Wyklad 9

Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Globalny rynek enzymów

Wielkość rynku – około 3 mld $
Tempo wzrostu – 12% rocznie
Ilość firm – około 400

Największe: Novozymes (Dania) 45%
Danisco/Genecor (Dania/USA) 17%
DSM (Holandia) 5%
BASF (Niemcy) 4%

Sektory rynku enzymów: techniczny (63%), żywnościowy (31%),
paszowy (6%)


Wytwarzanie enzymów

Dwa rodzaje procesów technologicznych, zasadniczo różniące się
warunkami:

1. Enzymy wytwarzane w dużych ilościach, głównie dla celów
przemysłowych, tylko częściowo oczyszczone (bulk enzymes)
2. Enzymy wytwarzane w niewielkich ilościach, dla celów
terapeutycznych i naukowych, o wysokim stopniu czystości

Obecne tendencje w produkcji enzymów:

1. Zastępowanie enzymów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego przez
enzymy rekombinowane, wytwarzane przez drobnoustroje w warunkach
nadprodukcji
2. Wprowadzanie enzymów pochodzących z komórek drobnoustrojów
ekstremofilnych
3. Zastosowanie inżynierii białka – enzymy o zmienionych właściwościach


Izolacja enzymów ze źródeł naturalnych
90% z bakterii i grzybów. Inne źródła: roślinne i zwierzęce
Enzymy izolowane z roślin

Źródło Enzym Zastosowanie
Fasola (Canavalia ensiformis) Ureaza Diagnostyka
Owoce papaya (Carica papaya) Papaina Piekarnictwo, mleczarstwo,
garbarstwo, kruszenie mięsa,
usuwanie zmętnienia piwa
Figi (Ficus carica) Ficyna Kruszenie mięsa
Ananas (Ananas comosus) Bromelanina Piekarnictwo
Chrzan (Armoracia rusticana) Peroksydaza Diagnostyka
Migdały (Amygdalus communis) β-glikozydaza Badania naukowe
Pszenica (Triticum aestivum) Esteraza Hydroliza estrów i synteza
Jęczmień (Hordeum vulgare) β-amylaza Piekarnictwo, syropy maltozowe
Soja (Glycine max) β-amylaza j.w.

Enzymy izolowane z tkanek zwierzęcych

Źródło Enzym
Cielęta, bydło rzeźne, owce, trzoda Diastaza (amylaza), esteraza, lipaza,
chlewna pepsyna, trypsyna, fitaza, chymozyna
(renina), fosfolipaza
Jaja kurze Lizozym
Mocz Urokinaza


Produkcja enzymów
Porównanie cech preparatów enzymatycznych o niskiej czystości,
produkowanych w dużych ilościach i preparatów o wysokim stopniu
oczyszczenia

Enzymy do celów technologicznych, Enzymy wysokiej czystości
wytwarzane w dużych ilościach (bulk)

Niewielki koszt jednostkowy, cena Wysoki koszt jednostkowy, cena
kalkulowana na jednostki masy kalkulowana na jednostki aktywności
enzymu
Surowe preparaty, często poniżej 10% Wysoka czystość, często powyżej 90%
białka
Obecność innych enzymów Inne enzymy nieobecne, lub ich obecność
określona ilościowo
Preparaty otrzymane w wyniku suszenia Liofilizaty lub zawiesiny w roztworze
rozpyłowego lub stężone roztwory siarczanu amonu
Brak stabilizatorów Obecne stabilizatory
Niewiele etapów oczyszczania Wiele etapów oczyszczania, w tym
techniki chromatograficzne
Próbki dostępne nieodpłatnie Brak takich próbek
Minimalne zamówienie 1-2 kg Szeroki zakres dostępnych ilości
(poczynając od bardzo niewielkich)


Enzymy używane do celów przemysłowych

Rodzaj enzymu Zastosowanie Pierwotny Producent ekspresyjny
producent
Dekarboksylaza acetylomleczanowa Browarnictwo (B) Bacillus Bacillus subtillis
Amylaza Piekarnictwo (P), B, Przemysł skrobiowy Aspergillus Aspergillus oryzae,
(PS) Aspergillus niger
Amylaza PS Bacillus Bacillus amyloliquefaciens
Celulaza P, B, przemysł detergentów (PD) Trichoderma reesei Trichoderma, Aspergillus
Glukoamylaza PS Aspergillus niger Aspergillus niger
Izomeraza glukozowa PS – syropy wysokofruktozowe Streptomyces Streptomyces lividans
Lipaza P, przemysł mleczarski (PM) Candida, Fusarium A. oryzae, A. niger
Liaza pektynowa Przemysł owocowo-warzywny (PO) Bacillus Bacillus lichenoformis
Pektynaza PO Aspergillus Aspergillus
Fitaza Przemysł paszowy Aspergillus A. oryzae, A. niger
Alkaliczna proteaza PD Bacillus B. lichenoformis
Kwaśna proteaza PM Żołądki cieląt, Mucor A. oryzae, A. niger
Pululanaza PS Bacillus B. Lichenoformis
Ksylanaza Przemysł drzewny i tekstylny Actinomadura A. niger, B. lichenoformis


Ideowy schemat produkcji preparatów enzymatycznych


Dezintegracja komórek - problemy

Komórki zwierzęce – brak ściany; duże rozmiary; łatwość rozbicia
Komórki roślinne – ściana komórkowa (celuloza/ligniny/woski)
duże rozmiary; polifenole obecne w wakuolach
Bakterie - sztywna ściana komórkowa + błona zewnętrzna (tylko Gram-);
niewielkie rozmiary; komórki sferyczne – szczególne problemy
komórki rekombinowane – możliwe tworzenie ciał inkluzyjnych
Grzyby - bardzo sztywna ściana (chityna/glikan); aktywne enzymy
proteolityczne

Problemy ogólne: utrata mechanizmów kontroli metabolizmu w momencie
rozbicia komórek; efekty cieplne związane z zastosowaniem
metod mechanicznych


Prasa Frencha

Zasada działania:

W wyniki parcia wywieranego na zawartość komory przez tłok naciskany za pośrednictwem
prasy hydraulicznej, rośnie ciśnienie w komorze oraz ciśnienie wewnętrzne w komórkach. Podczas
uwalniania zawartości komory przez wąską dyszę, następuje gwałtowny spadek ciśnienia
w zawiesinie (na zewnątrz komórek) do atmosferycznego. Ciśnienie wewnątrzkomórkowe także
spada, ale wolniej. W efekcie, gradient ciśnienia po dwóch stronach błony cytoplazmatycznej
powoduje jej pęknięcie, a w efekcie uwolnienie cytoplazmy.


Zatężanie roztworów białek

- w wyniku dodania do roztworu ziaren suchego, porowatego polimeru. Wielkość
porów musi być tak dobrana, aby nie wnikały w nie cząsteczki białek (Sephadex G-
25, glikol polietylenowy - PEG);

-w wyniku usunięcia nadmiaru wody oraz niewielkich cząsteczek poprzez dyfuzję
przez półprzepuszczalną membranę (ultrafiltracja, dializa wobec suchego
Sephadex-u lub PEG);

-w wyniku usunięcia wody w niskiej temperaturze pod zmniejszonym ciśnieniem
(liofilizacja);

- poprzez wytrącenie białka z roztworu (wysalanie, dodanie rozpuszczalnika
organicznego i rozpuszczenie osadu w mniejszej objętości roztworu wodnego)

- poprzez oddzielne białka wytraconego w postaci ciał inkluzyjnych i jego naturację


Naturacja białek z ciał inkluzyjnych

Problem tworzenia
agregatów podczas
fałdowania białek

Mogą się tworzyć
w bakteryjnych
systemach ekspresji

1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w
roztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie
potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa

Wytrącanie białek

Wytrącanie poprzez zmianę pH roztworu Wytrącanie poprzez wysalanie

Białka są wytrącane w wyniku dodania do roztworu
mieszających się z wodą, niedenaturujących
rozpuszczalników organicznych.
Najczęściej stosowane: aceton, etanol, rzadziej eter dietylowy
Operacje prowadzi się w temperaturach poniżej 0° C.

Wytrącanie poprzez dodatek rozpuszczalnika organicznego


Chromatograficzne metody separacji białek
Podstawą separacji są różnice we właściwościach fizykochemicznych białek:

polarność chromatografia adsorpcyjna
chromatografia hydrofobowa
charakter jonowy chromatografia jonowymienna
chromatoogniskowanie
rozmiary cząsteczki chromatografia rozmiarów wykluczających
aktywność biologiczna chromatografia powinowactwa
W oczyszczaniu białek stosuje się techniki chromatograficzne
nisko-, średnio- i wysokociśnieniowe.

LPLC < 5 bar

MPLC 6 – 50 bar

HPLC > 50 bar

1 bar = 0.1 MPa


Materiały stosowane jako nośniki (matryce) dla złóż
chromatograficznych wykorzystywanych dla oczyszczania białek
Matryca Czynnik sieciujący Zakres stabilności (pH) Uwagi
lub skład kopolimeru

Celuloza epichlorohydryna 2 – 12

Dekstran epichlorohydryna 2 – 12

Agaroza 2,3-dibromopropanol 3 - 14 tylko
zawiesina
Sepharose kopolimer dekstranu 2 – 14
I agarozy j.w.

Poliakrylamid produkt polikondensacji 2 – 11

Polistyren diwinylobenzen bez ograniczeń


Chromatografia jonowymienna białek
Rodzaje złóż: anionity (wymieniają aniony)
kationity (wymieniają kationy)


Chromatografia adsorpcyjna

Hydroksyapatyt: Ca10(PO4)6(OH)2
- krystaliczny
- sferoidalny
- ceramiczny
Mechanizm adsorpcji:
Wiązanie na powierzchni złoża, w którym uczestniczą jony
Ca(II) i fosforanowe złoża oraz naładowane grupy funkcyjne
białek

Warunki adsorpcji: bufor fosforanowy Na/K (<20 mM)
pH obojętne

Warunki elucji: rosnący gradient skokowy lub ciągły
buforu fosforanowego (zwykle 10 – 500 mM)


Chromatografia hydrofobowa
Inertne matryce funkcionalizowane grupami arylowymi lub alkilowymi.
Matryce podstawione grupami alkilowymi są ogólnie bardziej hydrofobowe,
niż matryce podstawione grupami arylowymi

Mechanizm wiązania białek: wykorzystuje się obecność domen
hydrofobowych na powierzchni cząsteczek białka; siła napędowa – wzrost
entropii układu; jest potęgowana w roztworach o dużej sile jonowej.
Złoża do chromatografii hydrofobowej FPLC

Parametry próbki nanoszonej na kolumnę:
środowisko buforu o dużej sile jonowej;

Elucja: a/ bufor o zmniejszającej się sile jonowej;
b/ gradient rozpuszczalnika organicznego
(alkohole alifatyczne, aminy alifatyczne) lub
detergentu niejonowego, np. Triton X-100


Chromatografia rozmiarów wykluczających

Zasada: Porowate ziarna złoża z materiału
całkowicie inertnego (Sephadex,
Sepharose, Superose, Superdex,
poliakrylamid. Pory w ziarnach o
kontrolowanej średnicy. Cząsteczki
białek, w zależności od swoich
rozmiarów wnikają do porów
(są zatrzymywane) lub przepływają obok.


Chromatografia powinowactwa
Podstawą separacji są wysoce selektywne,
specyficzne oddziaływania białko: ligand
związany trwale ze złożem.

Ligandem może być np.: analog substratu,
koenzymu, inhibitor kompetytywny, inhibitor
allosteryczny.

Istnieje możliwość indywidualnego
zaprojektowania i otrzymania złoża
specyficznego wobec danego białka
lub zakupu jednego z kilkuset komercyjnie
dostępnych złóż o różnej specyficzności.

W niektórych przypadkach możliwe
efektywne oczyszczenie białka
w jednym etapie.


Schemat granulatora do otrzymywania granulatów enzymatycznych


Etapy procesu wytwarzania enzymu przemysłowego


Schemat biosyntezy enzymów przemysłowych


Rodzaje białek terapeutycznych
- białka stymulujące powstawanie komórek krwi
- czynniki krzepliwości krwi i białka trombolityczne
- interferony i cytokiny
- hormony
- enzymy
- przeciwciała i ich pochodne
- szczepionki (podjednostkowe)
Białka należące do czterech pierwszych grup można izolować ze źródeł naturalnych:
krew ludzka i zwierzęca, organy zwierzęce. Wady – możliwość przenoszenia
czynników infekcyjnych (wirus HIV, priony), ograniczony dostęp do zasobów

Obecnie wszystkie w/w białka są wytwarzane jako białka rekombinowane- produkty
heterologicznej ekspresji genów kodujących białka ludzkie i znakomita ich
większość jest w swojej ostatecznej postaci identyczna bądź też prawie identyczna
z białkami występującymi w organizmie zdrowego człowieka lub z ich fragmentami.

Białka terapeutyczne - przykłady
Białka stymulujące powstawanie komórek krwi
Erytropoetyna
Etapy ERYTROPOEZY

a) krew przenosi za mało tlenu; b) informacja o tym dociera do nerki
c) rozpoczyna się produkcja hormonu erytropoetyny (EPO)
d), e) pod wpływem EPO szpik kostny wytwarza czerwone krwinki


Erytropoetyna
Ludzka EPO i rekombinowana ludzka EPO są identyczne pod względem
• sekwencji aminokwasów,
• pozycji 2 mostków disiarczkowych,
• 4 miejsc glikozylacji,
• struktury drugorzędowej.

Peptyd zawiera 165 aminokwasów, masa
cząsteczkowa - 30,4 kDa.

Białko zbudowane jest z 4 alfa-helis, które tworzą
ścisłą pofałdowana strukturę białka.

Rekombinowane produkty nie różnią się pod
względem budowy, można jednak zauważyć
ilościowe różnice w glikozylacji.


Erytropoetyna
Komórki ssaków transfekowane Produkcja EPO rekombinowanej
genem EPO genetycznie (rHu-EPO) in vitro
Komórki jajnika chińskiego chomika (CHO) są obecnie najbardziej powszechnie
używane do produkcji rHu-EPO w skali przemysłowej.

rHu-EPO z całkowitą aktywnością biologiczną in vivo może być również otrzymywana z innych
kultur komórek ssaków modyfikowanych genetycznie, takich jak komórki nerek młodych
chomików BHK-21, albo komórki sutka myszy C127.

Białka terapeutyczne – przykłady
Hormony

Insulina
Produkowana w trzustce przez komórki β wysp trzustkowych
hormon o strukturze małego białka
Insulina obniża poziom glukozy we krwi, zwiększa zawartość
glikogenu w wątrobie, wzmaga biosyntezę aminokwasów, białek oraz
kwasów tłuszczowych, wpływa na wnikanie glukozy do komórek
mięśni i tkanki tłuszczowej
Cząsteczka insuliny składa się z dwóch łańcuchów peptydowych A
i B, połączonych ze sobą dwoma mostkami disiarczkowymi. Łańcuch
A zawiera 21, a łańcuch B 30 reszt aminokwasowych (w sumie 51
reszt aminokwasowych)


Insulina

Od 1922 insulina świńska. Problem – różnica w łańcuchu B: Ala30 zamiast Thr
Częściowe rozwiązanie: humanizowana insulina świńska – semisynteza
Obecnie od 1982 - insulina ludzka rekombinowana


Gensulin (BIOTON)

Konstrukcja genu:
sekwencja kodująca: Peptyd B-Lys-Arg-Peptyd A-Lys-peptyd nośnikowy

Ekspresja w Escherichia coli
Produkt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych
Etapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja
Półprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymi
Obróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz
przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A
Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa
Dalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy
Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95%
Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacja
Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%


Wytwarzanie przeciwciał i leków opartych na przeciwciałach
Dwa główne typy odpowiedzi
immunologicznej:

a/ odpowiedź humoralna –
główny element: limfocyty B
b/ odpowiedź komórkowa –
główny element: limfocyty T

Przeciwciała wytwarzane są przez limfocyty B
Podstawowa struktura immunoglobuliny G (IgG)
H – łańcuchy ciężkie; L – łańcuchy lekkie;
Fab – region wiążący antygen; Fc – region
krystalizowalny

Struktura immunoglobuliny typu G
VH, VL – domeny zmienne; CH1, CH2, CH3 – domeny stałe
Model struktury przestrzennej IgG


Produkcja przeciwciał przez organizm immunizowany antygenem


Przeciwciało monoklonalne – przeciwciało specyficzne
wobec danego antygenu, o zdefiniowanej sekwencji
łańcuchów polipeptydowych; wytwarzane przez komórki
klonalne (jednego genotypu) w hodowli tkankowej

Przeciwciała poliklonalne – zestaw przeciwciał
monoklonalnych wiążących dany antygen, wytwarzanych
przez immunizowany organizm zwierzęcy


ZASTOSOWANIA PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH

A. Oczyszczanie biomolekuł
1. Immunochromatografia
2. Immunoprecypitacja

B. Zastosowania diagnostyczne
3. Testy ELISA
4. Immunocytochemia
5. Mikroskopia transmisyjna i konfokalna

C. Zastosowania terapeutyczne
6. Immunotoksyny – chemoterapia przeciwnowotworowa
7. Immunosupresja


Przeciwciało (immunoglobulina)

Przeciwciałem nazywa się specyficzny rodzaj
białek wydzielanych przez komórki
plazmatyczne (czyli pobudzone limfocyty B) w
przebiegu odpowiedzi immunologicznej, które
mają zdolność do swoistego rozpoznawania
antygenów.


Kompozycja przeciwciał stosowanych jako leki

Przeciwciała chimeryczne
produkty genów rekombinowanych kodujących regiony zmienne mysich i regiony
stałe ludzkich przeciwciał;
Przeciwciała humanizowane
regiony CDR mysie + reszta ludzka


Humanizowane przeciwciała - leki

Trastuzumab (Herceptin) – lek,
w którym substancją czynną jest
przeciwciało humanizowane
skierowane przeciwko receptorom
HER2 (naskórkowy czynnik wzrostu).
Skuteczny w leczeniu nowotworu
płuc.
Alemtuzumab (Campath) – lek, w którym
substancją czynną jest humanizowane
ludzkie przeciwciało monoklonalne
skierowane przeciwko glikoproteinom CD52
obecnym na powierzchni limfocytów.
Skuteczny w leczeniu białaczki limfocytowej.


Immunotoksyny - leki

Gemtuzumab (Mylotarg) – lek, w którym substancją czynną
jest przeciwciało połączone z substancją antybiotyczną –
kalichemicyną (oligosacharyd tworzący dwuniciowe
pęknięcia w DNA), wiążące się z glikoproteiną CD33.
Skuteczny w leczeniu ostrej białaczki szpikowej.

Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin). Immunokoniugat mysiego
przeciwciała rozpoznającego antygen CD20 na powierzchni
zmienionych nowotworowo limfocytów B z tiuksetanem,
selektywnym chelatorem Indu-111 oraz Itru-90.
Wytwarzanie: komórki CHO. Zastosowanie: Leczenie niektórych
typów białaczek. Lek jest podawany po uzupełnieniu
o radioaktywne izotopy.


Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu
komórek hybrydowych


Hodowle tkankowe komórek ssaczych

Sposoby prowadzenia hodowli komórek ssaków



Hodowla komórkowa w butelkach obracanych
(roller bottles)

Hodowla komórkowa na tacach w komorach
inkubacyjnych



Trójstopniowa instalacja przemysłowa do hodowli komórkowych



Reaktory typu air-lift – szczególnie przydatne do przemysłowej
hodowli komórek ssaczych


Etapy procesu otrzymywania immunobiofarmaceutyku


Enzymy stosowane w przemyśle skrobiowym

Materiał roś linny Etapy produkcji amylazy

woda Skrobia 1. Fermentacja Aspergillus awamori
2. Ekstrakcja wodą podłoża z grzybnią
Mieszanie
3. Wytrącenie etanolem z 0,2% CaCl2, 5°C
Para wodna
Zawiesina skrobi
4. Odwirowanie osadu, przemycie etanolem
α-amylaza
5. Suszenie próżniowe do 90% s.m.
Upłynnianie 6. Zmielenie, dodanie wypełniacza
Glukoamylaza/
Maltodekstryny
pululanaza Termostabilne amylazy – możliwość
Scukrzanie działania w temperaturze bliskiej 100 °C
Syrop maltozowy
Izomeraza
glukozowa Syrop glukozowy
Oczyszczanie
Izomeryzacja Produkcja izomerazy glukozowej
Syrop oczyszczony
Syrop fruktozowy
1. Fermentacja Bacillus lub Streptomyces
Rafinacja 2. Odwirowanie lub filtracja
Syrop rafinowany
3. Rozbicie komórek
4. Odwirowanie osadu
5. Wytrącenie enzymu z roztworu
Schemat enzymatycznego rozkłądu skrobi 6. Immobilizacja

Wyklad 9

Recommended

Recommended

More Related Content

Viewers also liked

Viewers also liked (10)

Similar to Wyklad 9

Similar to Wyklad 9 (8)

More from marwron

More from marwron (20)

Wyklad 9