ایران گیاهان جلد ،)کشاورزی صنایع و (علوم 37 شماره ، 3 ، پاییز 1402 با رپلیکاز ن 499 رمزگذا را آمینه اسید می ری .هشت حتاوی کنتد متی شده .حاات موتی ( باشتد شتکل 5 ) موتیت در RdRp III در ته تجدای IR-South2 تینی تجانش V180I و تینی تجانش I193V ته تس در تهتجدایت IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 .ت تداشت تود توجت موتی در همچنین RdRp VI آمینته استید جانشتینی سه D296E ، V300I و S310K در این جدایه سه موتیت ستایر در .داشت وجود جدایه رپلیکاز های نداشتند تااوتی مرجع جدایه با ها تارچوب تچ ته تب تدی تبع تی تین تای ته ین تب تترتی p33 تول تط ته تب 909 طول به پروتئینی نوکلئوتید 302 ین و ،آمینه اسید p6 طتول بته 156 بتا پروتئینی نوکلئوتید 51 رمرزگت را آمینته استید متی ذاری کته کننتد موتی نشد ردیابی ین دو این در شده .حاات های ینی چارچوب p65 به طول 1785 پروتئین ،نوکلئوتید hsp70h بتا 365 رمزگتذاری را شتده .حااتت موتی .هش دارای که آمینه اسید می ( کنتد شتکل 5 جانشتینی ) هتای I168V ، M170L و S174T در ت تموتیت B ، S227G و K239R ت تموتیت در D تینی تجانشت و تای تهت A247T ، I380 و S458R به موتیت در ترتیب هتای E ، F و H سته جدایه IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 جانشینی ، T384S جدایتته در هتتای IR-North2 و IR-South2 جانشتتینی ، R374K در موتیتت F جدایتته IR-South1 ، I380T موتیتت در G جدایتته IR- North2 جانشتینی و S393T جدایته در IR-South2 شتد ردیتابی موتی A و C جدایه ( بودند مرجع توالی با مشابه ها جدول 4 ) ینی چارچوب p61 طتول به 1608 بتا پروتئینتی نوکلئوتیتد 484 متی رمزگتذاری را آمینه اسید پتروتئین همولتوگ پتروتئین ایتن کنتد HSP90 بتا شتده .حاات طویل موتی دو دارای و 73 و 143 استید موتی در .اس آمینه I جانشتینی پنج M278V ، V282T ، I284G ، Q313H و Y316H جدایه سه در IR-North2 ، IR-South1 و IR- South2 تینی تجانشت ، N298Q ته تجدایت در تای تهت IR-North2 و IR- South2 جانشینی و D321E جدایه در IR-South2 داش وجود در . موتی II پروتئین p61 جانشینی A348E هر در 4 توالی جدایه یتابی ،تده تش 12 تابه تمش تینی تجانش R333N ، M350L ، V356I ، V360A ، V364A ، P369A ، S387L ، A395T ، V409I ، R431K ، V455I و T461D جدایته سه در IR-North2 ، IR-South1 و IR-South2 ، جانشتتتتتینی دو Q375R و S379N در IR-North2 ، IR-South1 ، جانشتتتینی V361A در IR-South2 جانشتتتینی و هتتتای C386A ، N427I و L428F در IR-North2 جانشتتتینی پتتتنج بتتتود داده ر G344D ، R372N ، H389R ، G391S و E419K جدایه دو در IR- North2 ، IR-South1 در و تابه تمش IR-South2 تورت تبص G344N ، R372H ، H389G ، G391T و E419S ( بود جدول 4 ) ینی چارچوب P27 بطول 723 کوچک پروتئینی پوش نوکلئوتید ( CPm با ) 190 می رمزگذاری را آمینه اسید موتیت نته دارای که کند ( .اس شده .حاات شکل 5 جانشتینی ) هتای H67Q در CPm box ، T95A ، Y102C موتیتتت در IV و S196T ستتته در جدایتتته IR- North2 ، IR-South1 و IR-South2 جانشتتینی بتتود مشتتابه هتتای F154C موتیتت در V ، S198P و Y202S موتیتت در VII در IR- North2 و IR-South2 جانشتتینی و ، هتتای T157S موتیتت در V ، L190F موتی در VII و A219T موتی VII جانشتینی و M96V و T103S موتیتت در IV جدایتته در تنهتتا IR-North2 جانشتتینی F154Y و T157A موتیتتت در V جدایتتته در تنهتتتا IR-South1 تینی تجانشت G45S ت تموتیت در CPm Box و I139M ، E146D و M165T موتی در V در اقش IR-South2 هتیچ بتود ااتتاده اتااق ت تموتی در تینی تجانش تای ته II ، III ، VI و IX توالی تت تد تنش تاهده تمش تیدی تآمینواس CPm ته تجدای در IR-North1 م ته تجدای توالی تت تا تب تابه تش رارنس CTV بود ینتی چتارچوب P25 بطتول 672 رمزگتذاری نوکلئوتیتد پوشت با پروتئینی 194 متی انجتام را امینه اسید پروتئینتی پوشت در دهتد CTV ( .داشت وجتود شتده .حااتت موتیت .ها شتکل 5 چهتار ) مشابه جایگزینی T41A ، H68Y ، A100T و D208E در ترتیتب به موتی هتای I ، II ، III و VII جدایته سته هتر در IR-North2 ، IR- South1 و IR-South2 جدایته در شد مشاهده هتای IR-North2 و IR-South1 موتی در I جانشینی V31L موتی در و IV جانشتینی T142S آمینه اسید در جانشینی بود 49 موتی در II جدایته در هتای IR-North2 و IR-South2 بصورت S49G جدایته در درحالیکه IR- South1 بصورت S49T آمینته اسید در همچنین بود 80 موتیت در III جدایه در نیز های IR-South1 و IR-South2 جانشتینی I80K و در IR-North2 جانشینی I80L جانشینی بود داده ر های I35T در موتی I ، P69S موتی در II و V122I موتی در IV بته کتدام هر جدایته از تنها ترتیب هتای IR-South1 ، IR-North2 و IR-South2 جانشینی شدند ردیابی I40V موتیت در I ، S91G موتیت در III و T133P موتی در IV جدایه دو در تنها نیز اارس استان در شد دیده موتی V و VI جدایه در جایگزینی هیچ توالی های ر شده یابی دیتابی ( نشتد تدول تج 4 ته تجدای تی تپروتئین پوشت تیدی تآمینواس تتوالی ) IR- North1 تعتمرج تویهتس پروتئینتتی تتباپوش CTV تدتااق و تانتیکس بود جایگزینی پروتئینتی پوشت ین از پتس ،تریستتزا ویروس ینی سازمان در به بزرگ ین ترتیب های p18 ، p13 و p20 می قرار که گیرند هرکتدام به ترتیب 504 ، 360 و 549 پتروتئین و دارنتد طول نوکلئوتید بتا هتایی 504 ، 360 و 549 اسید می رمزگذاری را آمینه پتروتئین در کنند هتای نشد مشاهده شده شناخته شده .حاات موتی ین سه این ینی چارچوب p23 با 630 با پروتئینی نوکلئوتید 209 آمینته اسید متی رمزگذاری را کنت پتروتئین نقت د p23 ،ین خاموشتی بازدارنتده
- 17. ،همکاران و روحانی جدایه فیلوژنتیکی تحلیل و کامل توالی تعیین ،عالیم مقایسه مرکبات تریستزای ویروس های … 253 تنظیم سنتز کننده RNA القای و نارنج در سیستمیک آلودگی اازای ، گریتپ و نتارنج در گیاهچته زردی ستندروم ( اتروت Flores et al., 2013 شتده .حااتت ناحیته یتک دارای پتروتئین این .اس ) RNA binding م یک حاوی و وتی Zinc finger ( .اس شکل 5 بررستی ) شتده .حااتت ناحیته در که داد نشان پروتئین این آمینواسیدی توالی RNA binding جدایتته IR-South2 جانشتتینی N53T و V69M .موقعی در نیز متوالی جانشینی سه .اس ااتاده اتااق 78 - 80 شتامل G78A ، L79S و K80R ج سه در دایه IR-South1 ، IR-North2 و IR-South2 .داش وجود نوترکیبی تحلیل و تجزیه جدایه در احتمالی نوترکیبی وقوع بررسی ایرانی های CTV نشان جدایتتته کتتته داد هتتتای IR-North1 ، IR-North2 و IR-South1 ( هستند نوترکیب شکل 6 ) جدایتته در IR-North1 قطعتته 1426 .موقعیتت در نوکلئوتیتتدی 12712 تا 14138 ین شامل نوترکیب ناحیه بود نوترکیب های p65 (hsp70) و p61 ینوم در CTV ( .اس جدول 5 ، شکل 6 قطعته این ) ( مصری سویه نوترکیبی حاصل Qaha شمار رس ، AY340974 بته ) والد عنوان سویه و اصلی T36 ( U16304 به ) .اس ارعی والد عنوان جدایه در IR-North2 قطعته نیتز 773 .موقعیت در نوکلئوتیتدی 106 تا 879 ( شد شناسایی نوترکیب رپلیکاز ین جتدول 5 ، شتکل 5 ) ( یاپنتی جدایته بین نوترکیبی حاصل قطعه این NUagA شتمار رس ، AB046398 بتته ) و اصتتلی تد توالت توان تعنت تژاد تنت VT تمار تشت (رس KC517494 به ) جدایته در .اس ارعی والد عنوان IR-South1 نیتز بطول رپلیکاز ین در نوترکیبی یک 2444 .موقعی در نوکلئوتید 3974 تا 6418 ( شد ردیابی جدول 5 ، شکل 5 نتوترکیبی حاصل قطعه این ) بین نژاد VT شمار (رس EU937519 به ) و اصلی والد عنوان نژاد های SY568 شمار (رس AF001623 و ) VT شتمار (رس EU937519 ) به جدایته در نتوترکیبی هتیچ .است ارعتی والتد عنوان IR-South2 نشد شناسایی شکل 6 - نوترکی وقوع محل از شماتیک تصویر جدایه ژنوم در بی ایرانی های CTV شاخص در نوترکیب قطعه های جدول 5 .اس شده ذکر Figure 6- A schematic representation of the recombination event location in the genome of Iranian CTV strains The breakpoints of the recombination fragment are listed in Table 5. جدول 5 - جدایه ژنوم در شده شناسایی نوترکیب قطعه مشخصات ایرانی های CTV Table 5- Characteristics of the identified recombination fragment in the genome of Iranian CTV strains معناداری آماری pValue ردیابی روش Detection methods والدین Parents موقعیت Position طول length فراوانی Frequency جدایه Isolate کمکی Minor اصلی Major 2.23E-05 R.G.B.M.C.S.Se U16304.1 NC001661 AY340974 12712- 14138 1426 2 IR-North1 1.37E-10 R.G.B.M.C.S.Se KC517494 AB046398 106-879 773 5 IR-North2 9.39E-06 R.G.B.M.C.S.Se AF001623 EU937519 EU937519 KJ790175 MK491895 MW689620 3974-6418 2444 4 IR-south1 Abbreviations used for recombination detection programs; R: RDP, G: GENECONV, B: Bootscan, M: Maxchi, C: Chimaera, S: SiSscan, P: PhylPro, Se: 3Seq. Recombination-detecting programs representing significant signal showed in bold; (c): The greatest P- value calculated by the program for the recombination event. The highest reported P-value for the program showed in underlined in RDP4.