2. Clathrine en Kinase afhankelijke EGFR internalizatie Time (min) EGF Internalized/Surface

4. Dimerization induced by FKBP

5. Dimerization EGFR induces Kinase independent EGFR internalization

6. Res 1005-1017 essential for kinase independent internalization Wang et al 2007

7. Di-Leucine motif essential for kinase independent internalization Wang et al 2007

8. Verschillende internalisatie mechanismes Dimerizatie afhankelijk Afhankelijk van ubiquitinering

9. Afbraak van de EGFR in lysosomen

10. Late endosomen/multi-vesicular bodies

11. 3D morphologie van het MVB

12. Morphologie van het MVB

13. Het lysosoom, het vuilnisvat van de cel lysosoom Late endosomen

15. EGFR ubiquitinering noodzakelijk voor afbraak

16. Hoe wordt de EGFR afgebroken?

17. Valorisatie Doel : Sturen van SMI’s (small molecule inhibitor) Naar intracellulaire locatie van de tumor cel. Langzaam vrijkomen van de remmer.

18. Antibody fragments: Fab’s and Nanobodies (VHH) VH CH1 VL CL CH2 CH3 VHH CH2 CH3 Conventional antibody ‘ Heavy chain only’ antibody Fab NB

20. Multiple formats of nanobodies Multivalent Improve avidity Crosslinking Multi-specific Increase efficacy Effector domain Improve functionality Extend half-life Therapy

21. EGFR internalization Via EGFR Oligomerizatie

22. Epitope specificity anti-EGFR NBs 7D12 Dom III 9G8 Dom II/III EgB4 Dom IV EgC9 Dom I 7D12 Plasma membrane Tyrosine kinase Rob Roovers IV III II I 9G8 EgB4 EgC9

23. Affinities 7D12-9G8 7D12 9G8 nM 50.0 25.0 12.5 6.25 … Sabrina Oliveira 3T3 2.2 14C cells Nanobody ~ Kd nM ~ IR:protein 7D12 1.5 0.4 9G8 5 0.7 7D12-9G8 1 0.6 7D12-9G8-Alb 2 0.8 EGb4 7 0.4 Cetuximab 0.5 1.4

24. Some compete with EGF others do not Raimond Heukers

25. No agonists Raimond Heukers

26. EGFR internalization Induced by Oligomerization

27. Nanobody-induced EGFR transport Jeroen Vermeulen

28. TRI induces EGFR degradation Jeroen Vermeulen

29. NB-stimulated EGFR degradation depends upon lysosomes Degradation Degradation in presence of chloroquine Jeroen Vermeulen