1. SVEUČILIŠTE U RIJECI
ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU
Diplomski sveučilišni studij
Biotehnologija u medicini
Mia Merlak
Diplomski rad
Parametri oksidativnog stresa i upalnog odgovora na BV-2
mikroglija stanicama u in vitro hipoksiji
Rijeka, 2014
2. SVEUČILIŠTE U RIJECI
ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU
Diplomski sveučilišni studij
Biotehnologija u medicini
Mia Merlak
Diplomski rad
Parametri oksidativnog stresa i upalnog odgovora na BV-2
mikroglija stanicama u in vitro hipoksiji
Rijeka, 2014
3. Mentori rada: Prof. dr. sc. Jasenka Mršić Pelčić
Prof. dr. sc. Natalia Kučić
Diplomski rad obranjen je dana ______________________
pred povjerenstvom:
1. Prof. dr. sc Sandra Kraljević Pavelić
(predsjednik)
2. Prof. dr. sc Miranda Mladinić Pejatović
(član)
3. Prof. dr. sc. Natalia Kučić
(član)
Rad ima 43 stranice, 18 slika, 3 tablice i 58 literaturnih navoda
4. SAŽETAK:
U fiziološkim uvjetima, mikroglija stanice u središnjem živčevlju su odgovorne za
niz dinamičnih staničnih funkcija neophodnih za normalno funkcioniranje kao npr.
sinaptička plastičnost, funkcija makrofaga, imunološka zaštita mozga itd.
Međutim, primijećeno je da u određenim patološkim uvjetima, aktivacija
mikroglije može doprinjeti neuronalnom oštećenju. Cilj ovog rada bio je ispitati
ponašanje BV-2 mikroglija stanica u uvjetima kontrolirane in vitro hipoksije.
Nakon uspostave modela, BV-2 mikroglija stanice izložene su hipoksiji (<2%
kisika) tijekom 6 sati. Neposredno po završetku hipoksije te nakon 24 h, 48 h, 72
h i 168 h, praćene su promjene morfoloških obilježja stanice, ekspresija markera
oksidativnog stresa (iNOS) te markeri upale odnosno oštećenja stanice (COX-2,
Hsp70; MHC I, IL-1β). Promjena morfološkog statusa mikroglija stanica te
povećana ekspresija gore spomenutih pokazatelja oksidativnog stresa i upale u
različitim vremenskim razdobljima nakon izloženosti patološkim uvjetima,
upućuju na zaključak da je u našem eksperimentalnom modelu došlo do snažne
aktivacije mikroglija stanica, kao odgovor na kontroliranu hipoksiju.
Ključne riječi: Mikroglija, hipoksija, oksidativni stres, moždana upala, BV-2
5. TITLE: The parameters of oxidative stress and inflammatory response on
BV-2 microglial cells under in vitro hypoxia
SUMMARY:
In physiological conditions, microglial cells in the central nervous system are
responsible for a series of dynamic cellular functions necessary for the normal
functioning, e.g. synaptic plasticity, macrophage function of the brain,
immunological protection of the brain, etc. However, it has been shown that in
certain pathological conditions, activation of microglia may contribute to neuronal
damage. The aim of this study was to investigate the behavior of BV-2 microglial
cells under controlled in vitro hypoxia. After the establishment of the model, BV-
2 microglial cells were exposed to hypoxia (<2% oxygen) for 6 hours.
Immediately after the end of hypoxia and following to 24, 48, 72 and 168 hr
period, the change of the morphological characteristics of the cells and the
expression of markers of oxidative stress (iNOS) and inflammation or cell
damage (COX-2, Hsp70, MHC class I, IL-1β) were monitored. The alteration of
the morphological status of microglial cells and increased expression of the
above-mentioned indicators of oxidative stress and inflammation in different
periods of time after exposure to pathological conditions, suggests that in our
experimental model, there was a strong activation of microglial cells in response
to controlled hypoxia.
Key words: Microglia, hypoxia, oxidative stress, neuroinflammation, BV-2
6. SADRŽAJ
1. UVOD.................................................................................................................................... 1
1.1. Hipoksija........................................................................................................................ 1
1.1.1. Nedostatakenergije i ekscitotoksičnost.................................................................... 2
1.1.2. Peri-infarktne depolarizacije.................................................................................... 3
1.1.3. Upala ..................................................................................................................... 4
1.1.3.1. Citokini u upali mozga...................................................................................... 4
1.1.3.2. Kemokini u upali mozga................................................................................... 5
1.1.3.3. Stanične adhezijske molekule........................................................................... 5
1.1.3.4. Matriks metaloproteinaze................................................................................ 6
1.1.3.5. Regulatorni T limfociti...................................................................................... 6
1.1.4. Programirana stanična smrt..................................................................................... 7
1.2. Slobodni radikali, oksidacijski stres i mehanizmi nakon hipoksije....................................... 8
1.2.1. Slobodni radikali ..................................................................................................... 8
1.2.2. Oksidacijski stres..................................................................................................... 8
1.3.3. Oksidacijski stres kao reakcija na hipoksiju..................................................................... 9
1.3. Mikroglija.....................................................................................................................10
1.4. Model BV-2 mikroglija stanica........................................................................................15
1.5. Parametri mjereni uistraživanju.....................................................................................16
1.5.1. COX-2....................................................................................................................16
1.5.2. Hsp70....................................................................................................................16
1.5.3. iNOS......................................................................................................................17
1.5.4. IL-1......................................................................................................................17
1.5.5. MHC-I....................................................................................................................18
2. CILJ RADA.............................................................................................................................19
3. MATERIJALI I METODE...........................................................................................................20
3.1. Materijali......................................................................................................................20
Kemikalije:............................................................................................................................20
Mediji i puferi:......................................................................................................................20
3.2. Metode ........................................................................................................................21
3.2.1. Uzgoj adherentne BV-2 stanične linije .....................................................................21
3.2.2. Postizanje hipoksijskih uvjeta uizobaričnoj komori ..................................................21
3.2.3. Mikroskopska analiza.............................................................................................21
7. 3.2.4. Priprema staničnoglizata........................................................................................22
3.2.5. Gel-elektroforeza...................................................................................................22
3.2.6. Elektroblot proteina s akrilamidnog gela na nitroceluloznu membranu .....................22
3.2.7. Kemiluminiscencija.................................................................................................22
4. REZULTATI............................................................................................................................23
4.1. Morfološke promjenenaBV-2mikroglijastanicamauuvjetima in vitro kontrolirane
hipoksije..................................................................................................................................23
4.2. Ekspresijapokazateljaoksidativnogstresai upale BV-2mikroglijastanicauuvjetima in vitro
kontrolirane hipoksije...............................................................................................................25
5. RASPRAVA............................................................................................................................32
5.1. Morfološke promjenenaBV-2mikroglijastanicamauuvjetima in vitro kontrolirane
hipoksije..................................................................................................................................32
5.2. Ekspresijapokazateljaoksidativnogstresai upale BV-2mikroglijastanicauuvjetima in vitro
kontrolirane hipoksije...............................................................................................................32
6. ZAKLJUČAK...........................................................................................................................36
LITERATURA.................................................................................................................................37
ZAHVALA.....................................................................................................................................42
ŽIVOTOPIS ...................................................................................................................................43
8.
9. 1
1. UVOD
1.1. Hipoksija
Hipoksija je stanje praćeno sniženom razinom kisika u arterijskoj
krvi, a kao posljedica javljaju se poremećaji u funkcioniranju organa,
sustava i stanica (1). Nedostatak kisika naročito pogađa stanice središnjeg
živčevlja (SŽ), poglavito moždanog tkiva. Živčane stanice mozga su
postmitotičke. One naime ne posjeduju sposobnost razmnožavanja te su
oštećenja mozga, bez obzira na porijeklo, karakterizirana trajnim
promjenama i rezultiraju neurološkim deficitima. Budući da ishemija i
hipoksija predstavljaju vrlo čest patofiziološki uzrok moždanog oštećenja,
predmet su intenzivnog istraživanja. Pri tom se koriste različiti
eksperimentalni in vivo ili in vitro modeli koji “imitiraju” kliničku sliku niza
bolesti praćenih ishemijom/hipoksijom mozga kao što su infarkt miokarda,
zastoj srca, neregularni otkucaji srca, trauma mozga odnosno ishemijski
moždani udar.
Slika 1. Kaskada štetnih događaja nakon hipoksije (preuzeto i prilagođeno
iz 2)
Kaskada patoloških događaja nakon infarkta uključuje ekscitotoksičnost,
periinfarktne depolarizacije, upalu i programiranu staničnu smrt (slika 1).
10. 2
1.1.1. Nedostatak energije i ekscitotoksičnost
Moždano tkivo koristi velike količine kisika i glukoze te ovisi o
oksidativnim fosforilacijama za stvaranje energije. Prekid dotoka krvi u
mozak ograničava dotok nutrijenata, pogotovo kisika i glukoze. Niske
razine ATP-a (adenozin trifosfata) uzrokuju nefunkcioniranje mnogih
mehanizama koji održavaju integritet stanice i narušavaju potrebnu
energiju za postizanje ionskih gradijenata (3). Zbog manjka energije
odnosno ATP-a membranski potencijal je izgubljen pa se neuroni i glija
depolariziraju. Posljedično tome somatodendritički i presinaptički Ca2+
kanali se aktiviraju i ekscitacijske aminokiseline se otpuštaju u vanstanični
prostor (slika 2). Istovremeno, presinaptički povrat ekscitatornih
aminokiselina, proces ovisan o energiji, je spriječen, što povećava
akumulaciju glutamata u vanstaničnom prostoru. Glutamat se veže na
glutaminske receptore omogučujući dodatni priljev unutarstaničnog kalcija
i natrija u živčane stanice. Aktivacija NMDA glutaminskih receptora
doprinosi prezasićenju stanica Ca2+. Kao rezultat pretjerane aktivacije
glutamatom, Na+ i Cl- ulaze u neurone putem kanala za monovalentne
ione (AMPA receptorski kanal, od engl. α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-
isoxazolepropionic acid receptor) (4). Voda potom pasivno ulazi s obzirom
da je priljev u stanicu Na+ i Cl- puno veći od priljeva K+ izvan stanice, što
izaziva edem koji uzrokuje intrakranijalni tlak i vaskularnu kompresiju.
Povećana unutarstanična koncentracija Ca2+ se smatra odgovornom za
početak serije citoplazmatskih i nuklearnih događaja koji utječu na razvoj
ozljede tkiva, a aktivacija fosfolipaze A2 i ciklooksigenaze generira
slobodne radikale izazivajući oksidacijski stres (5). Primarni nedostatak
energije dovodi do učinaka koji rezultiraju nekrozom – staničnom smrću
zbog poremećenog integriteta stanice, oštećenog citoskeleta i stanične
membrane. Nekroza se događa u stanjima ozbiljne i uznapredovale
hipoksije i ishemije prilikom čega stanice nabubre i puknu, dovodeći do
stanične i neuronske smrti. Nakon puknuća stanica, stanični sadržaj se
otpusti u okolno živčano tkivo, što dovodi do upale.
11. 3
Slika 2. Pojednostavljeni prikaz patofizioloških mehanizama kod
ishemijske ozljede mozga (preuzeto i prilagođeno iz 2)
1.1.2. Peri-infarktne depolarizacije
Ranije je spomenuto da se ishemični neuroni i glija depolariziraju
zbog nedostatka energije i otpuštanja K+ i glutamata. Neki dijelovi mozga
se teško repolariziraju, ali u svakom slučaju potrebna je energija.
Ponavljajuće depolarizacije, odnosno peri-infarktne depolarizacije su česta
pojava u hipoksiji (6). Što su češće i brojnije, to imaju jači negativni
utjecaj na infarkt.
12. 4
1.1.3. Upala
Kao što je već spomenuto upala je uz oksidativni stres jedan od
važnih patofizioloških mehanizma koji se pojavljuju nakon hipoksičnog
insulta. Niz mehanizama koji se događaju u mozgu nakon hipoksije i
oksidativnog stresa kao što su djelovanje stanica imunološkog sustava i
otpuštanje raznih medijatora upale (citokini, kemokini, slobodni radikali)
izazivaju upalu. Takvi stimulansi potiču kompleksne biološke odgovore
vaskularnog tkiva koji imaju zaštitnu ulogu i kao cilj ukloniti patogene i
oštećene stanice, da organizam može započeti proces ozdravljenja.
Mehanizmi upale potiču urođeni imunološki odgovor, a daljni procesi
aktiviraju i specifičnu, stečenu staničnu imunost. Iako upala prvotno
nastaje zbog zaštite mozga smatra se da istovremeno ima i štetan i
blagotvoran učinak na oporavak. Naime hipoksija u mozgu izaziva kronični
upalni odgovor imunoloških stanica čije djelovanje u krajnosti dovodi do
veće štete na neuronima.
1.1.3.1. Citokini u upali mozga
Citokini su grupa malih glikoproteina koji se stvaraju kao
odgovor na antigene i imaju ulogu medijatora za reguliranje urođene i
stečene imunosti. Njihova koncentracija u mozgu se povećava u raznim
bolestima i kao rezultat oštećenja tkiva. Izlučuju ih stanice imunološkog
sustava kao i rezidentne moždane stanice (neuroni i glija) (7). Periferni
fagociti, limfociti T, NK stanice i leukociti luče razne citokine koji doprinose
moždanoj upali. Istraživanja su pokazala da sljedeći citokini izazivaju
upalu nakon ishemičnog infarkta: tumor nekrozirajući faktor (TNF-),
interleukini (IL-1, IL-6, IL-20, IL-10) i transformirajući faktor rasta
(TGF-). Uočeno je da IL-1 i TNF- imaju negativan utjecaj na ozljedu
mozga, dok TGF- i IL-10 imaju neuroprotektivnu ulogu (8,9). Pojačano
stvaranje proupalnih citokina i smanjen nivo protuupalnog IL-10 izazivaju
pogoršanje stanja mozga i lošiji klinički ishod. Isto tako povećane razine
ekspresije IL-1 izazivaju veći priljev neutrofila i održavanje upalnog
stanja. IL-1 također povećava razinu cirkulirajućeg IL-6 (10) koji je
povezan sa oticanjem mozga (stvaranjem edema). Koncentracija IL-20 se
povećava nakon indukcije sa IL-1 preko NF-B staničnog puta, a poznato
je i da IL-20 također potiče stvaranje IL-6. Protuupalni citokin IL-10
djeluje tako da inhibira IL-1 i TNF-, suzbijajući izražaj i aktivaciju
13. 5
njihovih citokinskih receptora, te stoga ima neuroprotektivnu ulogu u
akutnom ishemičnom infarktu.
1.1.3.2. Kemokini u upali mozga
Kemokini imaju važnu ulogu u staničnoj komunikaciji i
regrutiranju stanica u upali. Ekspresija kemokina monocitnog
kemoprivlačnog proteina 1 (MCP-1), makrofagnog upalnog proteina-1a
(MIP-1a) i fraktalina ima negativan utjecaj na oporavak mozga nakon
ishemije jer povećava infiltraciju leukocita (11). Razna istraživanja
potkrepljuju činjenicu da uslijed hipoksije razine kemokina porastu i tako
privlače migrirajuće imunološke stanice, a njihovom inhibicijom se
smanjuje ozljeda.
1.1.3.3. Stanične adhezijske molekule
Sve je više dokaza da stanične adhezijske molekule (CAMs)
imaju važnu ulogu u patofiziologiji ishemičnog infarkta. U prvim danima
napada citokini potiču povećanu ekspresiju adhezijskih molekula koje su
odgovorne za adheziju i migraciju leukocita. Leukociti se kotrljaju po
endotelnoj površini i prijanjaju uz endotelne stanice. Interakcije između
leukocita i vaskularnog endotela su posredovane trima glavnim grupama
CAM molekulama: selektini, imunoglobulinska superobitelj i integrini.
Selektini, posebno E- i P- selektini su više izraženi i sudjeluju u kotrljanju i
regrutiranju leukocita tokom ranog stadija odgovora na hipoksiju. Iz
imunoglobulinske superobitelji najviše su istraživane unutarstanične
adhezijske molekule-1 (ICAM-1) i vaskularne adhezijske molekule-1 te je
dokazano da im je u upalnom stanju mozga ekspresija povećana, a za to
su odgovorni citokini. Također je uočeno da razina ekspresije više topljivih
unutarstaničnih adhezijskih molekula-1 (sICAM-1) je povećana u
pacijenata koji nisu preživjeli infarkt, nego u onih koji su preživjeli. Ta
činjenca upućuje na to da je upala u mozgu odgovorna za brže umiranje
stanica i pogoršanje stanja u odgovoru na ishemiju, odnosno hipoksiju.
Inhibicija aktivacije i infiltracije leukocita u ishemično tkivo se
kontinuirano istražuje pri čemu se tehnike sve više unaprjeđuju jer se
14. 6
pokazalo da adhezijske molekule imaju značajnu ulogu u terapiji upale
(12).
1.1.3.4. Matriks metaloproteinaze
Matriks metaloproteinaze (MMPs) su obitelj proteolitičkih enzima
koji su odgovorni za remoduliranje vanstaničnog matriksa i imaju
sposobnost degradacije svih njegovih sastojaka. Ekspresija MMPa u
normalnom razvijenom mozgu je jako niska, skoro nemjerljive razine, ali
u upalnom odgovoru na ozljedu je visoko izražena (13). Neuroni, astrociti,
mikroglija i endotelne stanice sve eksprimiraju MMP nakon ozljede. Novija
istraživanja pokazuju da je slom krvno-moždane barijere povezan sa
ekspresijom i aktivacijom MMP (14). MMP-2 i MMP-9 su proteinaze koje su
najviše uključene u moždanu ishemiju.
1.1.3.5. Regulatorni T limfociti
Već je spomenuto da nakon hipoksije mozga slijedi odgovor
urođenog i stečenog imunološkog sustava. Zadnja istraživanja pokazuju
da regulatorni T limfociti (Treg) uspješno štite stanice kontrolirajući
imunološki odgovor u fiziološkim uvjetima kao i u raznim sistemskim
upalama središnjeg živčanog sustava. Treg stanice stvaraju se od strane
dendritičkih ili antigen-prezentirajućih stanica sa izraženim
imunosupresivnim posrednikom indoleaminom 2, 3-dioksigenazom (enzim
kinureninskog puta koji pretvara triptofan u kinurenin) (15). Interferon- i
TNF-, koji su prisutni u velikim količinama u ishemičnom mozgu u
mikrogliji, induciraju indoleamin 2, 3-dioksigenazu kao odgovor na
kroničnu imunološku aktivaciju (16). U slučajevima inhibicije Treg stanica
dolazi do veće štete u mozgu i trajnijih posljedica, jer Treg smanjuje
aktivaciju rezidentnih mikroglija i T stanica koje su glavni izvor TNF- i
IFN- (25). Treg stanice djeluju tako da umanjuju štetne i pretjerane
aktivacije imunološkog sustava pa sprječavaju razvitak autoimunih bolesti.
Također proizvode citokin IL-10 koji, kao što je već spomenuto, ima veliki
učinak u reagiranju na infarkt, a nagađa se da ima i ulogu u moduliranju
produkcije indoleamin 2, 3-dioksigenaze. Zbog Treg stanica smanjuje se
sekundarno pogoršanje nakon infarkta zbog protudjelovanja na produkciju
15. 7
proupalnih citokina i modulirajući invaziju i aktivaciju limfocita i mikroglije
u hipoksičnom mozgu. Treg antagoniziraju povećano stvaranje TNF- i IFN-
i na taj način odgađajući naknadno pojavljivanje upale i time smanjuju
štete u mozgu (17).
1.1.4. Programirana stanična smrt
Apoptoza, nekroza i ostale programirane stanične smrti su
događaji koji se javljaju najkasnije u kaskadi patofizioloških događaja
nakon hipoksije. Apoptoza može zadesiti stanice mozga koje su ugrožene
zbog pretjerane aktivacije glutaminskih receptora, preobilne razine Ca2+
unutar stanice, kisikovim radikalima ili oštećenjima mitohondrija i DNA
(18). Što će se desiti ovisi o prirodi i intenzitetu stimulusa, vrsti stanice i
stadija životnog ciklusa ili razvoja. Dva su glavna puta za aktivaciju
apoptoze: intrinzični i ekstrinzični put. Intrinzični put uključuje unutarnje
događaje kao poremećaj mitohondrija i otpuštanje citokroma C što dovodi
do smanjenja aktivacije kaspaza. S druge strane ekstrinzični put se odvija
preko površinskih staničnih receptora koji mogu biti aktivirani sa
specifičnim ligandima koji se vežu za tzv. “receptore smrti” (19).
16. 8
1.2. Slobodni radikali, oksidacijski stres i mehanizmi nakon
hipoksije
1.2.1. Slobodni radikali
U ljudskom metabolizmu tokom života svakodnevno se događaju
brojne kemijske reakcije koje su zaslužne za održavanje normalnih
funkcija organizma. Disanje, odnosno unos elementa kisika u naše tijelo je
neophodno za život. Kada stanica koristi kisik za stvaranje energije, kao
posljedica stvaranja ATP-a u mitohondrijima, stvaraju se slobodni radikali.
Slobodni radikali u vanjskoj ljusci posjeduju jedan ili više nesparenih
elektrona, pa tako sve slobodne radikale karakterizira iznimno visoka
reaktivnost, što je rezultat njihova nastojanja da popune valentnu orbitalu
tj stabilnu elektronsku konfiguraciju. Biokemijski su najznačajniji reaktivni
oblici kisika (ROS) i reaktivni oblici dušika (RNS). Kao što je spomenuto
proces stvaranja radikala u stanici je neprekidan i vezan uz normalne
metaboličke reakcije, a to stvaranje reguliraju enzimi poput NO sintetaza
(NOS) i NAD(P)H oksidaza i njihovih izoformi. ROS i RNS su poznati po
svojoj dvojnoj ulozi da djeluju štetno i blagotvorno u organizmu. Pri
niskim koncentracijama pokazuju blagotvoran učinak u staničnim
odgovorima i imunološkoj funkciji, dok pri visokim koncentracijama
izazivaju stanje štetno za organizam (20). Visoke koncentracije slobodnih
radikala mogu nastati zbog njihovog unosa iz vanjskog okoliša (dim
cigareta, radijacija, lijekovi, zagađenja...) ili u staničnom metabolizmu ako
dođe do prevelike produkcije ROS-a (mitohondrijski respiratorni lanac ili
prekomjerna stimulacija NAD(P)H). U oba slučaja nastaje preveliki broj
slobodnih radikala koje organizam ne uspijeva uništiti i njihova
akumulacija izaziva oksidacijski stres.
1.2.2. Oksidacijski stres
Oksidacijski stres se definira kao stanje u kojem je pomak
ravnoteže u staničnim oksidativno-redukcijskim reakcijama u smjeru
oksidacije. Dolazi do prekomjernog stvaranja slobodnih radikala kisika te
ih stanice biološkog sustava zadužene za razgradnju nisu u mogućnosti
razgraditi, što rezultira promjenama vezanim uz oštećenje stanica.
Oksidacijsko oštećenje utječe na strukturu i funkciju brojnih biomolekula
17. 9
(polinezasićenih lipida, ugljikohidrata, proteina i nukleinskih kiselina) što
rezultira promjenama u strukturi i funkciji stanica, tkiva i organa. Tako
nastala oštećenja mogu narušiti homeostazu iona, prijenos signala u
stanici, gensku transkripciju te tako dovesti do drugih poremećaja.
Oksidacijski stres ima značajnu ulogu u etiopatogenezi kardiovaskularnih i
infektivnih bolesti, karcinoma, dijabetesa, neurodegenerativnih bolesti,
fibroze, hemolize te procesa starenja.
1.3.3. Oksidacijski stres kao reakcija na hipoksiju
Oksidacijski stres je uobičajeno stanje koje izazivaju različite
upalne stanice nakon ishemičnog infarkta. Nakon hipoksije upalne stanice
se aktiviraju i generiraju ROS preko nekoliko enzimskih puteva tako da
potaknu ekspresiju proupalnih medijatora, uključujući citokine i adhezijske
molekule (21). Osim preko upale, ROS se također generira i kroz druge
mehanizme kao što su inhibicija mitohondrija, preveliki priljev Ca2+ i
reperfuzijske ozljede. U mitohondrijima, koji u su u zdravom stanju izvor
ROS-a, kod hipoksije dolazi do oštećenja unutarnje membrane i oksidacije
proteina što uzrokuje nepravilnosti u transportu elektrona, istiskivanje H+ i
produkciju ATP-a. Mitohondrijska membrana postaje propusna, što izaziva
bubrenje i prestanak produkcije ATP-a i prekomjerno stvaranje slobodnih
radikala. Citokrom C se otpušta iz mitohondrija i to nadalje vodi do
apoptoze. Superoksid (O2
-) je primarni radikal čije je stvaranje generirano
putem ciklooksigenaze (COX), ksantin dehidrogenaze, ksantin oksigenaze
i NADPH oksidaze, dok mijeloperoksidaza (MPO) i monoamin oksidaza
(MAO) dalje iz superoksida generiraju hipoklornu kiselinu i vodikov
peroksid (H2O2) (21). Dušični oksid (NO) je slobodni radikal topljiv u vodi
koji nastaje iz L-arginina uz tri vrste NO sintetaza (NOS). Hipoksija
uzrokovana ishemijom potiče aktivaciju NOS-a tipa I i III u neuronima i
vaskularnom endotelu, a NOS tip II (iNOS) aktivnost se odvija u glija
stanicama i infiltrirajućim neutrofilima. Nakon stvaranja NO i
superoksidnog aniona formira se izrazito reaktivna vrsta, peroksinitrit, koji
potiče ozljedu tkiva (22). Kisikovi slobodni radikali su također zaslužni za
signaliranje unutar stanice koje potiče upalu i apoptozu. Zbog velike
količine reaktivnih kisikovih oblika da se zaključiti da je oksidativni stres
važan medijator u ozljedi tkiva koja uslijedi nakon hipoksije, te su
slobodni radikali općenito važna meta u terapijskom poboljšavanju ishoda
ishemičnog infarkta.
18. 10
1.3. Mikroglija
Mozak i leđna moždina čine centralni živčani sustav koji je
imunološki privilegiran radi odvojenosti od ostatka tijela endotelnim
stanicama i nožicama astrocita koje ih obavijaju čineći krvno moždanu
barijeru. S obzirom na nepristup mnogim imunološkim stanicama inače
zaduženim za obranu organizma mozak i leđna moždina posjeduju
mikroglija stanice koje ispunjavaju homeostaznu i obrambenu ulogu te se
nalaze u parenhimu živčanog sustava. Zbog velike osjetljivosti živčanog
tkiva mikroglija stanice reagiraju i na najmanje patološke promjene u
centralnom živčanom sustavu, a to postižu jedinstvenim kalijevim
kanalima koji reagiraju i na najmanje promjene u koncentraciji
ekstracelularnog kalija. Zbog potrebe održavanja moždane homeostaze i
odvijanja cijelog niza imunoloških funkcija mikroglija stanice su izrazito
plastične i prolaze razne strukturalne promjene. Iako postoji mnogo više
tipova mikroglija stanica (23), mogu se podjeliti u tri osnovna fenotipa,
ameboidni, razgranati i aktivirani (24) (slika 3).
Slika 3. Ilustrirani prikaz vrsta stanica mikroglije (preuzeto i prilagođeno iz
24)
Ameboidna mikroglija je fagocit i obavlja funkciju “čistača” tako
da pronalazi antigene, strani materijal, oštećene stanice, stanice u
apoptozi, DNA fragmente i slične sadržaje te djeluje kao aktivni makrofag
tijekom razvoja (25). Također je i prekursor neaktiviranoj razgranatoj
mikrogliji, koja se kao odgovor na razne infekcije, traume i ishemiju
aktivira u postnatalnom mozgu i putuje na mjesto ozljede (26). Na
razgranatoj mikrogliji u normalnom razvijenom mozgu izraženi su
određeni stanični biljezi važni u imunološkom odgovoru, kao npr. molekule
glavnog sustava tkivne podudarnosti, MHC (od engl. mean
histocompability complex) – II molekule (27), a kao odgovor na razne
19. 11
vrste trauma mozga i brojne molekule izražavaju se i mnogi drugi
receptori te mikroglija mijenja svoje mirujuće, nadzorno stanje u aktivno,
izvršno stanje (slika 4). Zajedničko svojstvo tih molekula je da sve
predstavljaju prijetnju strukturalnom i funkcionalnom integritetu
središnjeg živčanog sustava. Stanice mikroglije sposobne su prepoznati
široki spektar molekula, a također imaju i raznovrstan učinak na
modulaciju upalnog odgovora, bilo da ga započinju, pojačavaju ili umiruju
(28) (Tablica 1).
Tablica 1. Primjeri signala koji mjenjaju stanje stanica mikroglije iz
mirujućeg u aktivno (prilagođeno po 28)
Skupina signala i modulatora Primjeri
Površinske strukture i DNA/RNA virusnog,
bakterijskog ili gljivičnog porijekla
Agonisti receptora koji prepoznaju uzorak
(engl. pattern recognition receptors - PRR)
TLR1-TLR4, TLR6, TLR9: bakterijski LPS,
proteoglikani stanične stjenke i
lipoteikoična kiselina (LTA), podjedinice
ovojnice retrovirusa gp41 i gp120
Abnormalni endogeni proteini Agregati beta amiloida, Aβ25-35, Aβ40,
Aβ42, prionski proteini
Komplement Komponente sustava komplementa C1q, C5
Protutijela Imunoglobulini raznih klasa i izotipova
(IgG, IgA, IgM) prezentiranih u obliku
imunoloških kompleksa
Citokini Čimbenici stimulacije kolonija i citokini: M-
CSF, GM-CSF, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-
10, IL-12, IL-15, IL-18, IFN-γ, TNF-α, TGF-
β
Kemokini Ligandi koji se vežu na kemokinske
receptore: CCR3, CCR5, CXCR, CXCR2,
CXCR4, CX3CR1, IL-8R
Neutrofilni čimbenici Neutrofilni čimbenik porijeklom iz mozga –
BDNF, neutrofilni čimbenik porijeklom iz
stanica glije – GDNF (engl. glia derived
neutrophic factor), čimbenik rasta živaca –
NGF (engl. Nerve growth factor), neutrofini
NT-3 i NT-4
Komponente krvne plazme Albumin, fibronektin, fibrinogen, trombin
Ostali proteini i peptidi Apolipoprotein E (ApoE), proteini toplinskog
šoka Hsp60, Hsp70, CD40L, melanocitni
stimulirajući hormon – MSH, endotelin,
S100 proteini, vazoaktivni intestinalni
peptid (VIP)
Spojevi povezani s prijenosom podražaja
živčanim stanicama
ATP i srodni proteini, β-adrenergični
agonisti, glutamat, kainat, NMDA
Ioni Ioni kalija i mangana
Ostali spojevi Kanabinoidi, ceramidi, gangliozidi,
lipofosfatidična kiselina (LPA), melanin,
endogeni opijati (endomorfini), čimbenici
aktivacije trombocita – PAF (engl. Platelet
activating factor), prostaglandinE2,
steroidni hormoni
20. 12
Slika 4. Ilustrirani prikaz razgranate neaktivirane mikroglija stanice i
aktivirane mikroglija stanice (preuzeto i prilagođeno iz 30)
Aktivirani oblik mikroglije, uz MHC I i II glikoproteine, na svojoj
staničnoj površini izražava i mnoge druge receptore kao što su
imunoglobulini, receptori komplementa, citokina/kemokina i Toll-like
receptori (tablica 2). Takve mikroglija stanice imaju svojstva slična
dendritičkim stanicama i njihov broj naglo poraste u infektivnim i upalnim
uvjetima. Djeluju kao antigen prezentirajuće stanice aktivirajući
citotoksične i Th1 limfocite koji zahvaljujući specifičnim površinskim
markerima, prolaze kroz krvno moždanu barijeru i direktno se vežu na
mikroglija stanice da prime antigene i unište ih (29). Osim što mikroglija
doprinosi stečenom imunom odgovoru preko interakcija sa CD4+ i CD8+
limfocitima djeluje i na urođeni imuni odgovor. Izražavaju Toll-like
receptore (TLRs), CD14 i manozne receptore (tablica 2) koji prepoznaju
molekularne uzorke patogena PAMPs (eng. pathogen-associated molecular
21. 13
patterns) poput LPS-a, peptidoglikana i teikoične kiseline koji se nalaze u
staničnoj stjenci bakterija. Zasada je istraženo da receptori
kemokina/citokina i njihovi ligandi (tablica 2 i 3) imaju kritičnu ulogu u
aktiviranju mikroglije i usmjeravanju te tako i direktan utjecaj na
oporavak mozga nakon infekcije ili ozljede (26). Mnogi takvi receptori su
izraženi i na astrocitima pa se pretpostavlja da predstavljaju i
komunikacijski signal između mikroglije i astrocita. Važno je napomenuti
da aktivirana mikroglija izražava receptore i ligande za proupalne (IL-1,
IL-6, IL-12, IL-23, TNF-) i protuupalne (TGF- i IL-10) klase citokina.
Spomenuto je da je ATP glavni čimbenik posredovanja unutarstanične
komunikacije u imunološkom i živčanom sustavu, a s obzirom da
mikroglija stanice imaju purinergične receptore njihova stimulacija uvelike
utječe na funkciju mikroglije, a najviše na kemotaksiju i produkciju
citokina. U nekim slučajevima aktivirana mikroglija izražava opioidne ( i
), kanabinoidne i benzodiazepinske receptore (26). Njihovom
stimulacijom također utječemo na veliki broj funkcija uključenih u
patogenezu infekcije živčanog sustava. Takvi receptori se mogu aktivirati
ne samo endogenim opioidima i kanabinoidima nego i derivatima biljaka
opiuma i kanabisa. Od liganda i sekretornih produkata uz spomenute
citokine i kemokine valjalo bi izdvojiti i već spomenute matriks
metaloproteinaze (MMPs) koje su odgovorne za prolaz kroz krvno
moždanu barijeru, emigraciju leukocita u živčani sustav i uništenje tkiva.
MMPs su iz obitelji cink-ovisnih enzima i njihova sposobnost za razgradnju
proteina koji se nalaze u vanstaničnom matriksu utječe na infekcije
živčanog sustava kao i upalu i neurodegenerativne poremećaje. Također
istraživanja živčanog sustava koji je doživio traumu, potrovanje ili
hipoksiju pokazuje da aktivirana mikroglija luči MMP-2, MMP-3 i MMP-9
metaloproteinaze kao odgovor na razne stimulanse (13). Napravljene su
studije na mišjim, svinjskim i ljudskim stanicama mikroglije i sve su
pokazale da aktivirana mikroglija ima sposobnost produkcije superoksida.
Dok mikroglije izolirane iz mišjih stanica nakon aktiviranja stvaraju velike
količine dušikovog oksida (NO) ljudske to čine u puno manjoj mjeri.
Mogućnost da mikroglija izaziva proizvodnju slobodnih radikala kao sto su
ROS (reaktivni oblici kisika) i RNS (reaktivni oblici dušika) je važno u
mehanizmima obrane od unutarstaničnih organizama i moguće štete
neurona ako se toksične molekule nađu u vanstaničnom prostoru.
22. 14
Tablica 2. Receptori mikroglijalne stanične membrane
Receptori čistači
Adhezijske molekule
-Imunoglobulinksa (Ig) superobitelj
Ig Fc receptori (FcγRI, RII, RIII)
MHC I glikoproteini
MHC II glikoproteini
CD4 receptori
Međustanične adhezijske molekule 1 (ICAM-1)
-Integrini
Antigen 1 povezan sa leukocitnom funkcijom (LFA-1; CD11a/CD18;CR1)
Mac-1 (CD11b/CD18; CR3)
p150, p95 (CD11c/CD18;CR4)
-Receptori komplementa: C1q, C5a
Receptori citokina/kemokina
-IFN-α, IFN-β, IFN-γ
-IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IL-16
-TNF-α
-M-CSF, GM-CSF
-CCR, CXCR, CX3CR
Toll-like receptori
CD14 receptori
Manozni receptori
Purinergični receptori
Opioidni receptori (µ,κ)
Kanabinoidni receptori
Benzodiazepinski receptori (mitohondrijska membrana)
Receptori objavljeni u literaturi, na čiju ekspresiju može utjecati stanje aktivacije kao i
anatomsko mjesto, dob i životinjske vrste od kojih potječu mikroglije. (preuzeto i
prilagođeno iz 26)
Tablica 3. Sekretorni produkti mikroglija
Citokini (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, IL-16, IL-23, TNF-α, TGF-β)
Kemokini
CC: CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES
CXC: CXCL8/IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α
CX3C: CX3CL1/fraktalin
Matriks metaloproteinaze (MMP-2, MMP-3, MMP-9)
Slobodni radikali: superoksid, dušikov oksid
Eikozanoidi: PGD2, leukotrijen C4
Faktori rasta: faktor rasta neurona, faktor rasta fibroblasta
Proteaze: elastaza, plazminogen
Katepsini B i L
Kvinolinksa kiselina, glutamat
Amiloidni prekursor proteina
Faktori komplementa: C1, C3, C4
Sektretorni produkti objavljeni u literaturi, na čiju ekspresiju može utjecati stanje
aktivacije kao i anatomsko mjesto,dob i životinjske vrste od kojih potječu mikroglije.
(preuzeto i prilagođeno iz 26)
23. 15
1.4. Model BV-2 mikroglija stanica
Napravljene su mnoge studije na modelima životinja i primarnim
kulturama, ali s obzirom na slabu mogućnost proliferacije i činjenicu da za
svega nekoliko eksperimenata za dokazivanje mehanizama bolesti i
signaliranja je potrebno 15-30 svježih mozgova glodavaca javila se
potreba za alternativnom staničnom linijom. Podaci dobiveni izolacijom iz
primarnih mikroglija i ex vivo eksperimenata nisu zadovoljavajući zbog
ograničene količine biološkog materijala pa se noviji eksperimenti o
aktivaciji mikroglije i signaliranju sve više izvode na modelu BV-2 stanica.
BV-2 stanice su dobivene iz raf/myc imortaliziranih mišjih neonatalnih
mikroglija, a dosad su korištene za mnoge farmakološke studije, studije o
fagocitozi, mnogim imunološkim otkrićima i u preko 200 publikacija. U
radu A. Henn i sur. detaljno su ispitane funkcije tih stanica u upalnim
odgovorima i ispitana je valjanost zamjene za primarne mikroglije i
mikroglije u in vivo eksperimentima (31). Ispitali su odgovor BV-2 stanica
mikroglije na lipopolisaharid u in vitro i in vivo uvjetima. Transkriptomske
i proteomske analize su pokazale da su uzorci reagiranja BV-2 stanica i
primarnih mikroglija slični, ali da BV-2 stanice pokazuju manju ekspresiju
gena. Ispitane stanice također pokazuju očekivanu produkciju NO i
funkcionalni odgovor na IFN- koji su važni parametri za prikladnu
interakciju sa T-stanicama i neuronima. Dokazano je da BV-2 stanice
stimuliraju i ostale glija stanice, kao i to da potiču translokaciju NF-κB i
produkciju IL-6 u astrocitima (31). Rad A. Hann kao i radovi Lunda i
suradnika o sekreciji citokina i MAP kinaznom signaliranju (32) te rad o
fagocitozi Hirta i Leista (33) dovoljan su dokaz da se BV-2 stanice mogu
koristiti kao valjana zamjena za primarne mikroglije u mnogim
eksperimentima uključujući i studije o kompleksnim staničnim
interakcijama.
24. 16
1.5. Parametri mjereni u istraživanju
1.5.1. COX-2
COX-2 odnosno ciklooksigenaza 2 je protein koji je homodimer, a
svaki monomer ima molekularnu masu od oko 70 kDa. To je enzim koji
pretvara arahidonsku kiselinu u prostaglandin H2. Znatno je povećan u
patofiziološkim odgovorima od strane upalnih stimulansa IL-1 i drugih
faktora rasta (34). Potiče upalu u svim oštećenim tkivima i mozgu. Tokom
produkcije prostaglandina, stvaraju se i reaktivni kisikovi oblici koji skupa
sa ostalim citokinima i upalnim agentima aktiviraju mikrogliju. U
slučajevima kad je mikroglija prestimulirana proizvodi citotoksične
elemente koji uništavaju neurone i stimuliraju prekomjernu ekspresiju
COX-2. Zanimljivo je da COX-2 enzim ne uništava neurone kroz upalu, već
da oksidira druge molekule u dopaminskim neuronima koje zatim
reagiraju i unište druge komponente stanica (35).
1.5.2. Hsp70
Hsp70 je obitelj heat shock proteina za koju je dokazano da
djeluje imunoregulativno, uključena je u oblikovanje mehanizama upale i
štiti mozak nakon raznih povreda i ishemije. Hsp70 imaju molekularnu
masu od oko 70kDa i uključeni su u odmatanje i zamatanje drugih
proteina. Imunološki odgovor Hsp se pojavljuje u svim upalnim bolestima.
U upalnim modelima administracija Hsp zaustavlja upalna oštećenja i
izaziva produkciju protuupalnih citokina. Kada u upali temperatura u
stanici poraste do razine da započne denaturacija proteina induciraju se
Hsp70 i djeluju tako da se vežu na hidrofobne krajeve proteina, izložene
radi stresa, sprječavajući tako daljnju denaturaciju ili agregaciju. Hsp70 su
povezani i sa autofagijom, pa tako peptidi eksprimirani na MHC II
molekulama stanica u stresu služe kao ciljna mjesta T stanicama
doprinoseći smanjenju upalnog odgovora. Također djeluju tako da štite
stanice od oksidativnog stresa jer se proteini u stresu parcijalno odmataju
i agregiraju. Parametri oksidativnog stresa kao hidrogen peroksid,
superoksid i dušikov oksid svaki izazivaju jedinstven odgovor na stres.
Svaki od tih parametra potiče ekspresiju jedinstvenog seta gena, koji
smanjuju njihove štetne učinke (36).
25. 17
1.5.3. iNOS
NOS odnosno sintetaza dušičnog oksida (NO) je porodica enzima
koje kataliziraju NO iz L-arginina. Inducibilna izoforma, iNOS, je uključena
u imunološki odgovor i karakterizira je jaka nekovalentna veza sa
kalmodulinom (CaM) i Ca2+. Gensku ekspresiju iNOS reguliraju razni
putevi uključujući NF-B i IFN- (preko JAK-STAT kaskade) koji djeluju
pozitivno na ekspresiju. NF-B (nuklearni faktor kappa lakog lanca
aktiviranih B stanica) se pojavljuje kao odgovor na razne upale dok citokin
IFN- (interferon gamma) je kritičan u odgovoru na prirođenu i stečenu
imunost te se također javlja u infekcijama. Iz toga je vidljivo da se i sam
iNOS javlja u upalnim i infektivnim stanjima. Nakon što je broj sintetaza u
stanici porastao samu proizvodnju dušičnog oksida iNOS sintetizira u
velikoj količini uz prisustvo raznih stimulansa, proupalnih citokina, IL-1
(interleukin-1), TNF- i sam INF- (37).
1.5.4. IL-1
U obitelj IL-1 (interlukin-1) spada 11 vrsta citokina, koji imaju
ulogu u reguliranju imunog i upalnog odgovora u infektivnim stanjima
organizma. Il-1 se sintetizira kao prekursor protein nakon stimulacije.
Njegova ekspresija je inducirana transkripcijskim faktorom NF-B nakon
izlaganja alarmina (endogenih molekula otpuštenih nakon ozljede tkiva,
upale i u autoimunim bolestima i kancerogenezi) i PAMPs urođenim
imunim stanicama koje na sebi imaju Toll-like receptore (TLRs) (slika 5).
To znači da su za sekreciju IL-1 potrebna dva signala. PAMPs stimulira
sintezu pro-IL-1, ali ne i njegovo lučenje, dok su alarmini zaduženi za
aktivaciju kaspaze-1 koja cijepa pro-IL-1 u IL-1, omogućujući njegovo
lučenje. Zbog pretjerane ekspresije IL-1 u centralnom živčanom sustavu
tijekom upale i indukcije u hipotalamusu smatra se da je važan
neuroregulator u odgovorima na upalne stresore i da regulira
neuroendokrine funkcije u takvim stanjima.
26. 18
Slika 5. Sekrecija IL-1β nakon stimulacija TLR-a sa PAMPs i alarminima
(preuzeto i prilagođeno iz 38)
1.5.5. MHC-I
MHC-I molekule se sastoje od dva polipeptidna lanca, i 2-
mikroglobulina koji su međusobno povezani nekovalentnom vezom. Zbog
svoje strukture sposobne su prezentirati antigene T stanicama, a nalaze
se na antigen prezentirajućim stanicama, ali mogu se inducirati i na
ostalim stanicama nakon stimulacije interferonom ili nekim drugim
stimulansom koji se eksprimira u upalnom okruženju. IFN-γ povećava
ekspresiju MHC I preko aktivacije JAK/STAT1 signalnog puta.
Prezentirajući antigene citotoksičnim limfocitima igraju ključnu ulogu u
stečenom imunom odgovoru, ali novija istraživanja su pokazala da
također djeluju i na urođeni imunološki odgovor. Dokazano je sinergično
djelovanje unutarstaničnih MHC I molekula i Toll like receptora preko
mehanizma međusobne komunikacije odnosno crosstalka. Crosstalk
rezultira formiranjem Fps-SHP-2 puta te tako kontrolom urođenog
imunološkog odgovora preko TLR-a. Pretjerana reakcija imunološkog
sustava može dovesti do kronične upale, alergije ili autoimunosti, a opet
nedovoljna aktivacija rezultira neprimjerenom zaštitom tokom infekcije ili
nedovoljnim aktiviranjem stečenog imunog odgovora koji vodi do bolesti
pa čak i smrti. Upravo radi toga važna je ravnoteža između intenziteta
odgovora, a MHC I molekule su jedne od ključnih u takvoj kontroli (39).
27. 19
2. CILJ RADA
Cilj ovog rada bio je:
1. Razviti model in vitro hipoksije na BV-2 liniji mikroglija stanica
2. Pratiti parametre njihove aktivacije pri čemu su kao glavni indikatori
oni prisutni kod oksidacijskog stresa, upale i općenito oštećenja.
Stoga smo za pojedinačne ciljeve odredili pratiti izražaj proteina
iNOS kao biljega oksidacijskog stresa te COX2, Hsp70, IL-1 i MHC-I
kao biljega upale i stanične aktivacije.
28. 20
3. MATERIJALI I METODE
3.1. Materijali
Kemikalije:
PBS (fiziološka otopina puferirana fosfatnim puferom)
Natrij klorid (NaCl) 140 mM, Kemika
Kalij klorid (KCl) 2,7mM, Kemika
Natrij hidrogenfosfat-2-hidrat (Na2HPO4 x H2O) 6,5 mM, Kemika
Kalij dihidrogenfosfat (KH2PO4) 1,5 mM, Kemika
Kalcij klorid (CaCl2) 0,7 mM, Kemika
Magnezij klorid-6-hidrat (MgCl2 x 6H2O) 0,7 mM, Kemika
Mediji i puferi:
Medij D-MEM (medij za uzgoj imortaliziranih linija), PAN Biotech
Medij D-MEM 1,1 L-Glutamin 2 mM, Penicilin 1x105 U/I, Streptomicin sulfat
0,1 g/l, Gentamicin sulfat 0,05 g/l Fetalni goveđi serum (FCS) 10%, PAN
Biotech
Puferi: Running pufer (Tris base, ROTH + glicin, Fisher chemical + SDS,
Fisher scientific + H20)
Transfer pufer (Tris base, ROTH + glicin, Fisher chemical +
metanol, Kemika + H2O)
Laboratorijsko posuđe:
Petrijeve posude za uzgoj stanica, Greiner
Volumetrijske tikvice, Carl Roth
Staklene menzure, Carl Roth
Posuđe za Western blot analizu, BioRad
Protutijela:
COX2 poliklonsko protutijelo, Santa Cruz
iNOS/NOS2 monoklonsko protutijelo, Santa Cruz
29. 21
IL-1 poliklonsko protutijelo, Santa Cruz
Anti Ld/Db (klon 28-14-8s) mišje protutijelo
HSP70 protutijelo, Santa Cruz
-aktin monoklonsko protutijelo, Santa Cruz
3.2. Metode
3.2.1. Uzgoj adherentne BV-2 stanične linije
BV-2 stanična linija imortalizirane mišje mikroglije uzgojena je u D-MEM
mediju, u plastičnim Petrijevim posudama pri temperaturi od 37C i uz 5%
CO2. BV-2 stanice su stanice sklone prijanjanju za plastiku što olakšava
odstranjenje iz kulture ostalih stanica jednostavnom promjenom medija.
Nakon nekoliko dana (3-5) uzgoja, stanice prekriju dno Petrijeve posude te
se mogu prebaciti u nove, gdje se uzgajanje nastavlja do željene gustoće.
3.2.2. Postizanje hipoksijskih uvjeta u izobaričnoj komori
Uzgojenoj liniji BV-2 mišjih mikroglija stanica, koje su održavane u
standardnim uvjetima stanične kultivacije, inducirana je in vitro hipoksija.
Postupak je izveden u komori (slika 6) u kojoj je postupnim uvođenjem
98% dušika razina kisika smanjena na < 2% i potom održavana tijekom 6
sati.
Slika 6. Izobarična komora
3.2.3. Mikroskopska
30. 22
analiza
BV-2 mikroglija stanice su zatim analizirane svjetlosnom fazno-
kontrastnom mikroskopijom (Olympus) neposredno nakon te 24 h, 48 h,
72 h i 168 h nakon hipoksije.
3.2.4. Priprema staničnog lizata
BV-2 stanice odljepljene su od podloge i resuspendirane u puferu za lizu
(0,3 ml) inkubacijom od 10 minuta na ledu. Talog stanica centrifugiran je
5 minuta na 14000 RPM na +4C. Dobiveni supernatant služi kao uzorak
za western blot analizu.
3.2.5. Gel-elektroforeza
Proteini iz staničnog lizata su zatim razdvojeni poliakrilamid gel-
elektroforezom (SDS-PAGE). Korišteni su 8, 10 i 12 % gelovi. Tijekom
elektroforeze proteini su razdvojeni na gelu i usljedio je bloting na
nitroceluloznu membranu. Elektroforeza je rađena na 150 V cca jedan sat.
3.2.6. Elektroblot proteina s akrilamidnog gela na nitroceluloznu
membranu
Nakon elektroforeze proteina gel je uronjen u renaturirajući pufer i
inkubiran 10 minuta. Blotiranje se radi s transfer puferom koji se sastoji
od TBS-a i metanola. Kompleks za bloting koji se sastoji od filter papira,
gela i membrane uklopljen u transfer puferu blotira se 30 minuta na
25V/110mA.
3.2.7. Kemiluminiscencija
Proteini blotirani na membrani postaju vidljivi nakon inkubacije membrane
sa protutijelima obilježenim biotinom i streptavidinom konjugiranim s
peroksidazom koja razgradi supstrat luminol/jodofenol. Kemiluminiscentni
signal se zabilježi izlaganjem membrane na film. Vrijeme ekspozicije je
različito; od nekoliko sekundi do 30 minuta.
31. 23
4. REZULTATI
4.1. Morfološke promjene na BV-2 mikroglija stanicama u
uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
Slika 1. Mikroskopska analiza stanica mikroglije nakon 6h izloženosti
hipoksiji.
1.1 Kontrola 1.2 0’ nakon 6h hipoksije
1.3 24h nakon 6h hipoksije 1.4 48 nakon 6h hipoksije
1.5 72h nakon 6h hipoksije 1.6 168 h nakon 6h hipoksije
32. 24
Fazno-kontrastnom mikroskopijom analiziran je odgovor stanica
na uvjete hipoksije. Uočena promjena staničnog fenotipa kroz morfološke
karakteristike predstavlja indirektan pokazatelj stanične aktivacije.
Promjene su praćene nakon 6h hipoksije kontinuirano kroz period od 24h,
48h, 72h i 168h (7dan). U usporedbi sa kontrolom (1.1) gdje je vidljiv
dvojni fenotip stanica, kod stanica analiziranih neposredno nakon hipoksije
(1.2) vidljiva je istovjetna promjena morfoloških karakteristika kao i na
slici koja prikazuje stanice nakon 24 sata (1.3). Stanice izgledaju
okruglastije i smatramo da je taj izgled upućuje na stanje prije potpune
aktivacije. Na slikama koje prikazuju promjene nakon 48 i 72 sata nakon
hipoksije (1.4, 1.5) također je vidljiv dvojni fenotip stanica. Neke stanice
imaju razgranatiji, a neke okruglastiji izgled. Očito je da nisu sve stanice
isto reagirale na hipoksiju, te da postoji više različitih vrsta. Stanice sa
slike nakon perioda od 168 h (1.6) pokazuju samo razgranati oblik.
33. 25
4.2. Ekspresija pokazatelja oksidativnog stresa i upale BV-2
mikroglija stanica u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
Slika 2. Reprezentativni uzorci blotova mjerenja razine ekspresije
parametara oksidacijskog stresa (iNOS) te upale i oštećenja (COX-2,
Hsp70, IL-1β, MHC II) iz skupina kontrola te BV-2 mikroglija stanice
izložene hipoksiji tijekom 6 sati.
34. 26
Slika 3. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju iNOS-a u BV-2 mikroglija
stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 h po završetku
hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (iNOS/β-aktin omjer). Razine
ekspresije iNOS-a su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti
pripadajuće kontrolne skupine.
35. 27
Slika 4. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju COX-2 u BV-2 mikroglija
stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku
hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (COX-2/β-aktin omjer). Razine
ekspresije COX-2 su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti
pripadajuće kontrolne skupine.
36. 28
Slika 5. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju Hsp70 u BV-2 mikroglija
stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku
hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (Hsp70/β-aktin omjer). Razine
ekspresije Hsp70 su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti
pripadajuće kontrolne skupine.
37. 29
Slika 6. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju IL-1β u BV-2 mikroglija
stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku
hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (IL-1β/β-aktin omjer). Razine
ekspresije IL-1β su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti
pripadajuće kontrolne skupine.
38. 30
Slika 7. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju MHC I u BV-2 mikroglija
stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku
hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (MHC I/ β-aktin omjer). Razine
ekspresije MHC I su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti
pripadajuće kontrolne skupine.
39. 31
Učinjena je Western blot analiza razine ekspresije pokazatelja
oksidativnog stresa (iNOS), te upale i oštećenja (COX-2, Hsp70, IL-1β,
MHC I) u BV-2 mikroglija stanicama koje su tijekom 6 sati bile izložene
uvjetima jake hipoksije. Gore spomenuti pokazatelji mjereni su
neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku hipoksije
(Slika 2-7).
Temeljem rezultata prikazanih (Slika 3), evidentno je da izlaganje BV-2
stanica mikroglije uvjetima hipoksije dovodi do postupnog, kontinuiranog
povećanja ekspresije iNOS-a kao pokazatelja izloženosti oksidacijskom
stresu. Rast ekspresije iNOS-a vidljiv je već neposredno nakon prekida
izlaganja hipoksiji dok se najizrazitije promjene bilježe nakon 168 sati.
Rezultati prikazani na ostalim slikama pokazuju da morfološke promjene
uslijed aktivacije stanica nisu uvjetovane samo oksidacijskim stresom
nego i upalom. Naime vidljivo je da dolazi do značajne ekspresije COX-2
(Slika 4) odmah po završetku hipoksičnih uvjeta uz postupni rast izražaja
navedenog proteina, uz maksimalni porast nakon 168 sati. Sličan
vremenski slijed i intenzitet ekspresije bilježi se i u uzorcima mjerenja
MHC I (Slika 7) dok mjerenja razine ekspresije Hsp70 pokazuju također
brz porast ekspresije, uz maksimalni izražaj postignut nakon 48 sati te
postepeno smanjivanje u vremenskom period nakon toga (Slika 5). Sličnu
dinamiku ekspresije pokazuje i IL-1β (Slika 6)
40. 32
5. RASPRAVA
5.1. Morfološke promjene na BV-2 mikroglija stanicama u
uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
Prvi cilj ovog rada bio je morfološki dokazati aktivaciju mikroglija
stanica u odgovoru na hipoksiju. Dobiveni rezultati pokazuju potpunu
aktivaciju BV-2 modela mikroglija stanica 48 sati nakon hipoksije, ali je
vidljivo da stanice i neposredno nakon izvlačenja iz komore pokazuju
promjenu u morfologiji iz razgranatog u aktivirani nerazgranati oblik.
Rezultati prijašnjih istraživanja u kojima su stanice mikroglije izložene
nekom upalnom poremećaju upućuju da aktivacija morfološki znači da
smanjuje svoju razgranatost i postiže zaobljeniji oblik (41). Osim rada
Shenga i suradnika napravljena su i mnoga druga istraživanja vezana uz
promjenu morfologije te postoje razna tumačenja remodeliranja i
plastičnosti stanica mikroglije (42,43,44).
5.2. Ekspresija pokazatelja oksidativnog stresa i upale BV-2
mikroglija stanica u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
Rezultati Western blot biokemijskih analiza također upućuju na
aktivaciju mikroglija stanica. Naime, vidljivo je da uz promjene
morfologije stanica dolazi i do pojačane ekspresije pokazatelja
oksidacijskog stresa i upalnog oštećenja, u usporedbi s kontrolnim
vrijednostima. Ovisno o vremenu praćenja (0', 24h, 48h, 72h, 168h), i
ekspresija ispitivanih pokazatelja oksidacijskog stresa i upalnog oštećenja
te morfološka aktivacija stanica se proporcionalno povećavala.
Iz dobivenih rezultata vidljivo je da dolazi do pojačane ekspresije
iNOS-a neposredno po završetku hipoksičnog stresa te da porast razine
ekspresije postupno raste s maksimumom postignutih vrijednosti nakon
168 sati. Navedeno ukazuje na brz razvoj oksidacijskog stresa koji
progredira tijekom 7 dana, paralelno s morfološkom aktivacijom stanica. U
nizu ispitivanja hipoksije/ishemije moždanih struktura pa i mikroglija
stanica u in vivo uvjetima (npr. eksperimentalni modeli moždanog udara
te imunohistološke analize humanog mozga tijekom autopsije) pokazano
je da inducibilni odnosno imunološki oblik NOS-a (iNOS) biva pojačano
izražen uslijed oksidacijskog stresa nakon ishemičnog inzulta. Navedeni
parametar kao pokazatelj hipoksično-ishemičnog oštećenja stanice
41. 33
predstavlja i često korišteni model ispitivanja potencijalno korisnih lijekova
koji bi mogli inhibicijom ekspresije i aktivacije iNOS-a spriječiti daljne
širenje oštećenja moždanih struktura. U istraživanju H. M. Gibbons-a (40)
koji je izazvao aktivaciju BV-2 stanice mikroglije lipopolisaharidom,
rezultati pokazuju povećanu ekspresiju ciklooksigenaze (COX-2) i
inducibilne NO sintetaze (iNOS). Slično našim rezultatima, i u ovih je
autora ekspresija COX-2 bila inicijalno brza i izraženija, iako nakon 168
sati oba proteina bilježe otprilike istu razinu ekspresije. Navedeno ukazuje
na zaključak da je upalni parametar vjerojatno dominantan te posljedično
dovodi do aktivacije mehanizama oksidacijskog stresa iako podaci iz
različitih studija navode na zaključak da nije jednostavno precizno
definirati koji proteini se prvi eksprimiraju i je li prvotno oksidacijski stres
taj koji izaziva upalu ili je upala ta koja povećava broj slobodnih radikala.
Ipak, u većini radova je otkriveno djelovanje i povezanost inducibilnih
izoformi (COX-2 i iNOS) u uvjetima hipoksije i ishemije, neovisno o
korištenom modelu, uz ekspresiju niza drugih proupalnih stimulansa kao
npr. superoksida, NF-B, prostaglandina i dušičnog oksida (NO) (45).
Navedeno upućuje na zaključak da pojačana aktivacija mikroglije dovodi
do daljnjeg povećanja i amplifikacije neuronalnog oštećenja uvjetovanog
hipoksičnim stimulusom i posljedično dovodi do širenja oštećenja na
okolne neurone (reaktivna mikroglioza).
Y. J. Kim i suradnici (2006) su proučavali stanične interakcije
između medijatora otpuštenih od strane mikroglija stanica i inducibilne
sintetaze (iNOS) te je pokazano da je IL-1 jedan od prvih proteina koji se
eksprimiraju na mikrogliji u uvjetima hipoksičnog oštećenja te da je
ključan regulator u indukciji iNOS-a. Pokazano je i da je pojačana
ekspresija IL-1 prisutna ne samo u uvjetima akutnog oštećenja nego i u
ljudskom mozgu tijekom starenja. Nadalje, inkubacija IL-1
neutralizirajućeg IL-1 protutijela umanjuje stvaranje dušićnog oksida
(NO) koji se stvara uz pomoć iNOS preko NF-B signalnog puta (46) što
ukazuje na mogućnost farmakološke manipulacije navedenim parametrom
potencijalnog oštećenja. Rezultati našeg istraživanja pokazuju također
povećanu ekspresiju citokina IL-1. Ekspresija IL-1 postigla je
maksimalnu vrijednost u odnosu na kontrolu skupinu 48 h sati nakon
hipoksije, uz kasnije smanjenje razine ekspresije. Navedena dinamika
ekspresije IL-1 je u skladu s očekivanjima jer se radi o jednom od prvih
proteina koji se aktiviraju nakon stresogenog stimulusa. Sličan maksimum
aktivacije zabilježen je i u slučaju heat shock proteina Hsp70 tj. 48 h
nakon hipoksije. Prvi koji su prikazali rezultate povećane ekspresije Hsp70
nakon ishemije su Nowak i Ikeda (47). U njihovom radu Hsp70 je
promatran kao marker vijabilnosti živčanih stanica što je bilo dovoljno da
42. 34
se pretpostavi njegova imunoregulativna uloga u upali mozga i dobar
temelj za mnoga druga istraživanja čije su rezultate objedinili Yenari i
suradnici (48). Pregledni članak pokazuje imunoprotektivnu i protuupalnu
ulogu Hsp70 u raznim modelima ozljede mozga odnosno živčanog
sustava. Da bi u potpunosti razumjeli mehanizme njegova djelovanja
potrebne su daljnje studije, ali radovi Shepparda (49) i Changa (50)
detaljno su opisali navedene mehanizme i ulogu Hsp70 u staničnom
oštećenju. Naime, Hsp70 ima negativan utjecaj na fosforilaciju u NF-B
signalnom putu, te na taj način smanjuje produkciju NOS-a i samu
aktivaciju mikroglije te u konačnici štiti neurone od trajnog oštećenja.
Iako je uloga Hsp70 u uvjetima hipoksije/ishemije kontroverzna, većina
autora smatra da se radi o markeru koji je pokazatelj staničnog stresa i
koji iskazuje potencijalno neuroprotektivno djelovanje putem anti-
inflamacijskih mehanizama. Pojačana ekspresija Hsp70 u našem modelu
pokazuje brzu aktivaciju mehanizama koji vjerojatno pokušavaju spriječiti
stanično oštećenje. Obzirom da nakon 48 sati dolazi do pada aktivacije,
uz izraziti porast pokazatelja stresa i upale kao što su iNOS i COX-2,
evidentno je da su toksični stimulusi nadvladali pokušaj Hsp70
protektivnog mehanizma.
Analizirali smo i eksprimiranost MHC I proteina na aktiviranim
mikroglija stanicama. Radi se o osjetljivom pokazatelju mehanizama
uključenih u imunološke reakcije tkiva te postishemičnih promjena
odnosno reaktivnosti tkiva. Poznato je da kod hipoksije ili nekog
degenerativnog poremećaja mozga, periferni T limfociti migriraju kroz
krvno moždanu barijeru do mjesta ozljede, ali malo se zna o mehanizmu
djelovanja. Rad Yanga (51) dokazuje da BV-2 mikroglija stanice potaknute
na aktivaciju, luče TNF- koji potiče eksprimiranje MHC I molekula na
endotelu krvnih žila. Daljnji transmigracijski i adhezijski pokusi pokazuju
da je povećana ekspresija MHC I molekula povezana s transendotelnom
migracijom T stanica. Naši rezultati pokazuju brzu indukciju ekspresiju
MHC I molekula koja se povećava tijekom vremena i najviše vrijednosti
doseže nakon 168 sati od završetka hipoksičnog stimulusa.
Iz svega iznesenog, evidentno je da je aktivacija mikroglija
stanica brzi pokazatelj staničnog odgovora na hipoksiju. Mikroglija
proliferira, migrira do mjesta oštećenja, povećava ekspresiju različitih
površinskih pokazatelja oštećenja te se transformira u fagocite koji su
zaduženi za uklanjanje nekrotičnih neurona uz uvažavanje integriteta
neurona u okolici koji su preživjeli oštećenje. Budući da njena aktivacija
započinje vrlo brzo, predstavlja prethodnicu morfološki detektibilnih
neuroloških promjena. U funkcionalnom smislu, aktivacija mikroglije može
43. 35
biti mač s dvije oštrice. S jedne strane može iskazati citotoksične učinke
aktivacijom i otpuštanjem različitih medijatora upale i oštećenja npr.
reaktivnih kisikovih spojeva, NO, proteinaza i proupalnih citokina, ali s
druge strane može poticati i oporavak tkiva lučenjem neuroprotektivnih
faktora uključenih u zaštitu neurona. Post-ishemične farmakološke
modulacije mikroglijalnog odgovora mogu pomoći u poboljšanju
strukturnih i funkcionalnih ishoda nakon cerebralne hipoksije/ishemije. U
tom smislu su provedena istraživanja kao npr. istraživanje K. N. Nama i
suradnika (2013.) (39) koje pokazuje inhibiciju aktivacije mikroglije
butilideneftalidom (BP). BP djeluje neuroprotektivno smanjujući
otpuštanje proupalnih molekula od strane aktiviranih mikroglija. BP
smanjuje proizvodnju dušićnog oksida (NO), tumor nekrozirajućeg faktora
(TNF-) i interleukina (IL-1). Također u mnogim istraživanjima korišteni
su i drugi inhibitori. U radu Alexandra Cupida korišten je Rimidyl (52) koji
smanjuje ekspresiju ciklooksigenaze 2 (COX-2), a lipokortin 1 u radu
Minghettija (53) koji uz COX-2 inhibira i inducibilnu sintetazu (iNOS).
Istraživanje Choia i Parka (54) sa astaksantinom pokazuje da dolazi do
smanjenja produkcije NO i ekspresije COX-2 i iNOS-a. Nadalje, torilin
djeluje na mnoge signalne puteve kao npr. MAPK/ERK i NF-B i tako
inhibira iNOS, COX-2 i IL-1 (55). Neuropeptid Y (56, 57), a i mnogi drugi
inhibitori, predmet su velikog broja istraživanja jer smanjuju negativne
efekte IL-1 i djeluju na mobilnost mikroglije.
Dobiveni rezultati pokazuju da je in vitro model hipoksije
uspješno uspostavljen, a daljnja ispitivanja potrebna su radi evaluacije i
potvrde prezentiranih preliminarnih rezultata.
44. 36
6. ZAKLJUČAK
1. Izlaganje BV-2 mikroglija stanica uvjetima kontrolirane in vitro
hipoksije dovodi do njihove aktivacije što je evidentno promjenom u
morfologiji stanica.
2. Aktivacija stanica uvjetovana je oksidacijskim stresom (ekspresija
iNOS) i upalnim odgovorom (ekspresija COX-2, Hsp70; MHC I, IL-
1β).
3. Promjene morfologije i ekspresija pokazatelja oksidacijskog stresa i
upale vremenski su determinirane.
4. Temeljem dobivenih rezultata evidentno je da je model in vitro
hipoksije uspješno uspostavljen.
45. 37
LITERATURA
1. C. Guyton, J. E. Hall. Medicinska fiziologija. Medicinska naklada 2006.
2. U. Dirnagl, C. Iadecola, M. A. Moskowitz. Pathobiology of ischaemic
stroke: an integrated view. Trends Neurosci 1999; 22:391-7
3. R. L. Martin, H.G Lloyd, A.I. Cowan. The early events of oxygen and
glucose deprivation: setting the scene for neuronal death?. Trends in
Neuroscience 1994; 17:251-7
4. K. Park, D. G. Nehls, G. M. Teasdale, J. McCulloch. Effect of the NMDA
antagonist MK-801 on local cerebral blood flow in focal cerebral
ischaemia in the rat. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism
1989; 9:617-22
5. G. Y. Sun, J. Xu, M. D. Jensen, S. Yu. Phospholipase A2 in astrocytes:
responses to oxidative stress, inflammation, and G protein-coupled
receptor agonists. Molecular Neurobiology 2005; 31:27-41
6. K. A. Hossman. Periinfarct depolarizations. Cerebrovascular and brain
metabolism reviews 1996; 8:195-208
7. F. C. Barone, G. Z. Feuerstein. Inflammatory mediators and stroke:
new opportunities for novel therapeutics. J Cereb Blood Flow Metab
1999; 19:819-34
8. Y. Zhu, G. Y. Yang, B. Ahlemeyer, L. Pang, X. M. Che, C. Culmsee, S.
Klumpp, J. Krieglstein. Transforming growth factor-beta 1 increases
bad phosphorylation and protects neurons against damage. J Neurosci
2002; 22:3898-909
9. P. A Spera, J. A. Ellison, G. Z. Feuerstein, F. C. Barone. IL-10 reduces
rat brain injury following focal stroke. Neurosci Lett 1998; 251:189-92
10. W. M. Clark, L.G. Rinker, N.S. Lessov, K. Hazel, F. Eckenstein. Time
course of IL-6 expression in experimental CNS ischemia. Neurol Res
1999; 21:287-92
11. J. S. Kim, S. C. Gautam, M. Chopp, C. Zaloga, M. L. Jones, P. A. Ward,
K. M. A. Welch. Expression of monocyte chemoattractant protein-1 and
macrophage inflammatory protein-1 after focal cerebral ischemia in the
rat. J Neuroimmunol 1995; 56:127-34
12. G. Yilmaz, D. N. Granger. Cell adhesion molecules and ischemic
stroke. Neurol Res 2008; 8:783-93
13. J. Montaner, J. Alvarez-Sabin, C. Molina, A. Angles, S. Abilleira, J.
Arenillas, M. A. Gonzalez, J. Monasterio. Matrix metalloproteinase
expression after human cardioembolic stroke: temporal profile and
relation to neurological impairment. Stroke 2001; 32:1759-66
14.M. Asahi, X. Wang, T. Mori, T. Sumii, J. C. Jung, M. A. Moskowitz, M. E.
Fini, E. H. Lo. Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on
the proteolysis of blood-brain barrier and white matter components
after cerebral ischemia. J Neurosci 2001; 21: 7724-32
15. M. D. Sharma, B. Baban, P. Chandler, D. Y. Hou, N. Singh, H. Yagita,
M. Azuma, B. R. Blazar, A. L. Mellor, D. H. Munn. Plasmacytoid
dendritic cells from mouse tumor-draining lymph nodes directly
46. 38
activate mature Tregs via indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest
2007; 117:2570-82
16. J. C. O'Connor, C. Andre, Y. Wang, M. A. Lawson, S. S. Szegedi, J.
Lestage, N. Castanon, K. W. Kelley,R. Dantzer. Interferon-gamma and
tumor necrosis factor-alpha mediate the upregulation of indoleamine
2,3-dioxygenase and the induction of depressive-like behavior in mice
in response to bacillus Calmette-Guerin. J Neurosci 2009; 29:4200-9
17. Liesz, E. Suri-Payer, C. Veltkamp, H. Doerr, C. Sommer, S. Rivest, T.
Giese, R. Veltkamp. Regulatory T cells are key cerebroprotective
immunomodulators in acute experimental stroke. Nat Med 2009;
15:192-9
18. M. Leist, P. Nicotera. Apoptosis, excitotoxicity, and neuropathology.
Exp Cell Res 1998; 239:183-201
19. R Broughton, D. C. Reutens, C. G. Sobey. Apoptotic mechanisms after
cerebral ischemia. Stroke 2009; 40:331-9
20. M. Valko, D. Leibfritz, J. Moncol, M. T. Cronin, M. Mazur, J. Telser.
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and
human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39:44-84
21. Z. S. Vexler, X. N. Tang, M. A. Yenari. Inflammation in adult and
neonatal stroke. Clin Neurosci Res 2006; 6:293-313
22. T. Kristian, B. K. Siesjo. Calcium in ishemic cell death. Stroke 1998;
29:705-18
23. F. R. Walker, S. B. Beynon, K. A. Jones, Z. Zhao, R. Kongsui, M.
Cairns, M. Nilsson. Dynamic structural remodelling of microglia in
health and disease: a review of the models, the signals and the
mechanisms. Brain Behav Immun. 2014. 37: 1-14
24. P. del Rio-Hortega. Microglia. Cytology and cellular pathology of the
nervous system 1932.
25. J. T. Voyvodic. Cell death in cortical development: how much? Why?So
what?. Neuron 1996; 16:693-6
26. R. B. Rock, G. Gekker, S. Hu, W. S. Sheng, M. Cheeran, J. R.
Lokensgard, P. K. Peterson. Role of microglia in central nervous system
infections. Clin Microbiol Rev 2004; 17:942-64
27. M Mittelbronn, K. Dietz, H. J. Schluesener, R. Meyermann. Local
distribution of microglia in the normal adult human central nervous
system differs by up to one order of magniture. Acta Neuropathol
2001; 101:249-55
28. U. K. Hanisch, H. Kettenmann. Microglia: active sensor and versatile
effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci 2007;
10:1387-94
29. H. G. Fischer, G. Reichmann. Brain dendritic cells and
macrophages/microglia in central nervous system inflammation. J.
Immunol 2001; 166:2717-26
30. R. L. Blaylock, J. Maroon. Immunoexcitotoxicity as a central
mechanism in chronic traumatic encephalopathy-A unifying hypothesis.
Surg Neurol Int 2011; 2:107
31. A. Henn, S. Lund, M. Hedtjarn, A. Schrattenholz, P. Porzgen, M. Leist.
The suitability of BV2 cells as alternative model system for primary
47. 39
microglia cultures or for animal experiments examining brain
inflammation. ALTEX 2009; 26:83-94
32. S. Lund, P. Porzgen, A. L. Mortensen, H. Hasseldam. Inhibition of
microglial inflammation by the MLK inhibitor CEP-1347. J Neurochem.
2005; 92:1439-51
33. U. A. Hirt, M. Leist. Rapid, noninflammatory and PS-dependent
phagocytic clearance of necrotic cells. Cell Death Differ 2003; 10:1156-
64
34. T. A. Samad, K. A. Moore, A. Sapirstein, S. Billet, A. Allchorne, S.
Poole. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS.
Nature 2001; 410:471-5
35. R. Sanchez-Pernaute, A. Ferree, O. Cooper, M. Yu, A. L. Brownell, O.
Isacson. Selective COX-2 inhibition prevents progressive dopamine
neuron degeneration in a rat model of Parkinson's disease. J
Neuroinflammation 2004; 1:6
36. T. J. Borges, L. Wieten, M. J. van Herwijnen, F. Broere, R. van der
Zee, C. Bonorino, W. van Eden. The anti-inflammatory mechanisms of
Hsp70. Front Immunol 2012; 3:95
37. M. Ding, B. A. St. Pierre, J. F. Parkinson, P. Medberry, J. L. Wong, N.
E. Rogers, L. J. Ignarro, J. E. Merrill. Inducible nitric-oxide synthase
and nitric oxide production in human fetal astrocytes and microglia. J.
Biol. Chem 1997; 272:11327-35
38. N. Said-Sadier, D. M. Ojcius. Alarmins, inflamasomes and immunity.
Biomed J 2012; 35:437-49
39. X. Sheng, L. Xingguang, B. Yan, Z. Xuhui, H. Chaofeng. Constitutive
MHC class I molecules negatively regulate TLR-triggered inflammatory
responses via the Fps–SHP-2 pathway. Nature immunology 2011;
13:551-559
40. K. N. Nam, K. Kim, K. Cho, W. Jung, J. Park, S. Cho, S. Park.
Prevention of inflammation-mediated neurotoxicity by
butylidenephthalide and its role in microglial activation. Cell Biochem
Funct. 2013. 31: 707-712
41. H. M. Gibbons. Microglial activation and inhibition: implications for
neurodegeneration. The University of Auckland. 2004;
42. J. G. Sheng, R. E. Mrak, W. S. Griffin. Neuritic plaque evolution in
Alzheimer's disease is accompanied by transition of activated microglia
from primed to enlarged to phagocytic forms. Acta Neuropathol. 1997
94:1-5.
43. S. Rasmussen, Y. Wang, P. Kivisäkk, R. T Bronson, M. Meyer, J.
Imitola, SJ. Khoury. Persistent activation of microglia is associated with
neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple
sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune
encephalomyelitis. Brain. 2007. 130: 2816-2829
44. J. J Rodríguez, H. N. Noristani, T. Hilditch, M. Olabarria, C. Y. Yeh, J.
Witton, A. Verkhratsky. Increased densities of resting and activated
microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1
subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of
Alzheimer's disease. Neurosci lett. 2013. 552: 129-134
48. 40
45. Minagar, P. Shapshak, R. Fujimura, R. Ownby, M. Heyes, C. Eisdorfer.
The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of
three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer
disease, and multiple sclerosis. J Neurol Sci. 2002. 202: 13-23
46. L. Minghetti, A. Nicolini, E. Polazzi, C. Créminon, J. Maclouf, G. Levi.
Inducible nitric oxide synthase expression in activated rat microglial
cultures is downregulated by exogenous prostaglandin E2 and by
cyclooxygenase inhibitors. Glia. 1997. 19: 152-160
47. Y. J. Kim, S. Y. Hwang, E. S. Oh, S. Oh, I. O. Han. IL-1beta, an
immediate early protein secreted by activated microglia, induces
iNOS/NO in C6 astrocytoma cells through p38 MAPK and NF-kappaB
pathways. J Neurosci Res. 2006. 84:1037-1046
48. T. S. Nowak, J. Ikeda, T. Nakajima. 70-kDa heat shock protein and c-
fos gene expression after transient ischemia. Stroke. 1990. 21:107-11
49. M. A. Yenari, R. G. Giffard, R. M. Sapolsky, G. K. Steinberg. The
neuroprotective potential of heat shock protein 70 (HSP70). Mol Med
Today. 1999 5: 525-531.
50. P. W. Sheppard, X. Sun, M. Khammash, R. G. Giffard. Overexpression
of heat shock protein 72 attenuates NF-κB activation using a
combination of regulatory mechanisms in microglia. PLoS Comput Biol.
2014. 10
51. C Chang, S. D. Chen, T. K. Lin, W. N. Chang, C. W. Liou, A. Y. Chang,
S. H. Chan, Y. C. Chuang. Heat shock protein 70 protects against
seizure-induced neuronal cell death in the hippocampus following
experimental status epilepticus via inhibition of nuclear factor-κB
activation-induced nitric oxide synthase II expression. Neurobiol Dis.
201462:241-9.
52. Y. M Yang, D. S. Shang, W. D. Zhao, W. G. Fang, Y. H. Chen.
Microglial TNF-α-dependent elevation of MHC class I expression on
brain endothelium induced by amyloid-beta promotes T cell
transendothelial migration. Neurochem Res 2013; 38: 2295-304.
53. Cupido, B. Catalin, F. Kirchhoff. Cox-2 inhibitors reduce microglia
inflammation in vivo. Confrence: Glia 2014
54. L. Minghetti, A. Nicolini, E. Polazzi, A. Greco, M. Perretti, L. Parente,
G. Levi. Down-regulation of microglial cyclo-oxygenase-2 and inducible
nitric oxide synthase expression by lipocortin 1. Br J Pharmacol 1999;
126:1307-14.
55. S. K. Choi, Y. S. Park, D. K. Choi, H. I. Chang. Effects of astaxanthin
on the production of NO and the expression of COX-2 and iNOS in LPS-
stimulated BV2 microglial cells. J Microbiol Biotechnol 2008; 18:1990-
6.
56. Y. Choi, M. K. Lee, S. Y. Lim, S. H. Sung, Y. C. Kim. Inhibition of
inducible NO synthase, cyclooxygenase-2 and interleukin-1beta by
torilin is mediated by mitogen-activated protein kinases in microglial
BV2 cells. Br J Pharmacol 2009; 156:933-40.
57. R. Ferreira, T. Santos, M. Viegas, L. Cortes, L. Bernardino, O. V.
Vieira, J. O. Malva. Neuropeptide Y inhibits interleukin-1β-induced
49. 41
phagocytosis by microglial cells. J Neuroinflammation 2011; Dec 2;
8:169
58. R. Ferreira, T. Santos, L. Cortes, S. Cochaud, F. Agasse, A. P. Silva, S.
Xapelli, J. O. Malva. Neuropeptide Y inhibits interleukin-1 beta-induced
microglia motility. J Neurochem 2012; 120:93-105.
50. 42
ZAHVALA
Zahvaljujem svojim mentorima, prof. dr. sc. Jasenki Mršić Pelčić
i prof. dr. sc. Nataliji Kučić na nesebičnoj pomoći, brojnim savjetima i
konstruktivnim kritikama. Zahvaljujem svojim roditeljima i sestri na
pruženoj podršci i strpljenju.
51. 43
ŽIVOTOPIS
PERSONAL INFORMATION Mia Merlak
Kalvarija16b, 51000 Rijeka(Croatia)
0912280955
SexFemale | Dateofbirth1 Sep 90| NationalityCroatian
WORK EXPERIENCE
EDUCATION AND TRAINING
PERSONAL SKILLS
2012 Manufacturing labourer
JadranGalenski Laboratorij,Rijeka(Croatia)
2005–2009 Srednja stručna sprema
Prva riječkahrvatskagimnazija,Rijeka(Croatia)
2009–2012 Sveučilišni prvostupnik biotehnologije
Sveučilišteu Rijeci,Odjelza biotehnologiju,Rijeka(Croatia)
2012–Present Magistar biotehnologije u medicini
Sveučilišteu Rijeci,Odjelza biotehnologiju,Rijeka(Croatia)
2006 English language course
UniversityofCambridge,Cambridge(United Kingdom)
12/06/2013
Waters Institute,BohinjskaBistrica(Slovenia)
Seminar (tekućinskakromatograija,masenaspektrometrija,laboratorijskainformatika,
mikrokalorimetrija)
07/07/2013–13/07/2013 SummerSchool
Mass Spectrometryin Biotechnology& Medicine,Dubrovnik (Croatia)
http://www.msbm.org/Home.html
14/06/2013–27/06/2013 SummerSchool
Patofiziologijaaktualnihjavnozdravstvenih problemai bolesti,Rijeka(Hrvatska)
Mother tongue(s) Croatian
52. 44
Other language(s) UNDERSTANDING SPEAKING WRITING
Listening Reading Spoken interaction Spoken production
English C1 C2 C1 C1 C1
talijanski B1 B2 A2 B1 B1
Levels: A1/A2:Basicuser- B1/B2: Independentuser - C1/C2:Proficientuser
CommonEuropeanFrameworkofReferencefor Languages
Communicationskills - rad u timui individualno
- prezentacijske i govorničkevještinestečenena seminarima
Job-related skills -kultiviranje stanica
-rad na svjetlosnom mikroskopu
-gel-elektroforeza
-Westernblot
Computer skills MS Office,HTML,Statistica,PyMol,Chimera,
Driving licence AM, B