1. NGS

2. Next-generation sequencing =
High-throughput sequencing =
Massive parallel sequencing
2

3. 3

4. Анализ данных
Сырые изображения
Риды
Сборка и выравнивание
Поиск вариантов
Аннотирование
4

5. DO NOT COPY WITHOUT PERMISSION
5

6. Sanger NGS
Library preparation
Template preparation
Sequencing
6

7. Параметры NGS секвенаторов
• Производительность
• Длина прочтения (рида)
• Количество ридов
• Точность
• Типы возможных ошибок
• Стоимость запуска

8. Методы NGS
• Секвенирование синтезом
– Пиросеквенирование
– Полупроводниковое секвенирование
– Синтез с обратимой терминацией
– Секвенирование в реальном времени
• Секвенирование лигированием
8

9. NGS technologies
Платформа Методика
секвенирования
Подготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences
(Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦР
GS FLX Titanium,
GS Junior
+ Длинные риды
- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)
Синтез с обратимой
терминацией
Твердофазная ПЦР
(Bridge PCR)
HiSeq 2000,
MiSeq
+ Высокая
производительность
Applied Biosystems (Life
Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4
+ Высокая точность
- Короткие риды
Ion Torrent (Life
Technologies)
Полупроводниковое
секвенирование
Эмульсионная ПЦР
Ion PGM,
Ion Proton
+ Низкая стоимость
- Ошибки в гомополимерах
Helicos Biosciences
Синтез с обратимой
терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific Biosciences
Секвенирование в
реальном времени
Нет PacBio RS
+ Длинные риды
- Высокий процент ошибок
9

10. NGS technologies
Платформа Методика
секвенирования
Подготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences
(Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦР
GS FLX Titanium,
GS Junior
+ Длинные риды
- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)
Синтез с обратимой
терминацией
Твердофазная ПЦР
(Bridge PCR)
HiSeq 2500,
MiSeq
+ Высокая
производительность
Applied Biosystems (Life
Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4
+ Высокая точность
- Короткие риды
Ion Torrent (Life
Technologies)
Полупроводниковое
секвенирование
Эмульсионная ПЦР
Ion PGM,
Ion Proton
+ Низкая стоимость
- Ошибки в гомополимерах
Helicos Biosciences
Синтез с обратимой
терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific Biosciences
Секвенирование в
реальном времени
Нет PacBio RS
+ Длинные риды
- Высокий процент ошибок
10

11. NGS technologies
Платформа Методика
секвенирования
Подготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences
(Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦР
GS FLX Titanium,
GS Junior
+ Длинные риды
- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)
Синтез с обратимой
терминацией
Твердофазная ПЦР
(Bridge PCR)
HiSeq 2500,
MiSeq
+ Высокая
производительность
Applied Biosystems (Life
Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4
+ Высокая точность
- Короткие риды
Ion Torrent (Life
Technologies)
Полупроводниковое
секвенирование
Эмульсионная ПЦР
Ion PGM,
Ion Proton
+ Низкая стоимость
- Ошибки в гомополимерах
Helicos Biosciences
Синтез с обратимой
терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific Biosciences
Секвенирование в
реальном времени
Нет PacBio RS
+ Длинные риды
- Высокий процент ошибок
11

12. NGS technologies
Платформа Методика
секвенирования
Подготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences
(Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦР
GS FLX Titanium,
GS Junior
+ Длинные риды
- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)
Синтез с обратимой
терминацией
Твердофазная ПЦР
(Bridge PCR)
HiSeq 2500,
MiSeq
+ Высокая
производительность
Applied Biosystems (Life
Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4
+ Высокая точность
- Короткие риды
Ion Torrent (Life
Technologies)
Полупроводниковое
секвенирование
Эмульсионная ПЦР
Ion PGM,
Ion Proton
+ Низкая стоимость
- Ошибки в гомополимерах
Helicos Biosciences
Синтез с обратимой
терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific Biosciences
Секвенирование в
реальном времени
Нет PacBio RS
+ Длинные риды
- Высокий процент ошибок
12

13. NGS technologies
Платформа Методика
секвенирования
Подготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences
(Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦР
GS FLX Titanium,
GS Junior
+ Длинные риды
- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)
Синтез с обратимой
терминацией
Твердофазная ПЦР
(Bridge PCR)
HiSeq 2500,
MiSeq
+ Высокая
производительность
Applied Biosystems (Life
Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4
+ Высокая точность
- Короткие риды
Ion Torrent (Life
Technologies)
Полупроводниковое
секвенирование
Эмульсионная ПЦР
Ion PGM,
Ion Proton
+ Низкая стоимость
- Ошибки в гомополимерах
Helicos Biosciences
Синтез с обратимой
терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific Biosciences
Секвенирование в
реальном времени
Нет PacBio RS
+ Длинные риды
- Высокий процент ошибок
13

14. NGS technologies
Платформа Методика
секвенирования
Подготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences
(Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦР
GS FLX Titanium,
GS Junior
+ Длинные риды
- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)
Синтез с обратимой
терминацией
Твердофазная ПЦР
(Bridge PCR)
HiSeq 2500,
MiSeq
+ Высокая
производительность
Applied Biosystems (Life
Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4
+ Высокая точность
- Короткие риды
Ion Torrent (Life
Technologies)
Полупроводниковое
секвенирование
Эмульсионная ПЦР
Ion PGM,
Ion Proton
+ Низкая стоимость
- Ошибки в гомополимерах
Helicos Biosciences
Синтез с обратимой
терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific Biosciences
Секвенирование в
реальном времени
Нет PacBio RS
+ Длинные риды
- Высокий процент ошибок
14

15. 15

16. “Benchtop” sequencers
16

17. 454 (Roche)
GS FLX Titanium GS Junior
17

18. Chemistry of DNA synthesis

19. Пиросеквенирование
19

20. Пиросеквенирование
20

21. Ion Torrent
(Life Technologies)
21

22. 22

23. Полупроводниковое
секвенирование
23

24. Быстрая прямая детекция
Rothberg J.M. et al Nature doi:10.1038/nature10242
Пластина сенсора
Кремниевый субстрат
Drain SourceBulk
дНТФ
К ресиверу
∆pH
∆Q
∆ V
Чувствительный слой
H+
24

25. CGCTAAGTAATATTCGCCCCGTTCACACGATTCCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTGTTAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CGCTAAGTAATATTCGCCCCGTTCACACGATTCCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTGTTAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGA
1 100
GGAGCCAAATTCTAAAAATTCGCTTTTTTAGCGCAATGTCACTGACCTTAGTTGAACATTGTTTTTTAACGGATAGCGGGTTTTTAACATCTTAAGCGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGAGCCAAATTCTAAAAATTCGCTTTTTTAGCGCAATGTCACTGACCTTAGTTGAACATTGTTTTTTAACGGATAGCGGGTTTTTAACATCTTAAGCGCC
101 200
CTCGACCTTTATGGTTGAGGGCGTTTTGCTATGAACGCCATCACCATTTTCCCCTCGATTATAAAACTTGAGTTATTCAGTAGTCTCCCCTCTTGCAACT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCGACCTTTATGGTTGAGGGCGTTTTGCTATGAACGCCATCACCATTTTCCCCTCGATTATAAAACTTGAGTTATTCAGTAGTCTCCCCTCTTGCAACT
201 300
CACACCCAAAACTGCCTAACGAAAAGTTATTAATTTTCAATCATATTGCTATCAGTATTTACATTTTTTCGCTGTGCTAGAAAGGGCGCATTTATGTTAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CACACCCAAAACTGCCTAACGAAAAGTTATTAATTTTCAATCATATTGCTATCAGTATTTACATTTTTTCGCTGTGCTAGAAAGGGCGCATTTATGTTAG
301 400
CTCGTTCAGGGAAGGTAAGCATGGCTACGAAGAAGAGAAGTGGAGAAGAAATAAATGACCGACAAATATTATGCGGGATGGGAATTAAACTACGCCGCTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCGTTCAGGGAAGGTAAGCATGGCTACGAAGAAGAGAAGTGGAGAAGAAATAAATGACCGACAAATATTATGCGGGATGGGAATTAAACTACGCCGCTT
401 500
AACTGCGGGTATCTGTCTGATAACT
|||||||||||||||||||||||||
AACTGCGGGTATCTGTCTGATAACT
501 600
25

26. Чипы Ion 314 и Ion 316 с проточными ячейками
pH-сенсорные чипы
26

27. Расположение лунок на поверхности pH-сенсорных чипов
Ion 314 Ion 316 Ion 318
pH-сенсорные чипы
Вид сенсорных чипов на срезе (сканирующая электронная микроскопия) 27

28. Scalability
2011 2012 2013
10 Mb
100 Mb
1 Gb
10 Gb
100 Gb
28

29. Sequencing: Ionograms
Sequence: AATCTTCTG…
Key Sequence
TTT
TCAG
AA
29

30. Illumina
HiSeq MiSeq
30

31. Модифицированные нуклеотиды

32. Illumina
32

33. Bridge PCR
33

34. Applied Biosystems
(Life Technologies)
SOLiD 34

35. Лигирование

36. Секвенирование лигированием
36

37. Лигирование с олигонуклеотидными
зондами
37

38. 38

39. HeliScope™
Мономолекулярное
секвенирование
PacBio RS
39

40. Helicose
40

41. Pacific Biosciences
• Большая длина прочтения
• Ошибки не зависят от последовательности
• Чтение модифицированных нуклеотидов
• Высокий процент ошибок
• Высокая стоимость 41

42. Phospholinked Fluorescent Nucleotides or
Real-time sequencing
42

43. Pacific BioSciences
43

44. Oxford Nanopore
44

45. 45

46. 46

47. Sanger & NGS
47

48. Next Next generation sequencing
48

49. Спасибо за внимание