3. Kultur kalus
• membiakan sekelompok sel yg berasal dr jaringan
tanaman
• medium hara : an organik, sumber karbon (sukrosa),
auksin dan sitokinin
• zat hara hrs merangsang pertumbuhan sel dgn cepat
• keseimbangan auksin dan sitokinin dlm medium akan
menentukan pembentukan kalus
• Perubahan keseimbangan hormon akan menentukan arah
perkembangan kalus menjadi tunas atau akar
• sub kultru kalus biasanya 2 – 8 minggu
• kegunaan sub kultur utk mempertahankan toti[otensi sel
4. • Tujuan kultur kalus: memperoleh kalus
dr eksplan dan ditumbuhkan dalam
lingkungan yg terkendali
• Tujuan kultur sel:
1. Mendapatkan tanaman yg berasal dari
sel tunggal
2. Membuat mutasi yg seragam kemudian
diseleksi
3. Mendapatkan ekstrak senyawa
sekunder
4. Penggandaan kromosom
5. • Kalus memperbanyak diri secara terus
menerus
• Sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkhym
yg mempunyai ikatan renggang satu sama
lain
• Di alam kalus terbentuk karena pelukaan
(infeksi bakteri, gigitan serangga) atau stress
• Invitro: diinduksi dr eksplan yg aktif
membelah hypocotyl, kotiledon,
embrio muda, daun muda, batang muda
• Bagian-bagian yg mudah terjadinya
dedifrensiasi kalus
6. • Ciri-ciri kalus:
1. Sel yg tdk mengalami defrensiasi
2. Bentuknya tdk teratur
3. Ukuran kecil
4. Inti sel besar
5. Sitoplasma kental
6. Masih dijumpai sel-sel yg masih dalam proses
membelah (belum terjadi sitokinesis, inti tdk satu)
7.
8. Kultur suspensi sel
• Sel-sel tunggal atau agregat-agregat kecil dlm sel
• Wadah kulur dirotasikan atau di goyang=goyang
• Gunanya utk mempertahankan penyebaran sel dan
pertukaran gas antar sel-sel
• Kultur kalus maupun suspensi sel secara sitologis sering
tidak stabil
• Sel-sel dapat kehilangan semua atau sebagian
kromosomnya
• Ketidak stbilan kromosom dapat digunakan sbg sumber
mutan baru yg berharga
9. • Kultur sel telah digunakan secara besar-
besaran utk seleksi genotipa-genotipa yg
diinginkan
• Bahan kimia atau produk metabolit dapat
ditambahkan ke dalam medium sbg agensia
selektip utk menghilangkan sel-sel yg peka
dlm sel-sel yang tahan atau toleran
• Mis : tan alfa diberi NaCl utk mendapatkan
tanaman yg toleran terhadap salinitas
10. Tujuan kultur (sel) :
1. Mendapatkan klon tanaman yg berasal dr sel
tunggal
2. Utk membuat mutasi yg seragam kemudian
diseleksi
3. Mendapatkan ekstrak senyawa sekunder
4. Penggandaan kromosom
• Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya
(massa selnya) secara terus menerus.
• Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim
yang mempunyai ikatan yang renggang dengan
sel-sel lain.
11. • eksplan: kambium vaskular, parenkim cadangan makanan,
perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular.
• Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan
berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan
embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
• kalus ada yang mengalami lignifikasi sehingga kalus
mempunyai tekstur yang keras dan kompak.
• kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-
fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan
kalus remah (friable).
• Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari
jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-
kuningan, putih, hijau, kuning kejingga-jingaan (karena
adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek
umbi wortel).
12. • Untuk memperoleh kalus yang homogen
maka harus menggunakan eksplan jaringan
yang mempunyai sel-sel yang seragam
• eksplan kambium tidak dibutuhkaan ZPT
untuk menginduksi kalus pada
jaringan berkambium yang mengalami luka
akan tumbuh kalus untuk menutupi luka
yang terbuka
13. Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh
Untuk membentuk kalus,jaringan tanaman
Digolongkan dalam 4 kelompok:
• Jaringan membutuhkan hanya auksin seperti: umbi
artichoke.
• Jaringan memerlukan auksin dan sitokinin seperti:
empulur tembakau.
• Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin,
seperti: jaringan kambium.
• Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, seperti
parenkim dan xylem akar.
14. • tidak semua sel dalam jaringan asal membentuk
kalus, tetapi hanya sel di lapisan perifer
• Faktor-faktor yang menyebabkan inisiasi
pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari
jaringan kalus, karena:
• Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi.
• Keluarnya gas CO2.
• Kesediaan hara yang lebih banyak.
• Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat
menguap.
• Cahaya.
15. • Dalam proses pembentukan kalus, akan didapat
Lapisan-lapisan sel yang berbeda diantaranya:
• Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah.
• Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman.
• Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari
1-6 lapis.
• Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak
membelah.
16. • Induksi kalus dalam jaringan wortel ini karena aktifitas enzim-
enzim NAD-diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome
oxidase yang meningkat.
• Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang
sedang membelah.
• juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada kultur artichoke,
enzim fosfatase dideteksi pada permukaan sel-sel yang tidak
membelah.
• Menurut Yeoman (1970) asam fosfatase berhubungan dengan
sel rusak dan enzim, ini adalah index autolysis sel. Pada sel yang
rusak tapi tidak pecah di lapisan perifer, terjadi autolisis dan sel-
sel yang rusak tersebut mengeluarkan senyawa yang dapat
memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.
17. • Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus
yang heterogen.
• jaringan yang kelihatannya seragam histologinya
seperti pembuluh tembakau, ternyata
menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai
DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi
yang berbeda
• pada kultur akar, kalus yang dihasilkan dapat
berupa campuran sel dengan tingkat ploidi yang
berbeda.
• Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek
menunjukkan pertumbuhan yang berbeda.
18. • Sel heterogen berasal dari
1. materi asal yang heterogen
2. karena massa kultur yang panjang melalui sub
kultur yang berkali-kali.
• Perubahan yang terjadi dapat merupakan:
• Aberasi kromosom
• endo-reduplikasi yang menghasilkan poloploidi
• Amplifikasi gen: jumlah gen untuk suatu sifat
tertentu per genome haploid bertambah.
• Hilangnya suatu gen (deletion)
• Mutasi gen.
• Transposisi urutan DNA (DNA sequences
transposition).
19. • Kecepatan perubahan dalam kromosom kalus ini,
tergantung
1. macam media yang digunakan
2. jenis tanamannya.
• Ketidak-stabilan kromosom menyulitkan aplikasi
kultur kalus untuk perbanyakan tanaman maupun
untuk produksi bahan-bahan/ persenyawaan
sekunder.
• Sebaliknya ketidak-stabilan tersebut dapat
dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan in
vitro, untuk memperoleh sifat-sifat baru yang
menguntungkan seperti resistensi terhadap
penyakit, hilangnya morfologi yang memang tidak
diinginkan seperti duri atau warna pada bunga.
20. • Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama dalam
media yang tetap, akan menyebabkan terjadinya
kehabisan hara dan air.
• Kehabisan hara dan air dapat terjadi karena selain
terhisap untuk pertumbuhan juga karena media
menguapkan air dari masa ke masa.
• Kalus juga mengeluarkan senyawa-senyawa hasil
metabolisme yang menghambat pertumbuhan
kalus itu sendiri
• Untuk menjaga kehidupan dan perbanyakan yang
berkesinambungan, kalus yang dihasilkan perlu
disubkulturkan.
21. • waktu yang tepat untuk memindahkan kultur, tergantung dari
kecepatan pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2 macam yaitu
massa yang remah (friable) dan kompak.
• kalus remah cukup dilakukan dengan mengambil kalus dengan
spatula atau skapel lasung disubkultur ke media baru.
• kalus kompak dipindah ke petridish steril untuk dipotong-
potong dengan skapel baru disubkultur ke media baru.
• Kalur yang sudah mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya
tidak ikut disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik.
22. Variasi somaklon
• Keragaman genetik
• berasal dari materi asalnya,
• akibat periode kultur yang panjang melalui proses
subkultur yang berkali-kali.
• Media dan bahan kimia tertentu
• Perubahan yang terjadi dapat merupakan aberasi
kromosom, mutasi gen, poliploidi
• Keragaman Somaklon, protoklon, gametoklon
23. • Keragaman somaklon bermanfaat
mendapatkan tanaman unik dan bermanfaat
bagi pemuliaan konvensional
• Setiap siklus regenerasi menghasilkan 1-3 %
variasi somaklonal
• Variasi somaklon disebabkan terjadinya
perubahan kromosom maupun gen
24. Somaclonal Variation
• Sel tumbuhan mengalami berbagai tingkat sitologi dan perubahan genetik
selama pertumbuhan in vitro.
• Beberapa perubahan berasal dari yang sudah ada sebelumnya sel-sel
menyimpang dalam eksplan yang digunakan untuk kultur
• Gangguan fisiologis sementara dan gangguan perkembangan yang
disebabkan oleh lingkungan budibudaya.
• hasil dari perubahan epigenetik, yang bisa relatif stabil tetapi tidak
ditransmisikan ke keturunannya.
• Beberapa variasi adalah hasil dari perubahan genetik tertentu atau mutasi
dan ditransmisikan ke keturunan
• Variabilitas yang dikendalikan secara genetik seperti itu dikenal sebagai
variasi somaklonal. V
• ariasi somaklonal memberi keuntungan maupun kerugian dalam kultur
jaringan.
• menghambat perbanyakan klonal, tetapi pada saat yang sama
menghasilkan varian somaklonal yang diinginkan yang dapat dipilih untuk
pengembangan lini2 sel baru
25. • Variabilitas genetik somaklonal yang diinduksi
kalus dapat menimbulkan variabel genetik
planletyang diregenerasi dari kalus dan sangat
penting dalam pengembangan dan pemilihan
berbagai sel toleran stres. Toleran garam
(Ochatt et al. 1999), toleran logam berat
(Chakravarty dan Srivastava 1997), tahan
penyakit (Jones 1990), dan tahan herbisida
(Smith dan Chaleff 1990) line2 sel telah dipilih
melalui mutasi somaklonal menggunakan
jaringan kalus
26. Keragaman somaklonal:
• keragaman yang mewaris ( “heritable ” ) yang
dikendalikan secara genetik biasanya stabil dan
dapat diturunkan secara seksual ke generasi
selanjutnya
• keragaman yang tidak mewaris yang dikendalikan
secara epigenetik akan hilang ketika tanaman
diperbanyak secara seksual
• manfaat kultur jaringan bagi pemuliaan tanaman
adalah menginduksi keragaman genetik dan
mempertahankan kestabilan genetik
27. • Terjadinya variasi somaklonal dalam kultur in vitro
disebabkan oleh :
a.jenis zat pengatur tumbuh
b.konsentrasi yang digunakan
c. lamanya fase pertumbuhan kalus
d.tipe kultur yang digunakan, (sel, protoplasma, kalus,
jaringan),
e.serta digunakan atau tidaknya media selektif dalam
kultur in vitro
28. • Perubahan kromosom akibat
1. mutasi genom (poliploid)
2. mutasi kromosom
3. mutasi gen
4. mutasi di luar inti
29. 1. mutasi genom
1. Poliploidi pada tanaman mencerminkan bahwa satu atau lebih set
kromosom ditambahkan pada kromosom diploid misalnya triploid
disimbolkan 2x+x=3x, tetraploid 2x+2x=4x (dimana x adalah jumlah
kromosom dasar).
2. Haploidi (dari diploidi) atau polihaploidi (dari poliploidi)
mencerminkan status tanaman yang memiliki separuh dari jumlah
kromosom normal misalnya 2x-->x, 4x-->2x dan seterusnya.
3. Aneuploidi mencerminkan status tanaman yang memiliki
penambahan atau pengurangan kromosom dari pasangan normalnya,
misalnya 2x+1, 2x–1, 3x+1, 4x–1, 4x+2 dan sebagainya.
30. 2. Mutasi Kromosom (Chromosome Mutation)
• pecahnya benang kromosom (chromosome
breakage atau chromosome aberation).
• Pecahnya benang kromosom dibagi dalam 4
kelompok yaitu
translokasi (translocations),
inversi (inversions),
duplikasi (duplications),
defisiensi ( deficiencies )
31.
32.
33.
34.
35. Kultur embrio
• Berguna dalam menyelamatkan hsl persilangan
seksual antara spesies atau genera yg berkerabat
jauh yg sering kali gagal karena embrio hibridanya
mengalami keguguran
• disebut dengan embrio rescue
• Persilangan antara spesie atau genera seringkali
mengalami kegagalam perkembangan mebrioniknya
karena kromosomnya tdk kompatibel
36. • Kultur embrio lain adalah menanam mebrio yg
tidak bisa tumbuh secara alami
• Embrio yg mengalami masa dormansi
• Embrio yg tidak punya endosperm
• Misalnya anggrek
37. • Ada 2 type perkembangan embrio
1. Kultur embrio berasal dr biji muda. Utk menyelamatkan
embrio pd permulaan perkembangannya. Perkerjaan nya sulit:
- pada saat diseksi
- media yg cocok utk perkembangan embrio
2. Embrio di ambil dr biji yg sudah tua
pengkulturannya lebih mudah, pengambilan embrio mudah,
kebutuhan zat hara tdk sulit, media yg dibutuhkan sederhana,
yaitu media agar dgn pemberian gula dan mineral dasar
38. • teknik penyelamatan embrio dikenal juga teknik
kultur embrio (embryo culture), yaitu penanaman
embrio dewasa pada media buatan secara aseptis
• Aplikasi kultur embrio:
1. perbanyakan tanaman
2. pematahan dormansi untuk mempercepat
program pemuliaan
3. perbanyakan tanaman yang sulit berkecambah
secara alami, misalnya anggrek.
39. • Embrio 'Maiden of Promise Besar‘
dikecambahkan yang berasal dari kotiledon
menjadi embriogenik.
40.
41. • Faktor-faktor yg mempengaruhi kultur embrio
1. Genotipe
2. Fase perkembangan embrio
3. Kondisi tanaman induk
4. Zat hara dalam media
5. Zat pembakar (O2)
6. Cahaya
7. suhu
46. • Berdasarkan tujuan dan jenis embrio yang dikulurkan,
kultur embrio digolongkan menjadi:
• 1. Kultur Embrio Muda (Immature Embryo Culture).
• Tujuan mengkulturkan embrio muda ini adalah
menanam embrio yang terdapat pada buah muda
sebelum buah tersebut gugur (mencegah kerusakan
embrio akibat buah gugur) sehingga teknik ini disebut
sebagai Embryo Rescue (Penyelamatan Embrio).
• sering dijumpai pada buah hasil persilangan, dimana
absisi buah kerap kali dijumpai setelah penyerbukan
dan pembuahan
• Contoh persilangan anggrek Vanda spathulata gugur
buah pada saat buah masih muda (3 bulan) setelah
persilangan padahal buah anggrek Vanda spp. masak
penuh setelah berumur 6 bulan
47. • Bila tidak diselamatkan dikecambahkan maka tidak akan
diperoleh buah hasil persilangan.
• Perkecambahan biji yang masih muda di lapangan sangat
sulit bahkan pada beberapa kasus hampir tidak mungkin
bisa terjadi. Oleh karena itu, buah yang belum tua (2 – 4
bulan) pada anggrek Vanda tersebut kemudian dipanen dan
dikecambahkan secara in-vitro.
48. • Budidaya embrio muda ini lebih sulit Embrio yang
terdapat dalam biji belum sepenuhnya berkembang dan
belum membentuk radicula dan plumula yang
sempurna.
• biji belum memiliki endosperm dalam mendukung
perkembangan dan perkecambahan embrio.
• perlu disediakan media kultur yang bagi perkembangan
embrio muda ini.
• kadangkala dijumpai embrio masih dorman sehingga
perlu ditambahkan hormon tanaman yang bisa
memecahkan dormansi biji ini, misalnya Giberellin.
49. 2. Kultur Embryo Dewasa (Mature
Embryo Culture)
• membudidayakan embrio yang telah dewasa.
• diambil dari buah yang telah masak penuh
• tujuan merangsang perkecambahan dan
menumbuhkan embrio tersebut secara in-vitro.
50. embryo culture dan embryo rescue dilakukan untuk
tujuan,
1. Mematahkan dormansi.
Beberapa spesies tanaman memiliki masa dormansi
yang panjang, misalnya cherry, hazel nut, menghasilkan
biji namun tidak dapat dikecambahkan secara normal di
alam misalnya Musa balbislana.
Untuk memecahkan masalah tersebut, maka biji
tanaman ini dapat dikecambahkan secara in-vitro.
Dormansi fisik dapat dipatahkan dengan cara
mengisolasi embrio dari biji lalu mengecambahkannya,
sedangkan dormansi fisiologis dapat dipecahkan dengan
perlakuan kimia seperti penambahan giberellin (GA3) ke
dalam media kultur.
51. 2. Memperpendek siklus pemuliaan tanaman
• Dormansi biji dapat menghambat program
pemuliaan tanaman.
• Pemecahan dormansi dengan kultur embrio
(embryo culture) merupakan upaya untuk
mempercepat perkecambahan biji hasil pemuliaan
sehingga bisa mempercepat proses pemuliaan
tanaman
52. 3. Produksi tanaman haploid lewat penyelamatan
embrio hasil persilangan antar jenis tertentu
Salah satu cara yang dilakukan untuk memperoleh tanaman
haploid adalah silangan antar spesies tertentu.
Contohnya adalah persilangan antara Hordeum vulgare
dengan H. bulbosum.
Setelah penyilangan yang kemudian diikuti oleh pembuahan,
kromosom H. bulbosum tereliminasi sehingga hanya
kromosom H. bulbosum yang terekspresi, sehingga dapat
dihasilkan biji haploid dari silangan ini.
53. biasanya persilangan ini mengakibatkan embrio
gugur (buah gugur) sebelum buah tersebut dewasa.
Hasil silangan ini (buah haploid) tidak akan dapat
diperoleh apabila buah muda tersebut tidak
diselamatkan dengan cara memanennya sebelum
gugur lalu mengecambahkan embrio muda (teknik
embryo rescue) ini secara in-vitro.
54. 4. Produksi tanaman haploid lewat penyelamatan
embrio hasil persilangan antar jenis tertentu
Salah satu cara yang dilakukan untuk memperoleh tanaman
haploid adalah silangan antar spesies tertentu.
Contohnya adalah persilangan antara Hordeum vulgare
dengan H. bulbosum.
Setelah penyilangan yang kemudian diikuti oleh pembuahan,
kromosom H. bulbosum tereliminasi sehingga hanya
kromosom H. bulbosum yang terekspresi, sehingga dapat
dihasilkan biji haploid dari silangan ini.
55. biasanya persilangan ini mengakibatkan embrio
gugur (buah gugur) sebelum buah tersebut dewasa.
Hasil silangan ini (buah haploid) tidak akan dapat
diperoleh apabila buah muda tersebut tidak
diselamatkan dengan cara memanennya sebelum
gugur lalu mengecambahkan embrio muda (teknik
embryo rescue) ini secara in-vitro.
56. 5. Mencegah gugurnya buah (embrio) pada buah
• Gugurnya buah sebelum buah dewasa sangat
umum ditemukan pada persilangan.
• Berbegai macam faktor dapat menyebabkan buah
tersebut gugur sebelum masak.
57. 6. Mencegah kehilangan biji setelah persilangan
(interspesific)
• Persilangan antara varietas tanaman dalam satu spesies
seringkali menghasilkan buah dengan endosperm yang
miskin atau embrio lemah dan berukuran kecil.
• Biji-biji dengan kondisi demikian seringkali sulit atau tidak
bisa dikecambahkan dalam kondisi normal.
• Teknik kultur embrio dapat digunakan untuk membantu
perkecambahannya. Hal ini telah dilakukan pada tomat,
padi, barley, kapas, phaseolus
