đột biến gene

1. PGS.TS.BS. Hoàng Anh Vũ
Trung tâm Y Sinh học Phân tử
Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
hoanganhvu@ump.edu.vn
1
Tháng 09 năm 2022
GIỚI THIỆU VỀ ĐỘT BIẾN GEN

2. 2
MỤC TIÊU
1. Phân biệt được các kiểu đột biến gen gây bệnh và
cách viết danh pháp đột biến
2. Nhận biết được những điểm mạnh và điểm yếu của
chẩn đoán đột biến gen trong thực tế lâm sàng

3. 3
NỘI DUNG TRÌNH BÀY
1. NHẮC LẠI CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN
2. CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN
3. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
4. MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN
5. CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

4. 4
1. NHẮC LẠI CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN
2. CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN
3. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
4. MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN
5. CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

5. Cơ thể người
Cơ quan/hệ thống
Mô
Tế bào
Các phân tử sinh học
(nucleic acid, protein, lipid)
5
Chẩn đoán hình ảnh/
chức năng
Giải phẫu bệnh
Giải phẫu bệnh
Chẩn đoán phân tử
CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
công cụ chẩn đoán tương ứng
Mức độ bệnh lý quan tâm

6. Nhiễm sắc thể
Deoxyribonucleic acid (DNA)
(+ Histone)
Ribonucleic acid (RNA)
Protein
Nhiễm sắc thể đồ
FISH
Southern blot (DNA)
Northern blot (RNA)
PCR
DNA sequencing
Hóa mô miễn dịch
Western blot
ELISA
Flow cytometry 6
CÁC KỸ THUẬT TƯƠNG ỨNG MỨC PHÂN TỬ
phiên mã
lai huỳnh quang
Mức độ khảo sát

7. Trong TB ==> nhân chứa NST ==> chủ yếu
là DNA quấn quanh Histone
1 đoạn DNA mã hoá cho protein nào đó
mang 1 chức năng cụ thể trong TB gọi là
đoạn gene ==> KHÁI NIỆM CỔ ĐIỂN
Hiện nay có những gene tạo ra các RNA,
các RNA này không mã hoá cho protein nào
hết mà nó chỉ đơn thuần là mang 1 chức
năng cụ thể ==> vẫn gọi là gene
trong bộ NST có khoảng 30k gene
3 tỉ subunit
Mở bộ gene trong 1 TB dài khoảng 2m
Mấy cái thông tin này đọc cho vui thôi
Không nhắc đến vài chục gene trong ty thể

8. TỪ GEN ĐẾN SẢN PHẨM PROTEIN
8
bản thân trong 1 gene cũng có nhiều vùng; trong đó
2 vùng thường nói tới là intron và exon
DNA = chuỗi đôi mang thông tin gốc; truyền qua
RNA qua phiên mã
- RNA ban đầu được gọi là RNA nguyên thuỷ
- RNA nguyên thuỷ sau đó sẽ được xử lý để chỉ giữ
lại những vùng trực tiếp tạo protein ==> RNA trưởng
thành
===> Những vùng thông tin được giữ lại qua tất cả
những GĐ trên gọi là exon
Còn những vùng không được giữ lại ở RNA trưởng
thành là intron
phiên mã
dịch mã

9. 9
KHÁI NIỆM VỀ GEN (1)
Gen là một phần của phân tử deoxyribonucleic
acid (DNA), làm khuôn mẫu cho việc phiên mã
để tạo thành phân tử ribonucleic acid (RNA) có
chức năng quan trọng:
• Trình tự gen: 4 loại base là adenine (A),
cytosine (C), guanine (G), thymine (T)
• RNA: Thymine được thay bởi uracil (U)
• Purine = A & G
• Pyrimidine = C, T & U
phân 2 nhóm base

10. 10
NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION
Thông tin của gene lấy từ trang này ==> NCBI ==> chọn mục gene
thông tin căn bản về gene

11. 11
khi nhấp vào sẽ hiện
ra chuỗi đó

12. 12

13. 13
TRÌNH TỰ DNA CỦA GEN
Còn đây là trình tự mình tự giải cho BN
Khi mình so sánh với dữ liệu chuẩn trên
trang web nãy thì mình sẽ thấy nếu khác thì
gọi là biến thể
Có biến thể lành tính, biến thể gây bệnh
==> Phần sau

14. 14
• Exon: Phần tương ứng của gen còn lưu lại trong
RNA trưởng thành (có thể mã hóa hoặc không mã
hóa amino acid)
• Intron: Phần DNA không mã hóa cho amino acid
nằm giữa các exon của một gen (IVS: intervening
sequence). Intron bắt đầu bằng GT và tận cùng
bằng AG
• Codon: Bộ ba nucleotide mã hóa cho 1 amino acid
• Start codon ở người là ATG (mã hóa methionine):
A được đánh số +1
• Stop codon ở người là TAG, TAA hoặc TGA
• Chiều của gen 5’  3’
KHÁI NIỆM VỀ GEN (2)
Intron còn được viết là IVS
Rất quan trọng: Bộ gene con người có
khoảng 30K gene # 100K intron nhưng
điểm quan trọng là nó luôn bắt đầu =
GT và kết thúc bằng AG ==> hầu như
KHÔNG CÓ NGOẠI LỆ
==> Dẫn tới nếu là cái intron nào mà
không theo quy luật đó thì làm cho quá
trình ghép nối exon bị ảnh hưởng
Không phải exon nào cũng mã hoá cho
acid amin nha ==> Những cái nào nó
mã hoá cho aa thì nằm theo bộ 3 gọi là
codon = bộ 3 mã hoá
Trong quá trình trượt trên chuỗi DNA mà gặp 3 codon này
thì sẽ ngưng
TẤT CẢ NHỮNG QUY LUẬT TRONG SLIDE NÀY KHÔNG ÁP DỤNG CHO GENE TY THẺ,
TY THỂ XÀI CÁCH MÃ HOÁ KHÁC VỚI GENE TRONG NHÂN, ƯNG THÌ TỰ TÌM ĐỌC
ở người thì aa đầu tiên được tổng hợp trong
chuỗi PP là Met ==> Met được mã hoá bởi 1 bộ
3 duy nhất là ATG chứ kp như những aa khác
được mã hoá bởi nhiều bộ 3
(Vì có 4 Nu, tổ hợp bộ 3 thì có 64 codon trong
khi đó chỉ có 20 aa thôi ==> 1 aa được mã hoá
bởi nhiều bộ ba
==> Và vì ATG luôn bắt đầu nên vị trí A được
đánh +1; sau A thì +2, +3; trước A thì -1; -2;
KHÔNG CÓ SỐ 0

15. Amino Acid
Three-Letter
Abbreviation
One-Letter
Abbreviation
Alanine Ala A
Arginine Arg R
Asparagine Asn N
Aspartate Asp D
Cysteine Cys C
Glutamate Glu E
Glutamine Gln Q
Glycine Gly G
Histidine His H
Isoleucine Ile I
Leucine Leu L
Lysine Lys K
Methionine Met M
Phenylalanine Phe F
Proline Pro P
Serine Ser S
Threonine Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosine Tyr Y
Valine Val V 15
BỘ MÃ DI TRUYỀN (GENETIC CODE) VD: ATG ==> Thr ==> Threonine ==> nếu viết
tắt 1 kí tự thì là chữ T
Những cái cần lưu ý
1/ Nhiều aa mã hoá bởi nhiều codon nhưng
Met và Tryp chỉ mã hoá bởi 1 bộ 3 duy nhất
2/ TAA, TAG, TGA là 3 stop codon
3/ Viết tắt 1 kí tự aa nhiều khi trùng với Nu (A,
C, G, T)
==> Cái này sẽ quan trọng trong phần danh
pháp đột biến: Nếu mà đọc protein thì sẽ có
chữ p đi trước; còn được Nu thì sẽ có chữ c,
g đi trước
Không cần nhớ, thực tế cũng không ai giải
trình tự protein; người ta chỉ giải trình tự
gene xong từ đó suy ra trình tự aa

16. 16
Nhắc lại Intron luôn bắt đầu = GT và kết thúc
bằng AG
==> Phiên mã ra cái RNA nguyên thuỷ bắt đầu
bằng GU
==> Các protein cắt chỉ cần thấy GU là vứt
(RNA processing)

17. INTRON CẦN CHO SỰ GHÉP NỐI EXON
17
Mô tả kĩ hơn
thấy GU thấy AG
nối 2 đầu lại với nhau tạo
thòng lọng
cắt bỏ nó đi, chỉ chừa
lại exon

18. 18
1. CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN
2. CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN
3. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
4. MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN
5. CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

19. 19
ĐỊNH NGHĨA ĐỘT BIẾN GEN (MUTATION)
Sinh học: Đột biến gen dùng để chỉ bất kỳ sự thay đổi trình tự,
cấu trúc nucleotide nào của gen.
Y học: Đột biến gen gây bệnh (disease-causing mutation) để chỉ
sự thay đổi trình tự, cấu trúc nucleotide của gen để gây ra bệnh
Các kiểu biến thể của gen (variant):
1. Biến thể lành tính (benign)
2. Biến thể có thể lành tính (likely benign)
3. Biến thể không rõ ý nghĩa
(VUS: variant of uncertain significance)
4. Biến thể có thể gây bệnh (likely pathogenic)
5. Biến thể gây bệnh (pathogenic)
Khi thực tế giải trình tự gene BN ra mà không thấy giống
như trên ngân hàng gene, có thể nó là 1 trong 5 biến thể
sau đây
==> Không phải biến thể là đột biến gene
= gặp trên người bình thường
= bth nhưng ít bình thường hơn
= chắc chắn không có người lành
= xuất hiện nhiều ở người bệnh nhưng tính chất gây bệnh của nó
chưa chứng minh được trên các mô hình thử nghiệm
cái này mới khó = xuất hiện tỉ lệ nhiều ở người bệnh hơn là
người không bệnh. nhưng ý nghĩa nó chưa rõ ràng. Tỉ lệ
nhóm này càng nhiều khi mà công nghệ gene giải trình tự
càng phổ biến; thấy trên ng bình thường có rất nhiều biến thể
mà không phải trong ngân hàng tham chiếu
==> Biến thể không rõ chức năng = VUS
cái từ đột biến gene nó tuỳ vào văn cảnh. Trong
y học của mình thì đột biến tức là nói cái số 4, 5;
tức là nó phải gây bệnh
Còn sinh học thì đột biến = biến thể

20. 20
PHÂN LOẠI BIẾN THỂ CỦA GEN
Phân loại theo cấu trúc
1. Mất nucleotide (deletion): frameshift hay in-frame?
2. Thêm nucleotide (insertion)
3. Thay thế nucleotide:
+ Đồng nghĩa/ im lặng (synonymous/ silent): Không thay
đổi amino acid
+ Sai nghĩa (missense): Thay đổi amino acid
+ Vô nghĩa (nonsense): Tạo stop codon
4. Biến thể phức tạp
Phân loại theo chức năng
1. Đột biến mất chức năng (loss-of-function)
2. Đột biến thêm chức năng (gain-of-function)
2 kiểu phân loại
Nếu mất bội số của 3 ==> khung đó vẫn như ban đầu = inframe
= bảo tồn khung
Mất đi không phải bội số 3 ==> lệch khung ==> frameshift
Ins = chèn đoạn
(TAG, TAA, TGA)
Có nhiều đột biến phức tạp xảy ra, chỗ thì chèn, chỗ thì xoá,.. ==> không biến cơ chế đột biến ntn, chỉ biết vùng đó bị thay đổi
= activating mutation

21. 21
DANH PHÁP VỀ ĐỘT BIẾN GEN
(den Dunnen JT, Human Mutation 2000;15:7-12)
• Adenine đầu tiên của mã khởi đầu ATG mang số +1,
• “c.” để chỉ cDNA (complementary DNA)
• “g.” để chỉ genomic DNA
• “IVS” chỉ intron: G của GT đầu tiên trong intron mang số
+1, G của AG cuối cùng trong intron mang số -1
• “p.” để chỉ protein
• “del” = deletion
• “ins” = insertion
1. p.E746_A750del: Đột biến mất 5 amino acid (từ glutamate
746 đến alanine 750)
2. c.218T>C: Thay T bằng C tại vị trí 218 của cDNA
3. IVS2+1G>T: Thay G bằng T tại vị trí đầu tiên của intron 2
(vì mỗi gene luôn khởi đầu với ATG ==> A đánh số +1)
c ý muốn nói tới DNA mà mình chỉ quan tâm Exon, không có đang tính intron. c =
complementary DNA = DNA mà có trình tự BỔ SUNG giống hệt RNA TRƯỞNG THÀNH)
Này có cả intron, exon
VD: Intron số 2 đột biến thì ghi là IVS2. Nguyên tắc
đánh số cũng hơi lạ so với exon
1/ Bắt đầu = GT nên là G = +1; T = +2; rồi đánh tới
2/ Kết thúc = AG nên G cuối = -1; A = -2; giả sử kết
thúc CAG thì C là -3
tại vì có mấy chữ viết tắt của aa trùng với chữ viết tắt Nu nên
phải có chữ p đi trước nếu như mình đang nói về đột biến aa

22. p = đang nói tới protein, aa các kiểu
del = đang nói tới mất đoạn
E = tra cái bảng nó là Glutamate; A
là Alanine
==> Đột biến chuỗi aa, mất đoạn từ
Glutamate vị trí 746 tới Alanine 750
c = đang nói tới DNA không có intron; thay đổi Nu trên gene
Thay đổi Thyamine thành Cytosine; vị trí thay đổi đó là 218
IVS2 = đột biến vùng intron số 2
+ 1 = vị trí Nu đầu tiên của intron số 2
G>T = thay G bằng T
==> còn gene nào trên này chưa thể hiện; đề sẽ phải nói rõ ra

23. ĐỘT BIẾN ĐIỂM CỦA EXON
Đồng nghĩa
(silent)
Sai nghĩa
(missense)
Vô nghĩa
(nonsense)
22
= không mất đoạn, không thêm đoạn chỉ là thay thế thôi

24. 23
ĐỘT BIẾN MẤT NUCLEOTIDE
Đột biến gen KIT trong u mô đệm đường tiêu hóa
(c.1669_1674del hoặc p.W557_K558del)
Bảo tồn khung đọc (in-frame mutation)
Chỗ này thầy nói gì không hiểu khúc đầu
==> khúc sau là nó mất 6 nu ==> khúc sau vẫn bảo
tồn
Có 2 cách đọc cái này
1/ Đọc theo Nu thì c. 1669_1674del ==> mất từ T đến G
2/ Đọc theo aa thì p.W557_K558del tức là mất cái aa Trp và Lys ở vị
trí 557, 558

25. 24
ĐỘT BIẾN MẤT NUCLEOTIDE
Lệch khung đọc (frameshift mutation)
Gen BRCA1 trong ung thư vú: c.5335delC
(p.Gln1779Asnfs, p.Q1779Nfs*14)
do nó mất có 1 chữ à
nguyên tắc của TB là nếu có lệch khung đọc hầu như
nó sẽ tạo ra 1 mã dừng sớm
VD: bình thường nó tạo được tới 2000aa với chuỗi cũ
thì chuỗi mới nó tới 1792 là nó dừng rồi
Nếu là đoạn thì không cần có tên Nu; nhưng 1 Nu thì sau chữ del
phải có chữ C
Đối với danh pháp mất đoạn theo aa thì có 2 cách: gọi tắt 1 chữ cái hoặc
gọi tắt 3 chữ cái
- đột biến lệch khung có thêm chữ fs (frameshift)
- Tạo ra 13 aa đến aa thứ 4 thì dừng lại ==> thì ghi thêm *14
==> Nói chung cái này phức tạp không cần đọc kĩ, thầy gợi ý để tìm hiểu

26. 25
ĐỘT BIẾN THÊM NUCLEOTIDE
Gen KIT trong bệnh u mô đệm đường tiêu hóa:
c.1509_1510insGCCTAT(p.Y503_F504insAY)
Bảo tồn khung đọc
Nhân đoạn nội tại (internal tandem duplication)
vẫn là inframe nhưng mà là kiểu thêm vào (nó nhân cái 502, 503 lên)
thầy không giải thích cái danh pháp này

27. 26
ĐỘT BIẾN THÊM NUCLEOTIDE
Gen ATP7B trong bệnh Wilson: c.525_526insA
Lệch khung đọc = Cái này thêm nhưng làm lệch khung đọc

28. 27
ĐỘT BIẾN IM LẶNG
(Gen perforin trong hội chứng thực bào máu: c.630C>T)
SNP (Single Nucleotide Polymorphism): > 1% dân số
• Hầu hết không gây bệnh
• Có thể tạo vị trí giống intron mới, gây nối ghép RNA
bất thường
Đa phần các đột biến im lặng là các ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN; chiếm >1% dân số và HẦU HẾT không gây bệnh
vẫn có thể gây bệnh

29. 28
Đột biến c.1824C>T trên exon 11
của gen LMNA
HUTCHINSON-GILFORD PROGERIA SYNDROME
Hội chứng lão hoá sớm ==> hầu như ảnh hưởng đễn xương, răng
Bình thường nếu giải trình tự ra nó cùng
mã hoá cho Gly thì có gây bệnh gì đâu??

30. 29
Bình thường nó là
GGC
Giải ra nó là GGT ==> GT bị hiểu nhầm là khởi đầu cho cái intron
exon 11 bị cắt bỏ phần đuôi từ GT trở đi
==> Gây bệnh

31. 30
ĐỘT BIẾN SAI NGHĨA
Gen HBB trong bệnh hemoglobin (HbE)
c.79G>A , p.E27K
• Các đột biến làm thay đổi các amino acid quan trọng
có thể gây bệnh
• Nhiều trường hợp là SNP
Gen PFR1 / hội chứng thực bào máu:
c.10C>T, p.R4C
Những cái đột biến Nu đơn kiểu này; kể cả tạo ra các đột
biến sai nghĩa (khác aa) thì hầu hết cũng chỉ là SNP (đa
hình Nucleotide đơn) không gây bệnh. VD đa hình trong hội
chứng thực bào máu
TRỪ KHI nó là 1 aa rất quan trọng trong cái protein đó VD
bệnh HbE

32. 31
ĐỘT BIẾN VÔ NGHĨA
Gen P53 trong ung thư khoang miệng: c.586C>T
(p.R196X)
Thường làm mất chức năng protein và gây bệnh
ngược lại, hầu hết các đột biến vô nghĩa là đột biến gây bệnh

33. 32
ĐỘT BIẾN MẤT CHỨC NĂNG
Đột biến surfactant protein C (SP-C)
trong bệnh phổi mô kẽ ở trẻ em:
c.218T>C (p.Ile73Thr)
Giờ qua phân chia theo chức năng gồm có 2 nhóm: đột biến mất chức năng hoặc đột biến tăng chức năng
Surfactant quan trọng trong PN tạo ra lớp phủ; giảm
sức căng bề mặt ==> làm PN không xẹp
quá trình trưởng thành hoá protein để thành protein có
chức năng cuối cùng
==> Nếu như đột biến thì không tạo ra được protein có
chức năng cuối cùng
(không nói cơ chế)

34. 33
ĐỘT BIẾN THÊM CHỨC NĂNG
• Đột biến JAK2 trong rối loạn
tăng sinh tủy (đa hồng cầu, tăng
tiểu cầu nguyên phát, xơ tủy)
• Các đột biến tiền gen sinh ung
trong ung thư (proto-oncogene)
• “hotspot”: Vùng thường tập
trung đột biến của gen
JAK 2 quan trọng trong hoạt hoá chức năng của
các dòng TB tạo máu
==> JAK 2 đột biến làm gia tăng các dòng TB
máu
1 gene chỉ có 1 số exon nhất định là THƯỜNG
có đột biến
==> Gọi là điểm nóng. VD K phổi, K trực tràng,..
==> trên LS trước tiên ngta tập trung đi tìm
những vùng đó trước

35. 34
1. CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN
2. CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN
3. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
4. MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN
5. CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

36. 35
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
• Đột biến gen đã biết trước: Các
kỹ thuật dựa trên PCR đơn
thuần (Polymerase Chain
Reaction)
• Đột biến gen mới và cũ: PCR
kèm giải trình tự chuỗi DNA
(Sanger DNA sequencing), giải
trình tự thế hệ mới (NGS: next-
generation sequencing)
Bệnh phẩm
Tách chiết DNA hoặc
RNA
PCR
Giải trình tự chuỗi
DNA
2 tình
huống chính
đã biết trước là nó có đột biến nào rồi và không quan tâm đột
biến mới
(thiết kê đoạn mồi mà mình quan tâm)
dù nó là tình huống nào phải có bệnh
phẩm phù hợp
- nếu bệnh di truyền ==> thì đơn giản, lấy
chỗ nào cũng được, đa phần là máu/ mô
niêm mạc
- Nếu bệnh mắc phải ==> thì khó hơn,
phải lấy đúng chỗ mình nghi ngờ ung thư

37. 5’ 3’
3’ 5’
Đoạn gen cần khuếch đại
1
Biến tính bằng nhiệt
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
2
3’ 5’
5’ 3’
Cho mồi bắt cặp
NGUYÊN TẮC PCR
3
Tổng hợp DNA
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
3’
36
= sử dụng một đoạn mồi để làm
giàu/khuyếch đại 1 đoạn gene trong
ống nghiệm
= tách 1 chuỗi đôi DNA thành 2 chuỗi đơn = nhiệt độ
= sau đó có đoạn mồi + nguyên liệu để
tổng hợp đoạn ở giữa 2 đoạn mồi đó
(mồi)
(mồi)

38. 37
Real-time PCR
(Quantitative PCR, Q-PCR)
Tinh sạch
sản phẩm
DNA sequencing
Wild-type
sequence
Mutated
sequence
A
AAG GTT GTT
558 559 560
Lys Val Val
GAG GAG ATA AAT GGA AAC AAT TAT GTT TAC ATA GAC CCA ACA CAA CTT
561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576
Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu
CCT TAT GAT
AAG GTT GTT CCT TAT GAT CAC AAA TGG GAG TTT CCC AGA AAC AGG CTG AGT TTT G
Lys Val Val Pro Typ Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe
Wild-type
sequence
Mutated
sequence
A
AAG GTT GTT
558 559 560
Lys Val Val
GAG GAG ATA AAT GGA AAC AAT TAT GTT TAC ATA GAC CCA ACA CAA CTT
561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576
Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu
CCT TAT GAT
AAG GTT GTT CCT TAT GAT CAC AAA TGG GAG TTT CCC AGA AAC AGG CTG AGT TTT G
Lys Val Val Pro Typ Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe
Điện di
PHÂN TÍCH SẢN PHẨM PCR
Điện di = định tính Định lượng ==> VD: đo tải lượng virus
sau khi có cái này rồi thì tuỳ mục đích của mình
mình sẽ phân tích định lượng hoặc định tính
- VD: nếu nghi ngờ nhiễm VK/virus gì đó thì chỉ
cần xem thử đoạn đó có hay không
==> Nếu muốn biết VK có đột biến
không thì phải làm sạch ==> xong rồi giải trình tự
- còn VD muốn đo tải lượng thì lấy sp đó đi định
tính
==> Học bài ứng dụng SHPT trong bệnh di truyền
thì kĩ hơn

39. 38
1. Tạo sản phẩm ngắn
2. Thiếu “trung thực” (infidelity): Taq DNA
polymerase không có hoạt tính proofreading
NHƯỢC ĐIỂM CỦA PCR
Phải sử dụng polymerase có hoạt tính sửa
sai khi cần giải trình tự chuỗi DNA
ưu điểm = nhanh, nhạy
Tức là trong cơ thể sẽ có những cơ chế sửa lỗi nếu quá
trình này có gì sai sót
==> Nhưng trong ống nghiệm thì không có điều đó
==> Tự tạo ra đột biến
Khi giải trình tự gene đặc biệt gene người thì phải chọn
loại có khả năng sửa sai
Loại mà chỉ định lượng có hay không có băng mình
đang kiém thì polymerase của nó cùi, gía rẻ
Nhưng mà loại mà sau đó cần giải trình tự xem có đột
biến gì hay không thì polymerase phải xịn
`

40. 39
ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide):
CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN ĐIỂM Áp dụng cho trường
hợp muốn tìm đột
biến đã biết trước
VD trong trường hợp này muốn kiếm cái gene có đột biến với Nu
T; thì mình thiết kế đoạn mồi có chữ A thì khi khớp vào T mới đi
tiếp được; còn đoạn mồi khởi đầu bằng C thì không đi tiếp được
gọi là ASO (đặc
trưng cho Allele)

41. TTC Đột biến
(Phe)
GTC Bình thường
(Val)
1 2 3 4
Băng chứng nội (F-R1)
Băng đột biến (F-R2)
1. 100-bp ladder
2. Mẫu bệnh nhân
3. Chứng âm
4. Chứng dương 40
ĐỘT BIẾN ĐIỂM JAK2 V617F
TRONG RỐI LOẠN TĂNG SINH TỦY
AAG----
F R2 R1
Bình thường, GTC mã hoá cho Val; nếu đột biến gene
JAK2 thì thành TTC thì mã hoá cho Phe; tại codon số
617 nên ghi là V617F
Bây giờ mình muốn đi tìm xem nó có đột biến này hay
không?
(1) Mình sẽ cố định 1 đoạn chứng nội; tức là 2 đoạn mồi
F và R1 sẽ bắt lên vùng gene bình thường
==> sản phẩm tạo ra 1 băng chứng nội độ dài từ F tới
R1
(2) Mình làm thêm đoạn mồi R2 chỉ có thể bắt cặp với
đột biến vì nó bắt đầu bằng A (thì chỉ có thể gắn với đột
biến chỗ T)
==> Sản phẩm tạo ra 1 băng đột biến có độ dài F-R2
(băng này ngắn hơn nên nhẹ hơn F-R1)
==> Đây là điển hình cho ứng dụng ASO-PCR để tìm đột
biến điểm đã biết trước (trong K, trong đột biến VK,..)

42. 41
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI NGS
150-300 bp gắn lên
giá thể
hiện tại có thể giải được 1 bộ gene người chỉ trong vài
ngày
==> Nhưng vấn đề là giải thích được cái data đó, chứ
không phải cái data không

43. 42
1. CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN
2. CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN
3. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
4. MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN
5. CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

44. • Nguy cơ bệnh: BRCA1/2 (ung thư vú), APC (đa polyp tuyến gia đình),
VHL (ung thư thận), đột biến vùng precore của HBV (ung thư gan), LDLR
(tăng cholesterol gia đình), yếu tố V Leiden (huyết khối tĩnh mạch sâu)…
• Chẩn đoán bệnh: JAK2 (tăng sinh tủy), globine (thalassemia), BTK (X-
linked agammaglobulinemia), ATP7B (bệnh Wilson),… Có khoảng 10.000
bệnh đơn gen ở người.
• Tiên lượng bệnh: P53 (các loại ung thư); FLT3, NPM1, CEBPA (bạch
cầu cấp), IDH1 và IDH2 (glioma)…
• Điều trị nhắm trúng đích phân tử: EGFR (ung thư phổi), KRAS và
NRAS (ung thư đại trực tràng), KIT và PDGFRA (GIST), BRAF
(melanoma), BRCA1/2 (ung thư buồng trứng), PIK3CA (ung thư vú)...
• Pharmacogenetics
ỨNG DỤNG CỦA XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN
43
thầy đọc hết tất cả những gene này
Nhưng gene này đã được đưa vào tiêu chuẩn
chẩn đoán
cái này trong U não thì có hay không có đột biến IDH-1 rất khác về tiên lượng
Trong bài điều trị; thầy nói sau
có bài riêng; để kiểu như với gene người này thì không nên dùng thuốc A, B,
C,… hoặc dùng với liều sao sao đó

45. BỆNH THALASSEMIA
44
Cơ chế bệnh sinh, biểu hiện LS không đề cập lại

46. ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GLOBIN GÂY
α-THALASSEMIA: GAP-PCR
(Chong S, Clinical Chemistry 2000)
45
90-95% các trường hợp là do nó thiếu gene Alpha 1, 2 hoặc kết hợp gì của 2 cái đó = TỨC LÀ NÓ MẤT 1 ĐOẠN GENE
DÀI ==> NGƯỜI TA PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐOẠN GENE ĐÓ
VD: alpha 3.7 là mất đoạn 3.7kb; alpha 4.2 là mất 4.2kb
cái đoạn SEA là đông nam á; mất khoảng mười mấy kb
người Thái thì có đoạn mất khác
Trong trường hợp này người ta dùng kĩ thuật gọi là GAP-PCR.
nguyên tắc như sau:
(1) VD với mất đoạn SEA, khoảng vài chục kb: người ta thiết kế
đoạn mồi SEA-F và SEA-R.
(2) Bình thường, 2 đầu SEA-F và R cách nhau rất xa, nó không
có khả năng khuyếch đại đc
(3) Nếu BN có đột biến mất đoạn SEA, thì F và R tiến lại gần
nhau ==> khuyếch đại được ==> Khuyếch đại chỉ xảy ra trên
đoạn mồi này nếu như có khoảng trống (GAP) do đột biến mất
đoạn SEA. Đoạn khuyếch đại này được nhận diện bằng phương
pháp điện di
===> Tương tự, người ta cho rất nhiều đoạn mồi THAI F và R;
alpha 3.7 F và R; … cũng dựa trên nguyên tắc mất đoạn GAP

47. ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN (HBB)
TRONG β-THALASSEMIA
Beta-thalassemia
(c.79G>T)
Beta-thalassemia: HbE
(c.79G>A)
Exon 1 Exon 2 Exon 3
46
Beta-thalassemia (c.124_127delTTCT)
Khác với alpha, 95% là nó đột biến các điểm nhỏ
Nếu làm giảm thì b+; còn thiếu hoàn toàn đoạn beta thì
b0
May là gene b này không dài; chỉ có 3 exon, người ta có
khả năng khuyếch đại toàn bộ gene này = 1 phản ứng
PCR duy nhất = 1.6kb
==> Giải trình tự Sanger thì phát hiện được toàn bộ các
khả năng
==> Vài ví dụ

48. 47
Riêng trong beta Thalas thì có đột biến xảy ra ở vùng
giữa Intron (thường intron chỉ bị đột biến vùng đầu và
cuối mới gây bệnh thôi

49. 48
= ứ đọng đồng ở mô gan là chủ yếu +/- não +/- máu
dị hợp tử (1 NST thì 1 điểm)
2 đột biến cùng allele hoặc khác allele trên 2 NST = 4
điểm ==> mà CĐ bệnh chỉ cần 4 điểm thôi

50. ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG BỆNH WILSON
• Rối loạn di truyền lặn/ NST thường.
• Lắng đọng đồng trong các mô.
• Triệu chứng tâm thần, thần kinh và bệnh gan.
• Đột biến trên 21 exon của gen ATP7B.
49
Vài minh hoạ thôi
==> tìm đọc thêm, thầy không nói gì nhiều

51. ĐỘT BIẾN GEN PERFORIN (PRF1)
TRONG HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS
(HLH: HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU)
(Weitzman S, Blood 2011)
(Voskoboinik I, Nat Rev Immunol 2006)
Exon 1 Exon 2 Exon 3
ATG
50
Cùng 1 hội chứng nhưng ở những chủng tộc khác
nhau thì gene đột biến là khác nhau
Người da trắng đa phần type 2; tức là >50% sẽ đột
biến gene PRF1
Còn ở VN thì rất ít; phát hiện chủ yếu là unc13.4

52. ĐỘT BIẾN GEN UNC13D (MUNC13-4) TRONG HLH
Ở BỆNH NHÂN VIỆT NAM
51

53. Tóm lại ở VN thì thể nhiều nhất là type 3. tức là gene
UNC13D hay gọi là UNC

54. ĐỘT BIẾN YẾU TỐ V LEIDEN
• Đột biến codon 506: Arginine (R) > Glutamine (Q)
• Được tìm thấy trên 16 – 27% bệnh nhân da trắng bị huyết khối tĩnh mạch
• Xác định bằng nhiều kỹ thuật (PCR, giải trình tự chuỗi DNA)
cũng là cùng biểu hiện bệnh nhưng đột biến khác nhau ở các chủng tộc
Trong điều kiện đột biến thì yếu tố V không bị phá
huỷ mà giữ trạng thái cũ
==> Làm tăng đông
Tức là 25% người châu Âu có HKTM là có yếu tố V
Leiden

55. 54
YẾU TỐ V LEIDEN (c.1691G>A)
TRONG HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH Ở BỆNH NHÂN VIỆT NAM
• 80 bệnh nhân bị huyết khối tĩnh mạch sâu: 25 nam và 55
nữ (53 ± 18 tuổi)
• 180 người không bị huyết khối tĩnh mạch
• Tần suất alen c.1691A ở người Việt Nam là 0/520
Nhưng mà người VN thì khác
==> Khảo sát 250 người có HKTM thì 0/250 có;
khảo sát các nước xung quanh mình cũng không
có
==> người châu Á hình như rất hiếm V Leiden

56. 55
CÁC LƯU Ý VỀ ĐỘT BIẾN GEN
2. Biến thể gen gây bệnh hay vô hại?
• Dựa vào các nghiên cứu đã công bố (đột biến hay SNP)
• Các biến thể mới: dựa trên các phần mềm dự đoán và
nghiên cứu chức năng.
• Cơ sở dữ liệu ban đầu của người Việt: “A Vietnamese
human genetic variation database”
https://doi.org/10.1002/humu.23835
1. Phổ đột biến gen giữa các chủng tộc thường khác nhau
• Cần nghiên cứu trên người Việt Nam
• Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nên được sử dụng
• Phát triển các bộ kit chẩn đoán phù hợp
3. Chi phí cao: Vai trò quan trọng của bác sĩ lâm sàng trong
chỉ định và tư vấn trước/sau xét nghiệm
nghiên cứu trên quần thể mới thì phải làm giải trình tự
thôi; chứ dùng PCR thì chỉ biết được những đột biến đã
có thôi; không biết là cái nhóm mới này có gì lạ không
rồi từ những cái mình tìm được trên quần thể của mình thì mới phát triển kit phù hợp
có thể dùng những gợi ý sau
(nếu như những quần thể khác chưa có thì mình có thể dùng phần mềm)
(của Vinmec tài trợ; lấy bộ gene của khoảng 400 người Việt bình thường
==> nếu mình thấy có gì lạ thì có thể so với bộ này cũng là 1 cách)
nói chung phải có plan trước khi yêu cầu đi làm XN gene

57. 56
Thời điểm (1): Thấy có nhiều VDV da đen tham gia môn đối
kháng bị đột tử; khám ra thì thấy có gene A ==> khuyến cáo
VDV da đen có gene A không nên tham gia môn đối kháng
Thời điểm (2): Phát hiện được gene đó rất phổ biến ở cộng
đồng ng da đen ở châu Phi sống thọ
==> Dù nó hiếm ở ng da trắng nhưng phổ biến ở ng da đen
==> 1 trường hợp CĐ lầm ==> sau đó xem lại nó là biến thể
lành tính
==> Luôn sử dụng những người cùng chủng tộc để giải
thích một biến thể của gene

58. 57
TÓM TẮT
1. Đột biến gen gặp trong các bệnh di truyền và bệnh mắc phải.
2. Xác định đột biến gen có thể giúp cho chẩn đoán, tiên lượng,
điều trị và đánh giá nguy cơ bệnh tật.
3. Đột biến gen có thể xảy ra ở exon và intron, cần đọc đúng tên
các đột biến.
4. Không phải biến thể nào của gen cũng gây bệnh.
5. Phổ đột biến mất chức năng thường phân tán, đột biến thêm
chức năng nằm trong vùng “hotspot” của gen.
6. Đột biến gen thường khác nhau giữa các chủng tộc.
7. Giải trình tự DNA là phương pháp thích hợp cho việc phát hiện
đột biến trên dân số nghiên cứu mới.
8. Các kỹ thuật dựa trên PCR đơn thuần không định danh được
các đột biến mới.