Durante questo seminario, grazie ad una disciplina chiamata chemoinformatica, vedremo in dettaglio come si possa migliorare la sicurezza delle sostanze chimiche per la salute e per l'ambiente e, al tempo stesso, individuare un percorso sostenibile per le industrie ed innovativo dal punto di vista scientifico, adottando una serie di soluzioni che prevedono l’uso di metodi computazionali.

1. Tossicologia in silico: modelli per la predizione di
proprietà chimico-tossicologiche di molecole di
importanza industriale (direttiva REACH).
Matteo Floris
CRS4 - IRGB CNR - UniSS

2. Abstract
Tossicologia in silico: Modelli per la predizione di proprietà chimico-tossicologiche di molecole di importanza industriale
(direttiva REACH)
La normativa REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals substance – Regolamento
(CE) n. 1907/2006) ha posto l’accento sulla necessità di avere a disposizione una caratterizzazione sufficiente sulle
proprietà ambientali e tossicologiche delle sostanze chimiche cui siamo esposti nella nostra vita. Le sostanze chimiche
fanno parte della nostra quotidianità (ad esempio additivi negli alimenti o coloranti dei tessuti che indossiamo, ma
anche coloranti, i pesticidi, e i prodotti a base di grassi naturali, vegetali o animali): non dobbiamo pensare che esse
esistano solo negli impianti di produzione, ovvero che l’esposizione si verifichi in occasione di incidenti. Il legislatore
europeo ha voluto tenere conto anche di tutti quei prodotti di uso quotidiano, e quindi non solo delle sostanze chimiche
pure, ma anche in quanto costituenti o presenti nei beni di uso comune.
Per la normativa europea è possibile valutare la loro sicurezza con metodiche innovative. Durante questo seminario
vedremo in dettaglio come si possa migliorare la sicurezza delle sostanze chimiche e al tempo stesso individuare un
percorso sostenibile per le industrie ed innovativo dal punto di vista scientifico, adottando serie di soluzioni che
prevedeono l’uso di metodi computazionali, e che sono possibili grazie ad una disciplina chiamata chemoinformatica.

3. QSAR
(Quantitative) Structure-Activity
Relationship

6. E nel caso delle molecole...
L’esperto è in grado di
identificare i collegamenti
tra la struttura delle
molecole e la loro tossicità

7. A volte è una relazione lineare

8. QSAR

9. Descrittori molecolari
Constitutional / information descriptors:
molecular weight, number of chemical elements,
number of H-bonds or double bonds
Physicochemical descriptors: lipophilicity,
polarizability
Topological descriptors: atomic branching and
ramification
Electronic, geometrical and quantum-chemical
descriptors
Fragmental / structural key

10. Riassumendo
I modelli QSAR sono uno strumento
per predire proprietà molecolari,
come la tossicità
Le predizioni avvengono attraverso l’
uso di descrittori molecolari e l’
applicazione di modelli di regressione
o classificazione e altre tecniche più
avanzate

11. Riassumendo
I modelli QSAR sono uno strumento
per predire proprietà molecolari,
come la tossicità
Le predizioni avvengono attraverso l’
uso di descrittori molecolari e l’
applicazione di modelli di regressione
o classificazione e altre tecniche più
avanzate
Quali sono i campi di
applicazione?

12. Negli USA...
US epa - New Chemicals Program -
Industrial Chemicals
Section 5 of TSCA (Toxic Substance
Control Act) requires a manufacturer
and/or importer of a new chemical
substance to submit a premanufacture
notice (PMN) to US EPA 90 days
before commencing manufacture or
import of the new chemical

13. Negli USA...
Spesso le decisioni sono prese in
assenza di dati sperimentali
Metodi SAR e QSAR sono utilizzati
per aiutare gli esperti nella fase di
revisione

14. … e in Europa
La normativa REACH promuove l’uso
di metodiche innovative (art. 1)
Tutte le informazioni a disposizione
devono essere usate
I metodi QSAR sono menzionati
esplicitamente

15. La normativa REACH
Il regolamento (CE) n.1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio
approvato il 18 dicembre 2006, denominato regolamento "REACH"
(dall'acronimo "Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals"), prevede
la registrazione di tutte le sostanze prodotte o importate nella Comunità in
quantità maggiori di una tonnellata per anno. Si tratta, secondo le stime della
Commissione Europea, di circa 30.000 sostanze chimiche in commercio.
La registrazione di una sostanza consiste nella presentazione, da parte dei
fabbricanti o degli importatori, di alcune informazioni di base sulle sue
caratteristiche e, in mancanza di dati disponibili, nell'esecuzione di test
sperimentali per caratterizzare le relative proprietà fisico-chimiche,
tossicologiche e ambientali.

16. La normativa REACH
Il regolamento REACH, costituito da 141 articoli e 17 allegati tecnici, prevede:
● la valutazione dei test proposti dalle imprese per le sostanze prodotte o
importate nella U.E. in quantità superiori a 100 tonnellate per anno
● la predisposizione da parte dell'industria di una "relazione sulla sicurezza
chimica" per ciascuna sostanza prodotta o importata in quantità superiori a
10 t/anno

17. La normativa REACH
Il regolamento REACH, costituito da 141 articoli e 17 allegati tecnici, prevede:
● la valutazione da parte degli Stati membri di alcune sostanze considerate
prioritarie
● l'autorizzazione, solo per usi specifici e controllati, delle sostanze
"estremamente preoccupanti", come le sostanze cancerogene, mutagene
e tossiche per la riproduzione, le sostanze Persistenti, Bioaccumulabili e
Tossiche (PBT), le sostanze molto Persistenti e molto Bioaccumulabili
(vPvB) e gli "interferenti endocrini"

18. La normativa REACH
Il regolamento REACH, costituito da 141 articoli e 17 allegati tecnici, prevede:
● l'adozione di restrizioni di portata generale per alcune categorie di
sostanze, allo scopo di tutelare la salute umana e proteggere l'ambiente
● l'abrogazione di numerose norme in vigore allo scopo di semplificare il
quadro normativo

19. La normativa REACH
Il regolamento REACH, costituito da 141 articoli e 17 allegati tecnici, prevede:
● l'accesso del pubblico alle informazioni sulle proprietà tossicologiche e
ambientali delle sostanze chimiche
● un'attività di informazione e assistenza tecnica alle imprese (help-desk
nazionali)
● l'effettuazione di attività di controllo e vigilanza da parte degli Stati membri
per garantire il rispetto dei requisiti previsti dal regolamento

21. Gli endpoints
Per la registrazione di sostanze chimiche nell’ambito del REACH, nel dossier
tecnico che le accompagnano è necessario fornire informazioni su diversi
endpoints

22. Gli endpoints
Per la registrazione di sostanze chimiche nell’ambito del REACH, nel dossier
tecnico che le accompagnano è necessario fornire informazioni su diversi
endpoints
Informazioni chimico-fisiche
Boiling point
Relative density
Vapour pressure
Water solubility
Partition coefficient o/w
Granulometry
Viscosity
etc...
Informazioni tossicologiche
Skin irritation or skin corrosion
Eye irritation
Skin sensitisation
Mutagenicity
Acute toxicity
Repeated dose toxicity
Reproductive toxicity
Toxicokinetics
Carcinogenicity
Informazioni eco-tossicologiche
Aquatic toxicity
Degradation
Fate and behaviour in the
environment
Effects on terrestrial organisms
Effects on sediment organisms
Toxicity to birds

23. Dubbi sui metodi in silico?
Spesso si osserva che i metodi QSAR possano essere una scorciatoria per l’
industria per spendere meno in ricerca tossicologica, o che siano un modo per
sacrificare meno animali. Oppure che per salvaguardare ambiente e salute,
servono metodi più attendibili.
Questo è riduttivo!
Infatti il REACH dispone che tutte le informazioni a disposizione vengano
usate: lo scopo non è trovare il miglior metodo QSAR, ma utilizzare i metodi
alternativi nel migliore dei modi per proteggere esseri umani e ambiente.
Pertanto è importante quali vantaggi derivano dall’usare metodi in silico.

24. Perchè usare metodi in silico
Innovazione
Iniziative USA hanno prodotto informazioni di tossicità su
oltre 100.000 composti chimici.

25. Tempistica per gli esperimenti
Il tempo necessario per
ottenere risultati e
misurazioni, soprattutto per
endpoints cronici, sarebbe
troppo lungo; al contrario, i
metodi QSAR sono molto più
veloci.
Perchè usare metodi in silico

26. Necessità di laboratori e risorse
Perchè usare metodi in silico

27. Costi per effettuare solo
esperimenti in vivo
sarebbero veramente alti,
nell’ordine dei miliardi di
euro, mentre i metodi QSAR
sono spesso liberi e gratuiti.
Perchè usare metodi in silico

28. Animali: sarebbe necessario sacrificarne migliaia!
Perchè usare metodi in silico

29. Prioritizzazione
I regolatori devono identificare le sostanze più rischiose, e verificare tutti i
dossiers sottomessi dall’industria.
Diverse decine di migliaia di sostanze sono sottomesse all’ECHA, l’Agenzia
europea responsabile del processo di registrazione. Solo il 5% di queste
vengono valutate: ogni 20 sostanze registrate, l’ECHA riesce a verificare le
proprietà tossicologiche di solo 19 di queste.
Coi metodi QSAR è possibile velocizzare questo processo!
Perchè usare metodi in silico

30. Pro-active approach for safer chemicals
So far chemical industry addressed the development of new chemicals only on
the basis of the target properties for the candidate new products. Critical
issues, such as toxicity, have been analysed in a second stage, to comply to
regulations. QSAR methods offer tools to incorporate the process of the
evaluation of the toxic properties since the beginning of the planning of new
compounds, within a pro-active strategy, minimizing the impact of chemicals on
the environment and human beings, and reducing the economic resources due
to the development of chemicals without the knowledge on their toxicological
and environmental properties.
Perchè usare metodi in silico

32. Il nostro team di lavoro
http://www.life-prosil.eu/

33. Il progetto PROSIL

35. L’articolo 13 del REACH prescrive quanto segue:
Le informazioni relative alle proprietà intrinseche delle sostanze possono
essere acquisite con mezzi diversi dai test [...]
In particolare per quanto riguarda la tossicità umana, le informazioni sono
acquisite, ove possibile, ricorrendo a mezzi diversi dai test su animali
vertebrati, attraverso l'uso di metodi alternativi, ad esempio metodi in vitro
o relazioni qualitative o quantitative struttura-attività o dati relativi a
sostanze strutturalmente affini (raggruppamento o metodo del nesso
esistente - "read-across")
Il read across

36. Il read-across è una tecnica impiegata per colmare le lacune dei dati, che
utilizza le informazioni relative all’endpoint di una sostanza chimica per
prevedere lo stesso endpoint per un’altra sostanza chimica considerata simile
per certi aspetti fondamentali relativi a detto endpoint, per esempio il modo d’
azione, la tossicocinetica, il metabolismo ecc.
Il read-across può fornire un risultato qualitativo o quantitativo.
Il read across

37. Per colmare le lacune dei dati è possibile eseguire il read-across nei seguenti
modi:
● relazione uno a uno (una sostanza analoga è utilizzata per realizzare una
stima per una singola sostanza chimica);
● relazione uno a molti (una sostanza analoga è utilizzata per realizzare
stime per due o più sostanze chimiche);
● relazione molti a uno (due o più sostanze analoghe sono utilizzate per
realizzare una stima per una singola sostanza chimica)
● relazione molti a molti (due o più sostanze analoghe sono utilizzate per
realizzare stime per due o più sostanze chimiche.
Il read across

38. La similarità
similar property principle of Johnson and
Maggiora: similar compounds have similar
properties

39. La similarità
Similarity is a subjective and multifaceted concept, regardless of whether
compounds or any other objects are considered. Despite its intrinsically
subjective nature, attempts to quantify the similarity of compounds have a long
history in chemical informatics and drug discovery. Many computational
methods employ similarity measures to identify new compounds for
pharmaceutical research. However, chemoinformaticians and medicinal
chemists typically perceive similarity in different ways. Similarity methods and
numerical readouts of similarity calculations are probably among the most
misunderstood computational approaches in medicinal chemistry

40. La similarità
A generalizable definition of chemical similarity for read-across
Matteo Floris, Alberto Manganaro, Orazio Nicolotti, Ricardo Medda, Giuseppe
Felice Mangiatordi and Emilio Benfenati

41. La similarità
Concetti:
1. la rappresentazione molecolare
2. le metriche di similarità
3. pesi relativi

42. La rappresentazione molecolare

43. La rappresentazione molecolare
acetylsalicylic acid
C9H8O4
CC(=O)Oc1ccccc1C(O)=O
InChI=1S/C9H8O4/c1-6
(10)13-8-5-3-2-4-7(8)9(11)
12/h2-5H,1H3,(H,11,12)

44. La rappresentazione molecolare
010101010101011000000
010001000001000101000
101001100101000101000
101001000101000101001
100101000001000101000
101001100101000101000
101001000001000101000
101001100101000101000
101000001000101000101
001100000001110001010

45. Fingerprints e chiavi strutturali
The fingerprinting algorithm examines the molecule and generates the
following:
a pattern for each atom
a pattern representing each atom and its nearest neighbors (plus the bonds
that join them)
a pattern representing each group of atoms and bonds connected by paths up
to 2 bonds long
... atoms and bonds connected by paths up to 3 bonds long
... continuing, with paths up to 4, 5, 6, and 7 bonds long.

46. Fingerprints e chiavi strutturali

47. Fingerprints e chiavi strutturali

48. Le metriche di similarità
SimT=C/(A+B-C)
C: count of the identical bits set (ones) in both fingerprints
A: count of total bits set (ones) in fingerprint #1
B: count of bits set (ones) in fingerprint #2.

50. http://www.antares-life.eu/index.php?sec=modellist

55. “Bioconcentration” è il processo in cui la
concentrazione di un composto
chimico in un organismo acquatico
eccede la concentrazione che si rileva
nell’acqua.
La “Bioconcentration” si riferisce ad una
situazione in cui il composto è
assorbito dall’acqua attraverso le vie
respiratorie o attraverso la pelle.
Solitamente si esprime in termini di
Bioconcentration factor.
Il “bioconcentration factor (BCF)” è
pertanto la concentrazione della sostanza
test nel pesce diviso la concentrazione
nel medium allo stato di equilibrio.

56. Le sostanze chimiche definite
“carcinogenic” sono quelle che inducono
tumori, aumentano incidenza di cancro
benigno o maligno o accorciano la vita
media di insorgenza dei tumori.

57. Studi di mutagenicità sono richiesti per
tutti i quantitativi (in tonn.) di sostanze
chimiche.
A differenza di altri endpoint, una
mutagenicità negativa in vitro può essere
considerata una evidenza di potenziale
non-mutagenicità, ma risultati positivi
vanno confermati in vivo.
At 1-10 tonnage level (Annex VII) the in
vitro gene mutation study in bacteria
(Ames test) is required.
At Annex VIII level (10-100 ton), two
additional in vitro studies are required: a
cytogenicity study and a gene mutation
study in mammalian cells.
At higher tonnage in vivo studies are
needed.

58. Test genetico per l'analisi della genotossicità di una sostanza, molto utilizzato
ad esempio in ambito biomedico e farmaceutico-industriale nella fase preclinica
di sperimentazione di nuove molecole e per analisi ambientali.
Il principio del test si basa sulla valutazione della capacità di un sospetto
mutageno di provocare la reversione di un carattere auxotrofo his- in un ceppo
di batteri mutato (Salmonella typhimurium), rendendolo nuovamente capace
di sopravvivere in un terreno privo di istidina.
Test di Ames

59. Test di Ames

60. Regole di tossicità

62. Frammenti di tossicità
DATASET CURATI
DI MUTAGENICITA’
REGOLE DI
FRAMMENTAZIONE
STATISTICA DI
PRIORITIZZAZIONEREGOLE

63. Frammenti di tossicità
DATASET CURATI
DI MUTAGENICITA’
REGOLE DI
FRAMMENTAZIONE
STATISTICA DI
PRIORITIZZAZIONEREGOLE
6065
MOLECOLE CDK
FISHER
TEST (R)
DATASET
ESTERNO (JP)

64. Frammenti di tossicità
1. Exhaustive fragmentation:
a. RECAP method: Fragment cleaves single bonds to generate
molecular fragments. The cleavage rules can correspond to retro-
chemical reactions in order to enhance synthetic accessibility.
b. CCQ fragmenta2on is a fast and simple method by fragmenting along
functional groups but not destroying them, so no rules, no labelling is
needed.
2. Overall “unique” list of Fragments is converted to InChI -> database of
mappings.
3. 2D fingerprints calculated for each fragment –> fragment similarity metrix
(cutoff=0.85)

65. Frammenti di tossicità
● All the fragment-molecule pairs (81.667) were validated
by using the substructure search implementation of
Pybel (Mutagenicity dataset)
● 52.382 pairs validated (64%, corresponding to 30.782
unique fragments), 37.501 rejected (36.738 unique
fragments), 14.432 SMARTS exceptions
● Fisher exact test for identification of significant
fragments
● 238 fragments with P < 0.01

68. Metabolismo e tossicità
Una molecola può non essere tossica, un suo
metabolita si (o viceversa)
Issues:
- spesso gli algoritmi sono fatti con regole che “sottintendono” modifiche
metaboliche
- doppia predizione

69. Contatti
matteo.floris@gmail.com

70. Consigli per la lettura
http://www.antares-life.eu/learning.php

71. Ringraziamenti
Ricardo Medda
Emilio Benfenati
Fabrizio Murgia, Giuditta Lecca, Andrea Mameli