1. 1
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza
Predavanja iz Kliničke enzimologije
Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska
biohemija
Školska 2014/2015. godina

2. 2
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza
Ciljevi predavanja:
• Uloga i karakteristike enzima
• Distribucija enzima u organizmu
• Izoenzimi i izoforme
• Klinički značaj
• Analitika enzima i izoenzima ALP
• Preanalitičke varijacije
• Referentne vrednosti

3. 3
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza
• Skraćenica: ALP alkaline phosphatase
• Enzimski broj: (EC 3.1.3.1; ortofosfatna-monoestar fosfohidrolaza (alkalni
optimum);
• Mala supstratna specifičnost
– Katalizuje alkalnu hidrolizu velikog broja različitih prirodnih i sintetičkih supstrata.
– Katalizuje hidrolizu estarske veze monofosfata pod alkalnim uslovima (pH 8-10)
uz oslobañanje alkohola ili derivata fenola
• Distribucija enzima u organizmu
– ALP je membranski enzim (ektoenzim) prisutna u velikom broju organa, a pre
svega onim sa apsorptivnom ili sekretornom funkcijom
– vezana za površinski deo ćelijske membrane u mukozi intestinuma i
proksimalnim izuvijanim cevčicama tubula bubrega, kostiju (osteoblastima), jetri
(kanikulima) i placenti.

4. 4
Alkalna fosfataza u jetri se
nalazi i na membranama
sinusoida i na kanikularnim
membranama
Lokalizacija enzima u hepatocitima

5. 5
Mitohondrije
Lizozimi
Golñijev
kompleks
Glatki endoplazmatični
retikulum
Zrnasti endoplazmatični
retikulum
LokalizacijaLokalizacija enzimaenzima uu hepatocitimahepatocitima
MembranskiMembranski enzimenzim
AST, GDH
ALT, LAP,AST, GDH, LD
ALP, GGT, 5-NTP
Citoplazma

6. 6
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza
• Distribucija enzima u organizmu
• Široko rasprostranjena
• Najviši nivoi alkalne fosfataze se nalaze u:
• intestinumu
• jetri
• kostima (osteoblastima)
• bubrezima
• placenti
• slezini
• Sintezu alkalne fosfataze kodiraju četiri različita gena i to za: tkivno
nespecifičnu alkalnu fosfatazu TNALP, intestinalnu, placentarnu
alkalnu fosfatazu i placentarnom nalik izoenzimu.

7. 7
Distribucija alkalneDistribucija alkalne fosfatazefosfataze uu organimaorganima
IzoenzimiIzoenzimi ii izoformeizoforme
• ALP se javlja u multiplim formama, pri čemu su neki pravi izoenzimi,
kodirani sa posebnim genskim lokusima
Izoenzimi
• Tkivno nespecifična alkalna fosfataza hromozom 1
• Intestinalna hromozom 2
• Placentalna hromozom 2
• ALP nalik placentalnoj hromozom 2
• ALP fetalna intestinalna hromozom 2
Tumori produkuju izoenzime- neoplastične izoenzime
• placentarnu ALP, fetalnu intestinalnu ALP i placentarnoj nalik ALP

8. 8
Distribucija alkalneDistribucija alkalne fosfatazefosfataze uu organimaorganima
IzoenzimiIzoenzimi ii izoformeizoforme
Izoforme nastaju post-translacionim modifikacijama
Izoforme
• Tkivno nespecifična alkalna fosfataza 3 izoforme
– Jetrena
– Koštana
– Bubrežna
• Ove forme su N-glikozilirane i samo jetrena ALP ne sadrži 0-vezane
glikane.
.
Izoforme: koštana, jetrena i bubrežna forma ALP imaju istu uobičajenu
primarnu strukturu, ali se razlikuju po sadržaju ugljenih hidrata

9. 9
Genetsko porekloGenetsko poreklo izoenzimaizoenzima alkalnealkalne fosfatazefosfataze
Neoplastični izoenzimi:
Regan, Kasahara i Nagao

10. 10
Svojstva alkalneSvojstva alkalne fosfatazefosfataze
• ALP je vezana za spoljašnju ćelijsku membranu sa glikozil-fosfatidilinozitol
(GPI) kao sidrom (vezom)
• Ektoenzim
• Serumska ALP je homodimerni enzim
– GPI se uklanja dejstvom endogene ili egzogene (serumske) GPI-
specifične fosfolipaze D.
– Kidanje ovih veza sa membranom može uzrokovati nastanak dodatnih
izoformi

11. 11
MultipleMultiple forme alkalneforme alkalne fosfatazefosfataze
• Koštana ALP se dalje može razdvojiti sa jonoizmenjivačkom HPLC
ili izoelektrofokusiranjem u četiri forme:
– BI; B1x; B1 i B2
– Razlikuje se meñusobno u sadržaju sijalinske kiseline
• Koristeći isti postupak jetrena ALP je razdvojena na 3 izoforme.
• Placentarna alkalna fosfataza – aloenzimi

12. 12
Uloga alkalneUloga alkalne fosfatazefosfataze u humanom organizmuu humanom organizmu
• Dugo vremena se nije znala tačna metabolička uloga alkalne
fosfataze.
• Predpostavka da ona ima dvostruku ulogu u našem organizmu:
1. Alkalna fosfataza na neki način vezana je za transport lipida u
intestinumu, pre svega masnih kiselina, ali i kalcijuma i fosfata
Intestinalni izoenzim
Hipoteza: ALP vrši defosforilaciju metabolita i tako olakšava
njihov prolaz kroz selektivno permeabilnu membranu
2. Novija saznanja ukazuju na ulogu koštane alkalne fosfataze u
procesima remodelovanja kostiju tj. za procese kalcifikacije u
kostima.

13. Remodelovanje kostijuRemodelovanje kostiju
13

14. 14
Funkcija koFunkcija košštane alkalnetane alkalne fosfatazefosfataze
• Tokom mineralizacije kostiju glavna funkcija ALP je hidroliza
neorganskog pirofosfata (PPi) pri čemu se oslobaña fosfat Pi
• Vezikule matriksa su bogate NTALP
• Ravnoteža izmeñu Pi i PPI je kritično za mineralizaciju zato što
PPi inhibira stvaranje hidroksiapatita.
ALP ima ulogu u stvaranju hidroksiapatita
Hidrolizuje PPi koji nastaje dejstvom nukleozid trifosfat pirofosfohidrolaze iz NTP
ALP utiče na mineralizaciju kostiju tako što kontroliše inhibitorni pool PPi

15. 15
Funkcija koFunkcija košštane alkalnetane alkalne fosfatazefosfataze
• Ispitivanja su pokazala da je koštana alkalna fosfataza neophodna za
fazu propagacije ali ne i za inicijaciju mineralizaciju.
• Koštana ALP se produkuje u osteoblastima u toku faze maturacije kada
se novoforminari kolageni matriks priprema za deponovanje minerala.
• Pošto je ALP čvrsto vezana za membranu ćelije oslobañanje enzima je
produženo i povećanje u plazmi zahteva izvesno vreme.
Faze u razvoju osteoblasta
Rast ćelija i diferencijacija
Ekspresija gena

16. 16
Svojstva alkalneSvojstva alkalne fosfatazefosfataze
Aktivatori i inhibitori enzima
Uticaj metalnih jona
• Dvovalentni joni Mg2+, Co2+ i Mn2+ su aktivatori ovog enzima
• Zn2+ je konstitutivan elemenat enzima.
• Pravilan odnos Mg2+/Zn2+ je neophodan
da se izbegne zamena Mg2+ i održala
optimalna aktivnost enzima.
• Uloga serina u aktivnom centru ALP
Inhibitori ALP
• Fosfat, borat, oksalat i joni cijanida

17. 17
Svojstva alkalneSvojstva alkalne fosfatazefosfataze
Uticaj pH i pufera na aktivnost ALP
• Varijacije u Mg 2+ i u koncentraciji supstrata menjaju pH optimum.
• Tip prisutnog pufera (izuzev u niskim koncentracijama) utiče na brzinu
enzimske aktivnosti.
• Puferi se mogu klasifikovati kao:
1. inertni (karbonatni, barbitalni)
2. inhibirajući (glicinski i propilamin)
3. aktivirajući (2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), Tris hidroksi metil
aminometan (TRIS) i dietanolamin (DEA).
Aminoalkoholi deluju kao puferi jer vezuju H jone za azot ali i kao
akceptori fosfata i zato su aktivirajući.
Povećana aktivnost za 2-6X
Najveći stepen fosforilacije ima grupa : –Alkil-NH-C-C-OH

18. 18
Serumska alkalnaSerumska alkalna fosfatazafosfataza
• Alkalna fosfataza prisutna u serumu odraslih prevashodno
potiče od jetre i kostiju.
• Odnos 1:1
• Odnos ova dva izoenzima u serumu varira sa godinama.
Promene aktivnosti izoenzima
alkalne fosfataze
sa godinama

19. 19
Serumska alkalnaSerumska alkalna fosfatazafosfataza
• Minimalne količine intestinalne ALP takoñe mogu biti prisutne,
posebno u serumu osoba sa krvnim grupama O i B (one koje su
sekretori supstance krvnih grupa).
• Intestinalna ALP se može povećati posle jela i zato je treba
odreñivati isključivo natašte.

20. 20
KlirensKlirens alkalnealkalne fosfatazefosfataze
– Intestinalna alkalna fosfataza
• galaktozil ostaci reaguju sa galaktozil receptorima i vrlo
brzo se uklanja iz seruma
– Ostale alkalne fosfataze su sijalinizirane
(sijaloglikoproteini) i ostaju duže u plazmi
– Maligne ćelije produkuju ovu sijalo formu ALP i
duže ostaje u plazmi

21. 21
KliniKliniččki znaki značčaj alkalneaj alkalne fosfatazefosfataze
Odreñivanje aktivnosti alkalne fosfataze važno je kod oboljenja dva
organa (sistema):
• jetre
• koštanog sistema
Povišene vrednosti ALP se javljaju kod:
• Hepatobilijarnih bolesti
• Bolesti kostiju praćene povećanom aktivnošću osteoblasta
Snižene vrednosti ALP (retko)
• genetski defekti, deficijencija Zn
Fiziološki povećane vrednosti:
• Deca u pubertetu
• Trudnoća

22. 22
KliniKliniččki znaki značčaj alkalneaj alkalne fosfatazefosfataze
Značaj odreñivanja alkalne fosfataze u bolestima jetre
• ALP je prvi enzim koji je izučavan kod hepatičnih bolesti
• Opstrukcija žučnih puteva
• Uzroci povišenih vrednosti ALP
• oslobañanje membranski vezane alkalne fosfataze
• indukcija sinteze ALP u hepatocitima.
– Novosintetisani enzimi (neki) ulaze u cirkulaciju i povećavaju enzimsku
aktivnost u serumu.
– Povećanje je uočljivije (tri puta veće) kod ekstrahepatične opstrukcije
(kamenom, kancer glave pankreasa) nego kod intrahepatične opstrukcije i
veće je što je veća opstrukcija.
– Vrednosti ALP u serumu mogu dostići vrednosti od 10 do 12 puta od URL –
upper reference limit (gornje granice referentnog intervala)
– Vraćaju se na normalu nakon hirurškog uklanjanja opstrukcije
– Povišene vrednosti žučnih kiselina utiču na solubilizaciju i oslobañanje
membranski vezane ALP

23. 23
KliniKliniččki znaki značčaj alkalneaj alkalne fosfatazefosfataze
Značaj odreñivanja alkalne fosfataze u bolestima jetre
• Povećanje ALP kod primarnog kancera jetre i pojave metastaza u jetri.
• Bolesti jetre koje primarno oštećuju parenhimske ćelije, kao što je
infektivni hepatitis, tipično pokazuju umereno povećanje ALP (ispod 3
puta) ili čak ALP ostaje u normalnim granicama
• Povećanje se može javiti i kao odgovor na terapiju
• Intestinalni izoenzim alkalne fosfataze, koji je asijaloglikoprotein
normalno se uklanja pomoću odgovarajućih asijaloglikoprotein
receptora (galaktozil receptori), obično je povećana kod ciroze jetre

24. 24
KliniKliniččki znaki značčaj alkalneaj alkalne fosfatazefosfataze
• Alkalna fosfataza je normalno povećana 2-3 puta u serumu kod
trudnica u trećem trimestru
• Prisutan je izoenzim placentarnog porekla
• Ispitivanja su pokazala i postojanje familija sa benignim
povećanjem intestinalne alkalne fosfataze
• Prolazno benigno povećanje ALP je prisutno i kod dece sa
promenama koje su 10 puta veće od gornje granice.
– Povećanja i koštane i jetrene ALP.
– Promene su verovatno rezultat redukovanog uklanjanja ALP iz krvi
zbog prolaznih modifikacija enzimske glikozilacije.

25. 25
KliniKliniččki znaki značčaj alkalneaj alkalne fosfatazefosfataze
• Alkalna fosfataza kao tumorski marker
• Primenom elektroforetskih tehnika razdvajanja izoenzima ALP u
serumu otkriveni su forme enzima identične normalnom
placentarnom enzimu u serumu pacijenata sa malignim bolestima.
• Karcinoplacentarni izoenzimi (Reganovi izoenzimi) pojavljuju se
zbog de-represije placentarnog ALP gena.
– Identifikacija na osnovu termostabilnosti na 650 C.
• Pronañeno je da tumori produkuju ALP koja je modifikovana forma
neplacentarnih izoenzima (Kasahara izoenzimi).

26. 26
• Enzimi su produkti osteoblasta i osteoklasta
– Osteoblasti alkalnu fosfatazu
– Osteoklasti kiselu fosfatazu
• Biohemijski markeri remodelovanja kostiju
– Enzimski markeri stvaranja kostiju ALP
– Enzimski markeri razgradnje – resorpcije kostiju ACP
• Izoenzimi i izoforme markeri remodelovanja kostiju
– BALP Bone alkaline phosphatase Koštana alkalna fosfataza
– TRACP tartarat rezistentna kisela fosfataza
ZnaZnaččaj odreñivanja alkalneaj odreñivanja alkalne fosfatazefosfataze u bolestimau bolestima kostijukostiju
Enzimski markeri bolesti kostiju
AcPALP

27. 27
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza -- kokošštanatana izoformaizoforma
• Koštana, jetrena i bubrežna izoforma ALP su posttranslacione
modifikacije jednog te istog genskog produkta i identifikuju se na
osnovu specifičnog ugljenohidratnog sadržaja
• Koštana alkalna fosfataza se produkuje u osteoblastima gde se
nalazi u specifičnim vezikulama matriksa nastalih iz plazmatske
membrane
• Enzim je odličan indikator globalne aktivnosti stvaranja kostiju.
• Kod hipofosfatemije, retke nasledne bolesti genetski defekt je u
nesposobnosti produkcije tkivno nespecifične alkalne fosfataze, pa i
koštane ALP
• Posledica ove hipofosfatemije je teška bolest kostiju i nepravilni rast
kostiju

28. 28
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza -- kokošštanatana izoformaizoforma
Klinički značaj u bolestima kostiju
• Prednost korišćenja koštane alkalne fosfataze u serumu kao
markera formiranja kostiju u kliničkoj praksi su:
1. Mala diurnalna varijacija
2. Nema uticaja funkcija bubrega
3. Dug poluživot
4. Stabilnost u serumu i in vitro

29. 29
Meñu bolestima kostiju najviša aktivnost
se dobija kod Pagetove bolesti
(osteitis deformans)
kao rezultat dejstva osteoblastnih ćelija
koje pokušavaju da ponovo izgrade kost nakon
nekontrolisane aktivnosti osteoklasta.
Vrednosti su 10 do 25 X iznad URL
i to povećanje odražava težinu bolesti.
Rentgenski snimak
Osteolitička mesta na delu osteoklastne
resorpcije kostiju
Sklerotična mesta na delu aktivnosti
osteoblasta
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza uu PagetovojPagetovoj bolestibolesti

30. 30
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza -- kokošštanatana izoformaizoforma
• Koštana ALP je povećana u svim metaboličkim bolestima kostiju:
– Osteoporozi, osteomalaciji, rahitisu, primarnom i sekundarnom
hiperparatiroidizmu, renalnoj osteodistrofiji, tirotoksikozi, akromegaliji i
druge bolesti sa povećanom izgradnjom kostiju
– Osteogeni karcinom kostiju i metastaze kostiju
• Vrlo visoke vrednosti koštane alkalne fosfataze
– Osteoporoza blago povišenje ALP
• Inverzna korelacija sa gustinom kostiju
• Kod deficijencije vitamina D (osteomalacije i rahitisa) koncentracije su 2 do
4 puta veće od normalnih.
– vrednosti se vraćaju na normalu nakon tretmana.
• Prelomi kostiju: prolazna povećanja u toku zarastanja

31. 31
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza -- kokošštanatana izoformaizoforma
• Fiziološki rast kostiju dovodi do prolaznog povećanja aktivnosti koštane
ALP u serumu dece koja rastu.
– U serumu dece ALP je 1,5 do 7 puta veća nego kod odraslih zdravih osoba.
– Maksimum se pre postiže kod devojčica.

32. 32
AlkalnaAlkalna fosfatazafosfataza -- kokošštanatana izoformaizoforma
• Klinički značaj koštane alkalne fosfataze (BALP) u praćenju efekta terapije
Pošto je poluživot ALP relativno dug (približno 40 sati), manje senzitivan je
od prokolagen propeptida ili osteokalcina na akutno dejstvo lekova, kao što
su velike doze intravenskog metilprednizolona.
• Tokom teriparatidnog tretmana (rekombinovani parathormon), ALP nije
povećan kao što su povećani prokolagen iili osteokalcin.

33. 33
Svojstva koSvojstva košštane alkalnetane alkalne fosfatazefosfataze u poreñenju sau poreñenju sa
drugim markerima stvaranja kostijudrugim markerima stvaranja kostiju
• Koštana alkalna fosfataza je korisniji marker od osteokalcina kod pacijenata sa
oštećenim bubrezima zato što se ne eliminiše glomerularnom filtracijom.
• Vitamin D (1,25-dihidroksi vitamin D) reguliše sintezu koštane alkalne fosfataze i
osteokalcina
– oba ova parametra su promenjeni kod tretmana pacijenata sa kalcitriolom i
kod pacijenata sa povećanim abnormalnim koncentracijama ovih hormona.

34. 34
KliniKliniččki znaki značčaj alkalneaj alkalne fosfatazefosfataze
• Snižene vrednosti alkalne fosfataze
1. Malnutricija
• Deficijencija Zn, B6, folne kiseline i vitamina C
2. Hipofosfatemija
• Retko genetsko oboljenje
3. Drugi uzroci snižene aktivnosti ALP
• Hipotiroidizam
• Oštećenje paratiroideje
• B12 deficijencija (Pernicious anemia)
• Višak unosa vit D-intoksikacija
• Aplastična anemia
• Vilsonova bolest
• Deca sa ahrondoplazijom i kretenizmom and cretinism
• CML – Chronic Myelogenous Leukemia
• Menopause and anemia

35. 35
Alkalna fosfataza - intestinalna
• Uloga intestinalne alkalne fosfataze
• Protektivna uloga ?
• Reguliše pH intestinuma
• Utiče na apsorpciju lipida, detoksikaciju slobodnih nukleotida i bakterijskih
lipopolisaharida, smanjuje intestinalnu inflamaciju i na enterobakterije
(modulaciju)
• Uticaj nutritienata na intestinalnu ALP
• Protektivna uloga – defosforilacija proinflamatornih faktora i smanjenje
inflamacije ?
• Ispitivanja kod hroničnih bolesti GIT