1. AnalitiAnalitiččke metode separacijke metode separacijee ii
odreñivanjodreñivanjaa izoenzimaizoenzima
Predavanja iz Kliničke enzimologije
Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska
biohemija
Školska 2014/2015. godina
2. Razlike u osobinamaRazlike u osobinama multiplihmultiplih formiformi enzimaenzima
• Katalitičke razlike
– Izoenzimi sa multiplim genskim lokusima
• Km za supstrate se razlikuje
• Osetljivost na inhibitore
• Aktivnost sa analozima supstrata
– Izoenzimi nastali post traslacionim modifikacijama
• Slične katalitičke aktivnosti
• Antigenska svojstva
• Rezistencija na denaturaciju
– Toplotom
– Koncentrovanim rastvorima ureje
• Naelektrisanju molekule
– Zonska elektroforeza
– Jonoizmenjivačka hromatografaija
– Izoelektrofokusiranje
• Molekulskoj veličini
• Molekularno prosejavanje
• Gel filtracija
3. Metode separacijeMetode separacije izoenzimaizoenzima
• Elektroforetske
• Hromatografske
• Hemijska i temperaturna inaktivacija
• Kinetička svojstva
• Imunohemijske metode
4. ElektroforetskeElektroforetske tehnike u analizitehnike u analizi izoenzimaizoenzima
• Razne elektroforetske tehnike su u upotrebi za separaciju
izoenzima, ali generalno one se ne koriste rutinski zato što:
– dugo traju
– teško je kvantifikovati
– relativno su skupe
• Izoelektrofokusiranje se uspešno primenjuje za separaciju
izoformi koje se razlikuju samo u količini kovalentno vezanih
ostataka šećera, kao što je sijalinska kiselina.
5. • Jonoizmenjivačka hromatografija omogućava da se izoenzimske
molekule razdvajaju na osnovu naelektrisanja molekule pri odreñenom
pH
• Tipičan jonoizmenjivački materijal je DEAE celuloza u kojoj se
jonizabilne DEAE grupe vezane za matrix inertnu celulozu
• Jonoizmenjivačka hromatografija generalno ne razdvaja tako dobro
kao zonska elektroforeza vrlo slične proteine, ali zato se veće količine
proteina-enzima mogu razdvojiti sa dobrom enzimskom aktivnošću
– ova tehnika ima veliki značaj za prečišćavanje enzima
• Druge forme hromatografije se koriste za frakcionisanje izoenzimskih
smeša i to su HPLC i afinitivna hromatografija.
• Afinitivna hromatografija se zasniva na razlikama izoenzima u njihovom
afinitetu za specifične ligande koji su vezani za inertan nerastvoran
potporni nosač koji se koristi kao stacionarna faza u hromatografskoj
koloni
HromatografskeHromatografske tehnike u analizitehnike u analizi izoenzimaizoenzima
6. Hemijska i toplotnaHemijska i toplotna inaktivacijainaktivacija
• Selektivna inaktivacija izoenzima pod kontrolisanim uslovima
• Metoda se zasniva na razlikama u stabilnosti koja proističe iz malih
promena u strukturi proteinskih molekula.
• Denaturacija enzima:
– Povišena temperatura
– Koncentrovani rastvor ureje ili drugih reagenasa
• Brzina enzimske inaktivacije ovim agensima je kritično zavisna od
uslova eksperimenta.
• Uslovi se moraju strogo kontrolisati ukoliko se uzorci žele porediti
– Primer: razdvajanje izoenzima i izoformi ALP toplotnom inaktivacijom
7. KatalitiKatalitiččka svojstvaka svojstva izoenzimaizoenzima
Razlike u katalitičkim svojstvima izoenzima:
1. Razlike u vrednostima Km relativnim brzinama reakcija sa
analozima supstrata
– Kada specifičnost enzima omogućava varijacije u strukturi
supstrata
2. pH optimum
3. Uticaj inhibitora
- Razlike izmeñu izoenzima produkata multiplih genskih lokusa
• Razlike predstavljaju osnovu za metode identifikacije i merenja
odreñenog izoenzima
• Ove tehnike se generalno ne koriste rutinski i uglavnom su
zamenjene sa imunohemijskim metodama
8. ImunohemijskeImunohemijske metode odreñivanjametode odreñivanja izoenzimaizoenzima
• Imunohemijske metode analize izoenzima se praktično mogu primeniti za
izoenzime produkte multiplih genskih lokusa
– antigenski različiti izoenzimi
– Primena monoklonskih antitela je uvelo imunohemijske metode u odreñivanju
multiplih formi enzima jer je veća moć razdvajanja
• Dve vrste imunohemijskih metoda:
1. Merenje mase
2. Merenje aktivnosti
– Neke metode koriste katalitičku aktivnost izoenzima
– Na primer rezidualna aktivnost izoenzima se meri posle reakcije sa antitelima
• Radioimunoesej
– Kompeticija radioaktivno obeleženih izoenzima sa neobeleženim izoenzimima
za vezujuća mesta na antitelima
– Ne zavise od katalitičke aktivnosti odreñivanog izoenzima
• Automatizovane imunohemijske metode za merenje izoenzima
– uobičajene rutinske metode za merenje izoenzima
– primer: merenje masene koncentracije izoenzima CK-MB ELISA na čvrstoj fazi
9. ElektroforetskeElektroforetske tehnike razdvajanjatehnike razdvajanja izoenzimaizoenzima
Različiti potporni medijumi
• Razdvajanje na osnovu naelektrisanja
• Celuloza acetata
• Agaroza
• Razdvajanje na osnovu naelektrisanja i veličine
molekule
• Skrobni gel
• Poliakrilamidni gel
• Razdvajanje slično razdvajanju proteina seruma
10. Aparatura zaAparatura za elektroforetskoelektroforetsko razdvajanjerazdvajanje izoenzimaizoenzima
HorizontalnaHorizontalna elektroforezaelektroforeza
11. ElektroforetskiElektroforetski sistem za analizusistem za analizu izoenzimaizoenzima
VertikalnaVertikalna elektroforezaelektroforeza
Vertikalna elektroforezaSistem nanošenja uzoraka
14. Metode detekcije razdvojenihMetode detekcije razdvojenih izoenzimaizoenzima
• Hromogene metode bojenja
– Kisela fosfataza bojenje za fenolftalein fosfatom
• Fluorogene metode bojenja
– 4-metilumberiferil
– NADH i NADPH
• Radioaktivno bojenje
• Hemijsko bojenje derivatima alfa i beta-naftola
• Enzimske reakcije gde dolazi do prenosa elektrona
U upotrebi su dva sistema bojenje:
– MTT metil tiazolil tetrazolijum kao akceptor za dehidrogenaze
– 3-amino-9-etilkarbazol kao akceptor za oksidaze i peroksidaze
21. Dehidrogenaze
DetekcijaDetekcija reakcija sa transferom elektronareakcija sa transferom elektrona
U upotrebi su dve boje:
1. MTT metil tiazolil tetrazolijum akceptor za dehidrogenaze
2. 3-amino-9-etilkarbazol akceptor zaza oksidazeoksidaze ii peroksidazeperoksidaze
Reagens rastvor sadrži MTT i PMS (Fenazin metosulfat)
Redukcijom MTT donorom elektrona nastaje tamno plavi,
nerastvoran formazan
23. Boje sa transferom elektronaBoje sa transferom elektrona
3-amino-9-etilkarbazol akceptor za oksidaze i peroksidaze
24. Metode separacije iMetode separacije i kvantifikacijekvantifikacije izoenzimaizoenzima LDLD
1. Elektroforeza na agaroznom gelu i celuloza acetatu je metoda koje se
najčešće koristi za razdvajanje izoenzima LD
• Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom reakciona smesa se preliva
preko potpornog medijuma.
• Reakciona smesa: L-laktat 500 mmol/L, NAD+ 13 mmol/L, pufer pH 8,0.
Osloboñeni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje:
– fluorescencijom na UV 365 nm
– redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan.
Referentne vrednosti
• LD-1 4-26%
• LD-2 29-39%
• LD-3 20-26%
• LD-4 8-16%
• LD-5 6-16 %
