Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
------------  ----------
NGỌ VĂN NGÔN
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN
RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO
XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG
BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
------------  ----------
NGỌ VĂN NGÔN
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN
RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO
XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG
BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM
CHUYÊN NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT
MÃ SỐ: 62.62.01.12
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Nguyễn Văn Viết
2. TS. Hà Viết Cƣờng
HÀ NỘI, NĂM 2015

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện.
Công trình đƣợc thực hiện trong thời gian từ năm 2012-2014.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, chƣa
từng bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.
Luận án có sử dụng kết quả của đề tài khoa học “Nghiên cứu chọn tạo giống
lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng kỹ thuật chỉ thị ADN” do PGS.TS. Nguyễn
Văn Viết - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm đề tài phối hợp
với Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát
triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Phần kết quả nghiên cứu
này đã đƣợc những ngƣời cùng tham gia thực hiện cho phép công bố trong luận án.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc
cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả luận án
Ngọ Văn Ngôn

ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc, Ban Đào tạo sau
đại học, các quý thầy, cô giáo của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã hƣớng
dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu
và thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn
Văn Viết và TS. Hà Viết Cƣờng, những ngƣời thầy tâm huyết đã tận tình hƣớng
dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hƣớng khoa học cho
tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ
sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây
thực phẩm; Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, các địa phƣơng tác giả thu thập số liệu, quý thầy cô, cán bộ nghiên cứu, các
phòng, bộ môn của đơn vị đã có nhiều ý kiến đóng góp và tạo điều kiện giúp đỡ quý
báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, tác giả các công trình công bố
đã trích dẫn trong luận án vì đã cung cấp nguồn tƣ liệu quý báu, những kiến thức
liên quan trong quá trình tác giả nghiên cứu hoàn thiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo UBND Thành phố Hà Nội, Sở Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn Hà Nội; Chi cục Phát triển nông thôn Hà Nội đã tạo
điều kiện giúp đỡ về thời gian và tài chính để tác giả hoàn thành luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên
tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án.
Cuối cùng, với tình yêu từ đáy lòng, tác giả xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ,
vợ, con cùng các anh, chị, em của tác giả, những ngƣời thân yêu trong gia đình đã
luôn ở bên cạnh, động viên về vật chất và tinh thần để tác giả vững tâm hoàn thành
luận án của mình.
Xin chân thành cảm ơn.
Tác giả luận án
Ngọ Văn Ngôn

iii
MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các bảng viii
Danh mục các hình xi
MỞ ĐẦU 1
1 Tính cấp thiết của đề tài 1
2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4
4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4
5 Những đóng góp mới của luận án 5
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 6
1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 6
1.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam 7
1.2 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc 8
1.3 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 10
1.4 Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 11
1.5 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum 12
1.5.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo 12
1.5.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum 13
1.5.3 Phƣơng thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum 14
1.5.4 Ảnh hƣởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của
bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 15
1.5.5 Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh 16
1.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc 17
1.6.1 Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum 17
1.6.2 Chủng 18

iv
1.6.3 Loài phức 19
1.6.4 Kiểu gây bệnh 19
1.6.5 Kiểu quan hệ phả hệ 19
1.7 Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 20
1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh 20
1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 22
1.8 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và
chọn lọc giống kháng bệnh 25
1.8.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống
kháng bệnh 25
1.8.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo
xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 28
CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.1 Nội dung nghiên cứu 36
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37
2.3 Vật liệu nghiên cứu 37
2.4 Môi trƣờng, hóa chất dùng trong nghiên cứu 39
2.4.1 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong phân lập vi khuẩn, phản ứng sinh hóa 39
2.4.2 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong PCR 40
2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 40
2.5.1 Phƣơng pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng 40
2.5.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 41
2.5.3 Phƣơng pháp thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh
héo xanh lạc 41
2.5.4 Phƣơng pháp xác định biovar của vi khuẩn R.solanacearum 42
2.5.5 Phƣơng pháp thí nghiệm một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển
của vi khuẩn R. solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh
héo xanh hại lạc 43
2.5.6 Phƣơng pháp phân tích ADN 44

v
2.5.7 Phƣơng pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu
bệnh HXVK của nguồn vật liệu 48
2.5.8 Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tập đoàn và so sánh giống 49
2.5.9 Chỉ tiêu theo dõi 50
2.5.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 51
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52
3.1 Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh
trồng lạc miền Bắc Việt Nam 52
3.1.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền
Bắc Việt Nam 52
3.1.2 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 54
3.1.3 Phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc
Việt Nam 55
3.1.4 Thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 58
3.2 Nghiên cứu biovar và đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum gây
bệnh héo xanh hại lạc 60
3.2.1 Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 60
3.2.2 Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sự phát triển khuẩn lạc của một số
isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thuộc các
biovar khác nhau 63
3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R.
solanacearum bằng phân tích ADN 67
3.2.4 Sự phân bố các biovar và đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn
R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 72
3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn
mẫu giống lạc, dòng lai và dòng triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân
tạo và chọn lọc dòng, giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78
3.3.1 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn
mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc mẫu giống
kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78

vi
3.3.2 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng
lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc
dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 92
lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn
lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 101
lạc ƣu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng
kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 109
lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng kháng
bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 115
3.3.6 Kết quả khảo nghiệm Quốc gia giống lạc triển vọng 125
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128
1 Kết luận 128
2 Đề nghị 129
Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 130
Tài liệu tham khảo 131
Phụ lục 144

vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ
STT Ký hiệu, chữ viết
tắt và thuật ngữ
Diễn giải ký hiệu, chữ viết tắt và thuật ngữ
1 o
C Nhiệt độ (độ C)
2 l Microliter
3 ADN Deoxy Nucleic Acid
4 Biovar Thứ sinh học
5 Bp base pair (cặp bazơ)
6 BVTV Bảo vệ thực vật
7 Cs Cộng sự
8 CT Công thức
9 ĐC Đối chứng
10 g Gram
11 HXVK Héo xanh vi khuẩn
12 ICRISAT International Crops Research Institute for the Semi-Arid
Tropics (Viện Nghiên cứu Cây trồng cho vùng nhiệt đới
bán khô hạn Quốc tế)
13 Isolate Mẫu thu thập
14 NXB Nhà xuất bản
15 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
16 R. solanacearum Ralstonia solanacearum
17 Race Nòi
18 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình ADN
đƣợc nhân bội ngẫu nhiên)
19 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình
chiều dài của đoạn cắt giới hạn)
20 SPA Sucrose Peptone Agar
21 SSR Simple Sequence Repeat (Trình tự lặp lại đơn giản)
22 Strain Chủng
23 STT Số thứ tự
24 TLB Tỷ lệ bệnh
25 TZCA Tetrazolium Chloride Agar

viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1.1 Giá trị sản xuất và sản lƣợng lạc của một số nƣớc đứng đầu thế giới
(niên vụ 2011/2012) 6
1.2 Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc của Việt Nam (năm 2002 - 2012) 7
1.3 Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi
khuẩn gây ra ở châu Á 8
2.1 Trình tự các chỉ thị phân tử SSR liên kết với tính trạng kháng bệnh
héo xanh vi khuẩn 38
2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 39
2.3 Phản ứng xác định biovar vi khuẩn R. solanacearum 43
2.4 Mức độ chống chịu bệnh HXVK hại lạc 49
3.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại một số tỉnh miền Bắc
Việt Nam, vụ Xuân năm 2012 53
3.2 Đặc điểm hình dạng, màu sắc khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn
R. solanacearum trên môi trƣờng nhân tạo sau nuôi cấy 72 giờ 56
3.3 Kết quả kiểm tra phản ứng siêu nhạy của một số isolate vi khuẩn
R. solanacearum hại lạc trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 58
3.4 Kết quả xác định biovar của 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây
bệnh héo xanh hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012-2013) 60
3.5 Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến sự phát triển khuẩn lạc
của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc (Viện Bảo vệ
thực vật, năm 2012) 64
3.6 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate
vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA (Viện Bảo vệ
thực vật, năm 2012) 65
3.7 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc
một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA
(Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 66

ix
3.8 Mức độ đa hình của 10 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân tích với các
isolate vi khuẩn R. solanacearum (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 68
3.9 Phân bố biovar vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng
lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 73
3.10 Phân bố của các nhóm vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh
trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 74
3.11 Biovar và nhóm đa dạng di truyền của các mẫu bệnh ở một số tỉnh
trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 75
3.12 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK của tập đoàn mẫu giống lạc
(Thanh Trì, năm 2012 - 2013) 79
3.13 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK tập đoàn mẫu
giống lạc (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2013) 84
3.14 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn
mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm
2012-2013) 87
3.15 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực của thu một số mẫu
giống lạc trong tập đoàn (năm 2012-2013) 91
3.16 Đánh khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các
dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Thanh Trì, năm 2014) 92
3.17 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các
dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 95
3.18 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng
lạc từ các tổ hợp lai đơn (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ,
năm 2014) 98
3.19 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc
từ tổ hợp lai đơn (năm 2014) 101
3.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các
dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Thanh Trì, năm 2013-2014) 102
3.21 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc
từ một số tổ hợp lai hồi quy (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 104

x
lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy 106
từ tổ hợp lai hồi quy (năm 2013-2014) 108
3.24 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các
dòng lạc ƣu tú (Thanh Trì, năm 2014) 109
ƣu tú (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 112
lạc ƣu tú (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 113
ƣu tú (năm 2014) 115
3.28 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo
của các dòng lạc triển vọng (Thanh Trì, năm 2013-2014) 116
triển vọng (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 119
3.30 Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc triển vọng 120
3.31 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng
(Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 121
lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm
2013-2014) 122
triển vọng (năm 2013-2014) 124
3.34 Tình hình bệnh hại chính và khả năng chịu hạn của các giống lạc khảo
nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng
Quốc gia, 2014) 125
3.35 Năng suất của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm
nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) 126

xi
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên hình Trang
3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng năm 2012 55
3.2 Hình thái vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên (A)- môi
trƣờng TZC; (B) - môi trƣờng SPA; (C) và (D)- bảo quản nguồn vi khuẩn 57
3.3 Thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 59
3.4 Xác định biovar các isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo
xanh hại lạc 62
3.5 Kết quả tách chiết ADN một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 67
3.6 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R.
solanacearum với mồi OPB7 69
3.7 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R.
solanacearum với mồi OPC2 69
3.8 Quan hệ di truyền giữa các isolate vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh
trồng lạc miền Bắc Việt Nam (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 70
3.9 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc bằng
lây nhân tạo (năm 2013) (A: sau lây 30 ngày; B: sau lây 45 ngày) 81
3.10 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5
với 25 mẫu giống lạc 82
3.11 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR Chỉ thị GA161 với 25
mẫu giống lạc 82
3.12 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 25
mẫu giống lạc 83
3.13 Thí nghiệm tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát
triển Đậu đỗ, năm 2013) 89
với 16 dòng, giống lạc 110
3.15 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16
dòng, giống lạc 111

xii
với 16 dòng, giống lạc 117
3.18 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16
3.20 Giống lạc L28 và L29 124

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày thuộc họ đậu, có
nguồn gốc ở Nam Mỹ và đƣợc trồng ở trên 100 quốc gia thuộc cả 6 châu lục. Lạc là
cây trồng có giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp đứng thứ 2
trong các cây lấy dầu thực vật. Sản phẩm chế biến từ lạc rất đa dạng, trong đó chủ
yếu từ hạt. Hạt lạc là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến và
khô dầu. Bên cạnh giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế, cây lạc còn có thể trồng xen,
trồng gối với những cây trồng khác góp phần cải tạo đất, chuyển dịch cơ cấu cây
trồng nông nghiệp tăng thêm nguồn thu nhập cho ngƣời sản xuất.
Ở Việt Nam, lạc đang là một trong số các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan
trọng. Ngoài ra, lạc còn là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, không đòi hỏi đầu
tƣ phân bón cao do bộ rễ có khả năng cố định đạm, tạo ra lƣợng đạm sinh học cung
cấp cho cây và làm tăng độ phì cho đất. Hiện nay, lạc là cây họ đậu chính tham gia
vào các công thức luân canh, xen canh mang tính bền vững và thân thiện với môi
trƣờng. Trong hơn 100 quốc gia trồng lạc trên thế giới, Việt Nam đứng thứ 10 về
diện tích và trong 25 nƣớc trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích
gieo trồng sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma và Indonesia (FAO, 2013).
Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên nhƣng năng suất
và sản lƣợng lạc tăng chƣa tƣơng xứng với tiềm năng. Nguyên nhân chủ yếu là hầu
hết các địa phƣơng trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nƣớc trời nhƣ đất
đồi gò, đất bãi ven sông thƣờng bị bệnh gây hại, trong đó bệnh héo xanh do vi
khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là đối tƣợng gây hại nặng trên cây lạc.
Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng
trồng lạc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Mỹ, Nhật Bản, Papua New
Guinea, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Trung Quốc, Uganda, Việt Nam,…
(He, 1986; Hayward, 1990; Mehan et al., 1994; Lam và Hamidah, 1995). Bệnh
HXVK gây hại nghiêm trọng trên cây lạc với tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5%
đến 20% (Mehan et al., 1986), thậm chí có những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể
tới 100% (Tan et al., 1994).

2
Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến
ở nhiều tỉnh trồng lạc trong cả nƣớc nhƣ: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình, Thanh
Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh,... (Mehan và cs., 1991; Nguyễn
Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lƣơng Tề, 1997a). Bệnh gây hại nghiêm trọng ở một
số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động trong
khoảng 15% đến 35% và ở vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là từ
20% đến 30%.
Năm 1896 nhà bác học Smith là ngƣời đã phát hiện vi khuẩn R. solanacearum
gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990). Bệnh HXVK gây hại nặng ở vùng nhiệt
đới, á nhiệt đới và các vùng có nhiệt độ ấm áp. Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây
hại trên 400 loài cây trồng thuộc 80 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn có thể tồn tại
lâu trong hạt giống, trong đất và cỏ dại, chính vì vậy việc phòng chống bệnh gặp
nhiều khó khăn.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn
hại lạc ở trong nƣớc và trên thế giới nhƣ biện pháp luân canh, sinh học, hóa học,
bằng giống kháng bệnh... Tuy nhiên sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ
động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn (Liao, 2005a).
Trong thời gian qua, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện
Bảo vệ thực vật đã chọn tạo thành công một số giống lạc kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn nhƣ giống MD7 và giống TK10 phát triển ở một số vùng thƣờng bị bệnh gây
hại góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên, các giống này sản xuất liên tục
trong thời gian dài nên bị thoái hóa, năng suất và khả năng kháng bệnh giảm dần.
Công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở nƣớc ta đã đạt
đƣợc những kết quả đáng khích lệ, tuy nhiên chủ yếu theo phƣơng pháp truyền
thống nên hiệu quả tích lũy các gen kháng bệnh vào con lai còn khó khăn và mất
thời gian dài. Đến nay ở nƣớc ta chƣa có nghiên cứu nào về sử dụng chỉ thị phân tử
để chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn đƣợc công bố. Các nghiên cứu
mới chỉ khảo sát đánh giá mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của mẫu giống lạc
bằng quan sát, đánh giá bệnh trong điều kiện nhân tạo và đánh giá ở các khu vực có
nguồn bệnh trong điều kiện sản xuất.

3
Để rút ngắn thời gian trong việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn, ứng dụng chỉ thị phân tử là con đƣờng ngắn và hiệu quả, không những góp
phần hạn chế tác hại của bệnh mà còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong
phòng chống bệnh, bảo vệ môi trƣờng và tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc (Liao
et al., 2005b; Peng et al., 2011; Ding et al., 2012). Trong chọn tạo giống lạc kháng
bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử, cần xác định biovar, nòi và đánh giá đa
dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc đồng thời phải chọn lọc đƣợc
nguồn vật liệu các dòng, giống lạc mang gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và
chỉ thị phân tử, từ đó làm cơ sở chọn tạo ra các dòng, giống lạc mới mang gen kháng
với biovar, nòi vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc phổ biến ở các vùng sản xuất.
Nhằm giải quyết đƣợc các yêu cầu quản lý bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc
trong sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, việc thực hiện đề tài “Nghiên
cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo
xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc
Việt Nam” mang tính thời sự cấp thiết.
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
2.1. Mục tiêu
Xác định đƣợc đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo
xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam và dòng, giống lạc kháng
bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống
bệnh có hiệu quả.
2.2. Yêu cầu
Điều tra xác định đƣợc mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số tỉnh
trồng lạc miền Bắc Việt Nam.
Xác định đƣợc biovar, nòi và đặc điểm sinh học một số isolate vi khuẩn
R. solanacearum thu thập ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam.
Đánh giá đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum và sự
phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Đánh giá đƣợc khả
năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn giống, con lai và dòng lạc
triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử.

4
Trên cơ sở chọn lọc các dòng, giống kháng bệnh và đánh giá một số đặc
điểm nông học chính, xác định đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh, có năng suất
cao để phát triển trong sản xuất.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp thông tin khoa học mới về đa dạng di truyền của vi khuẩn
R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam.
Cung cấp tƣ liệu khoa học mới về áp dụng phƣơng pháp sinh học phân tử kết
hợp với đánh giá bệnh nhân tạo nguồn vật liệu và dòng, giống lạc kháng bệnh cho
chọn tạo, phát triển giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Từ kết quả xác định đƣợc sự phân bố biovar, đa dạng di truyền các isolate vi
khuẩn R. solanacearum ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam làm cơ sở bố trí
giống kháng bệnh. Xác định đƣợc vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở miền Bắc Việt
Nam thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1.
Một số mẫu giống lạc nhƣ L28, L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn và có năng suất cao có thể sử dụng trong quản lý cây trồng tổng hợp nhằm
sản xuất lạc hiệu quả, bền vững.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Loài vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc.
Một số mẫu giống lạc trong tập đoàn, dòng lai, dòng triển vọng và giống lạc
đƣợc trồng ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam là ký chủ của vi khuẩn R. solanacearum
gây bệnh héo xanh hại lạc.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài thực hiện tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ
thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Trung
tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm.
Nghiên cứu tập trung vào điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi
khuẩn trên đồng ruộng; xác định đa dạng di truyền, đặc điểm sinh học một số isolate vi

5
khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt
Nam; đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn và chọn lọc các dòng,
giống lạc kháng bệnh bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chỉ thị phân tử.
5. Những đóng góp mới của luận án
Luận án bổ sung các tƣ liệu khoa học mới về bệnh héo xanh vi khuẩn hại
lạc đặc biệt là phòng chống bằng giống kháng bệnh; sử dụng thành công phƣơng
pháp sinh học phân tử kết hợp phƣơng pháp truyền thống trong xác định đa dạng
di truyền vi khuẩn R. solanacearum và chọn lọc giống lạc kháng bệnh héo xanh
vi khuẩn.
Ứng dụng thành công đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp với chỉ thị phân tử
SSR là pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn chọn lọc đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh HXVK và có năng suất cao
gồm 26 mẫu giống trong tập đoàn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến
kháng cao), 07 dòng từ tổ hợp lai đơn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình
đến kháng, năng suất từ 35,7-41,6 tạ/ha), 14 dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy
(kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,4-40,6
tạ/ha), 13 dòng lạc ƣu tú (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng,
năng suất từ 36,6-40,5 tạ/ha) và 04 dòng lạc triển vọng (kháng bệnh HXVK mức
kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-37,8 tạ/ha) để làm vật liệu chọn tạo
và phát triển giống kháng bệnh.
Xác định đƣợc 2 giống lạc triển vọng gồm L28 và L29 có khả năng kháng
bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao đã đƣợc khảo nghiệm Quốc gia để phát
triển trong sản xuất.

6
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới
Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tƣơng trong số các cây trồng lấy dầu
thực vật (cả về diện tích và sản lƣợng) và đƣợc trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia
trên thế giới. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng Thế giới (FAO, 2013),
các nƣớc có sản lƣợng lạc lớn nhất trong niên vụ 2011/2012 là Trung Quốc, Ấn Độ,
Nigeria và Mỹ (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Giá trị sản xuất và sản lượng lạc của một số nước đứng đầu thế giới
(niên vụ 2011/2012)
Tên nƣớc Giá trị sản xuất (USD) Sản lƣợng (tấn)
Trung Quốc 7.388,368 16.800,000
Ấn Độ 2.452,413 5.779,000
Nigeria 1.308,585 3.070,000
Mỹ 1.334,413 3.057,850
Myanmar 551,522 1.371,500
Tanzania 348,380 810,000
Indonesia 315,292 712,874
Argentina 299,808 685,722
Senegal 285,484 672,803
Cameroon 242,354 570,000
Nguồn: FAO (2013).
Năng suất lạc trung bình toàn thế giới tăng, song cũng không đều giữa các
vùng lãnh thổ, vùng tăng nhiều, vùng tăng ít, thậm chí nhiều nơi diện tích và năng
suất lạc đều giảm. Năng suất lạc thế giới trong niên vụ 2011/2012 trung bình đạt
1,57 tấn/ha (FAO, 2013).
Trong niên vụ 2011/2012 về sản lƣợng lạc, Trung Quốc là nƣớc đứng đầu
với 16,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ với 5,78 triệu tấn và Việt Nam là nƣớc đứng
thứ 12 với sản lƣợng 0,47 triệu tấn. Trung Quốc có giá trị sản xuất lạc lớn nhất thế

7
giới đạt gần 7,39 triệu đô la Mỹ (USD), tiếp theo là Ấn Độ, Mỹ với các chỉ số này
lần lƣợt là 2,45 và 1,33 triệu USD (FAO, 2013).
1.1.2. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam
Sản xuất lạc ở nƣớc ta đƣợc phân bố ở hầu hết các vùng sinh thái nông
nghiệp với diện tích trồng lạc chiếm khoảng 28% tổng diện tích cây công nghiệp
hàng năm (gồm đay, cói, mía, lạc, đậu tƣơng và thuốc lá), tập trung ở các vùng
chủ yếu nhƣ vùng Duyên hải Nam Trung Bộ, vùng Đồng bằng sông Hồng, vùng
Trung du và Miền núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ. Các vùng khác có diện tích
trồng lạc thấp hơn.
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam
(năm 2002 - 2012)
Năm Diện tích
(1.000 ha)
Năng suất
(tấn/ha)
Sản lƣợng
(1.000 tấn)
2002 246,7 1,62 400,4
2003 243,8 1,67 406,2
2004 263,7 1,78 469,0
2005 269,6 1,81 489,3
2006 246,7 1,87 462,5
2007 254,5 2,00 510,0
2008 255,3 2,08 530,2
2009 245,0 2,09 510,9
2010 231,4 2,11 487,2
2011 223,8 2,08 465,9
2012 220,5 2,13 470,6
Nguồn: Tổng cục Thống kê (2013).
Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam (2013) cho thấy, trong vòng
10 năm qua (2002-2012). Mặc dù diện tích giảm từ 246,7 ha (năm 2002) xuống còn
220,5 ha (năm 2012) nhƣng sản xuất lạc ở Việt Nam đã có những bƣớc chuyển biến
tích cực về năng suất từ 1,62 tấn/ha (năm 2002) tăng lên 2,13 tấn/ha (năm 2012) với
sản lƣợng tăng từ 400,4 nghìn tấn (năm 2002) lên 470,6 nghìn tấn (năm 2012). Năm

8
2012, năng suất lạc bình quân cả nƣớc đạt cao nhất là 2,13 tấn/ha. Sản lƣợng lạc của
cả nƣớc đạt cao nhất vào năm 2008 với 530,2 nghìn tấn (Tổng cục Thống kê, 2013).
1.2. Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc
Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng
trồng lạc. Tuy nhiên, bệnh gây hại nghiêm trọng hơn ở những vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới (Denny, 2006; Genin và Denny, 2012). Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc
đƣợc thông báo ở Đông và Đông Nam Á nhƣ Trung Quốc (He, 1986); Philippines,
Thái Lan, Sri Lanka, Papua New Guinea và Ấn Độ (Hayward, 1990). Bệnh cũng
đƣợc thông báo ở một số nƣớc nhƣ Đài Loan, Nhật Bản và Nam Carolina ở Mỹ.
Bệnh cũng đƣợc coi là gây thiệt hại kinh tế quan trọng ở Uganda (Mehan et al.,
1994); ở Indonesia, Thái Lan, Malaysia (Lam và Hamidah, 1995) và Việt Nam
(bảng 1.3).
Bảng 1.3. Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi
khuẩn gây ra ở châu Á
Nƣớc Mức độ giảm năng suất (%) Nguồn tài liệu
Trung Quốc 10 - 100 Tan et al., 1994
Indonesia 5 - 65 Machmud và Rais, 1994
Malaysia 0 - 20 Lam và Hamidah, 1994
Philippines 30 Natural, 1994
Thái Lan >50 Butranu et al., 1994
Việt Nam 5 - 80 Hong et al., 1994
Nguồn: Pande et al. (1998).
Hàng năm ƣớc tính thiệt hại do bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) trên lạc từ
50.000 đến 150.000 tấn (Machmud và Rats, 1994).
Ở Trung Quốc, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở 16 tỉnh, nhƣng gây
hại chủ yếu ở vùng sản xuất lạc miền Trung và miền Nam Trung Quốc, các tỉnh bị
bệnh nặng là Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, An Huy. Tỷ lệ bệnh héo xanh ở
Quảng Đông từ 10% đến 20%, ở những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100%
(Tan et al., 1994).

9
Với điều kiện nóng ẩm của vùng nhiệt đới ở Malaysia, bệnh HXVK gây hại
nghiêm trọng trên nhiều loài cây trồng, trong đó có cây lạc. Trên cây lạc, tỷ lệ cây
nhiễm bệnh trung bình từ 5% đến 20% và là nguyên nhân chính làm diện tích trồng
lạc giảm từ 5.197 ha năm 1980 còn 1.318 ha năm 1986 với sản lƣợng tƣơng ứng từ
19.437 tấn giảm còn 5.000 tấn (Mehan et al., 1986). Kết quả khảo sát năm 1993 cho
thấy bệnh xuất hiện chủ yếu ở các vùng trồng lạc chính của vùng Kelantan và
Terengganu. Tỷ lệ bệnh trên đồng ruộng biến động từ 0% đến 20% (Lam và
Hamidah, 1995). Mức độ thiệt hại của bệnh ở vùng đất thấp có tƣới thƣờng thấp
hơn ở vùng đất cao và khô hạn. Bệnh gây hại chủ yếu ở Nam Sumatra, Tây Java và
Nam Sulawesi. Các vùng thuộc Trung và Đông Java, Bali và Bắc Sulawesi bệnh
nhẹ hơn (Hayward, 1990; Machmud và Hayward, 1993).
Ở Thái Lan, bệnh héo xanh vi khuẩn R. solanacearum gây hại lạc ở nhiều
vùng thuộc miền Nam, miền Trung và các tỉnh phía Bắc. Bệnh gây hại chủ yếu ở
những vùng trồng lạc liên tục nhiều vụ hàng năm trồng trên đất cát và tùy thuộc và
giống, khí hậu, điều kiện canh tác (Butranu et al., 1994).
Ở Việt Nam từ năm 1968, Đặng Thái Thuận và cs. (1968) đã phát hiện, mô tả
bệnh chết ẻo cây lạc, mức độ gây hại của bệnh từ 20% đến 30%. Bệnh héo xanh vi
khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều vùng trồng trong cả nƣớc (Mehan
và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lƣơng Tề, 1997a).
Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1991) cho rằng ở 14 hợp tác xã trồng lạc
thì bệnh HXVK hại nặng nhất ở một số điểm điều tra của tỉnh Nghệ An với tỷ lệ từ
15% đến 40%, trong khi đó ở các điểm điều tra của huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang
tỷ lệ bệnh trung bình chỉ từ 10% đến 15%.
Nguyễn Văn Liễu và cs. (1995) điều tra tình hình bệnh HXVK hại lạc trong
sản xuất ở miền Bắc và xác định hầu hết các giống lạc đang đƣợc trồng phổ biến
trong sản xuất tại thời điểm nghiên cứu là không kháng bệnh HXVK (tỷ lệ cây chết
trung bình trong vụ Xuân là 15% đến 25%, ở những vùng ổ dịch bệnh gây chết từ
90% đến 100%). Theo Nguyễn Văn Liễu (1998), bệnh HXVK có ở hầu khắp các
vùng trồng lạc của miền Bắc, các tỉnh trọng điểm trồng lạc nhƣ Nghệ An, Thanh
Hoá, Bắc Giang là những vùng bị bệnh gây hại từ 10% đến 20%.

10
Theo Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010), bệnh héo xanh vi khuẩn là
một bệnh gây hại phổ biến trên cây lạc vùng Hà Nội và phụ cận. Trong năm 2008-
2009, kết quả điều cho thấy tỷ lệ bệnh HXVK hại lạc cao nhất ở huyện Ý Yên, tỉnh
Nam Định trên giống lạc Sen lai (1,28%) và tỷ lệ bệnh thấp nhất ở huyện Lạng
Giang, tỉnh Bắc Giang trên giống lạc L14 (0,19%).
1.3. Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc
Mehan et al. (1994) đã mô tả triệu chứng bệnh HXVK hại lạc nhƣ sau: triệu
chứng bệnh có thể quan sát rõ trên cây lạc sau khi trồng 2 - 3 tuần. Cây con nhiễm
bệnh nặng, héo chết nhanh. Trên đồng ruộng triệu chứng bệnh thể hiện rõ và nhiều
nhất ở giai đoạn cây bắt đầu ra hoa trở đi. Dấu hiệu đầu tiên của bệnh là một vài lá ở
phía trên tái đi, hơi rủ xuống. Lúc đầu, lá cây héo vào ban ngày và ban đêm lại hồi
phục đƣợc, nhƣng chỉ sau vài ngày cây bị héo nhanh chóng, bộ lá héo rũ xuống
không hồi phục đƣợc. Tiếp theo là cây bị khô, lá có màu xanh nâu, chóp rễ cây bệnh
bị thối nhũn, mầu nâu đen. Cắt gốc thân có thể thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài
lên phía trên. Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt ngang có dịch nhầy trắng sữa chảy ra. Đối
với cây già hơn hoặc những giống ít bị nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn thì quá trình
héo diễn ra từ từ và thƣờng bắt đầu bị bệnh ở cành trên và cuối cùng toàn bộ cây có
thể bị héo và chết. Đôi khi cây bị nhiễm bệnh héo xanh không biểu hiện rõ triệu
chứng. Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là loại bệnh hại mạch dẫn nên triệu chứng
đặc trƣng nhất là mạch dẫn ở thân, cành, rễ bị biến màu nâu sẫm, trong đó chứa đầy
dịch vi khuẩn. Trên cây bệnh lá bị héo rũ, cuối cùng cây héo khô, rễ và quả lạc bị
thối đen (Mehan et al., 1994).
Ở Việt Nam, Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010) nghiên cứu bệnh
héo xanh hại lạc tại vùng Hà Nội và phụ cận cho biết, triệu chứng gây hại chủ yếu
của bệnh trên cây lạc làm lá ngọn héo rũ có mầu xanh tái, mặt lá phía dƣới, các
cành cũng bị héo dần và chết nhanh. Ban đầu lá héo vào ban ngày, ban đêm lại phục
hồi, nhƣng chỉ sau vài ngày cây lạc héo rũ hẳn xuống không phục hồi đƣợc. Cắt gốc
thân thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài lên phía trên. Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt
ngang có dịch nhầy trắng nhƣ sữa chảy ra.

11
1.4. Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc
Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn đƣợc Smith đặt tên
là Bacillus solanacearum. Tiếp theo, vi khuẩn đƣợc đổi tên là Pseudomonas
solanacearum (Smith, 1896). Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn
Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia.
Vi khuẩn P. solanacearum đã đƣợc phân loại lại thành Burkholderia solanacearum
(Yabuuchi et al., 1992). Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng
B. solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi
mới là Ralstonia. Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B. solanacearum đã
đƣợc đổi tên lại là R. solanacearum (Yabuuchi et al., 1995). Sau Hội nghị Quốc tế
lần thứ 2 về vi khuẩn năm 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia
solanacearum. Hiện nay phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là:
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Phylum): Proteobacteria
Lớp (Class): Beta Proteobacteria
Bộ (Order): Burkholderiales
Họ (Family): Ralstoniaceae
Chi (Genus): Ralstonia
Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995;
Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010).
Ngoài ra, vi khuẩn còn có các tên đồng nghĩa khác (synonym) là
Pseudomonas ricini (Archibald) Robbs, 1954; Pseudomonas batatae Cheng và
Faan, 1962 (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010).
Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.), vi khuẩn R. solanacearum còn
gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn R. solanacearum
gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus spp.,
Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var. cicla, Capsicum annuum,
Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus
peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis,

12
Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma
longa, Cynara cardunculus var. scolymus, Emilia sonchifolia sp., Eucalyptus sp.,
Galinsoga parviflora sp., Gossypium sp., Heliconia sp., Heliconia caribaea, Hevea
brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta
arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea
subsp. europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus,
Pogostemon cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis,
Siraitia grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum
melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona
grandis, Urtica dioica, Washingtonia filifera, Zingiber officinale,... (Hayward,
1994; Mehan et al., 1994, Agrios, 2008; Chandrashekara và Prasnnakumar, 2010;
Peng et al., 2012; Wu et al., 2013; Lin et al., 2015). Tuy nhiên, loài vi khuẩn
R. solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hoá hình thành nhiều nòi và biovar khác
hẳn nhau về tính chuyên hoá ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau
ở các vùng địa lý sinh thái.
Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn
R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc. Theo Nguyễn Xuân Hồng và
cs. (1993) vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một
số cây trồng khác. Đỗ Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và
gây hại nghiêm trọng trên cây cà chua, khoai tây, lạc. Đoàn Thị Thanh và cs. (1995)
cho biết vi khuẩn R. solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn
ký sinh và gây hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà. Tác giả còn cho rằng đây là
loài vi khuẩn đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng
thuộc họ cà (Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae). Năm 1977, Lê Lƣơng Tề (1997a)
đã xác định vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và
một số cây trồng khác nhƣ cà chua, khoai tây, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và đay.
1.5. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum
1.5.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo
R. solanacesrum là vi khuẩn hình que, kích thƣớc tế bào 0,5 x 1,5 µm,
nhuộm gram âm. Các mẫu phân lập (isolate) có độc tính cao phần lớn không có

13
lông roi và không di động, ngƣợc lại những isolate có độc tính thấp thƣờng có từ 1
đến 4 lông roi mọc đối nhau, có mức di động cao và đều có các lông roi nhỏ ở rìa
(Mehan et al., 1994; Anitha et al., 2003). Nếu isolate vi khuẩn chuyển sang kiểu
khuẩn lạc nâu, răn reo là isolate vi khuẩn mất tính độc (nhƣợc độc). Để phát hiện
dòng vi khuẩn có tính độc thƣờng dùng môi trƣờng chọn lọc TZCA (tetrazolium
chloride agar). Trên môi trƣờng này isolate vi khuẩn có tính độc sẽ có khuẩn lạc
nhỏ, ở giữa màu hồng, rìa trắng (Kelman, 1954).
Vi khuẩn R. solanacearum có cấu tạo đơn bào. Cấu trúc của tế bào vi khuẩn
gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lƣợng khô của tế bào có tác dụng bảo
vệ và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định. Tế bào gồm chất nguyên sinh, chất này
chứa bào tƣơng, chất nhân (nucleus) và các hạt tròn nhỏ khác nhau trong có chứa chất
dinh dƣỡng dự trữ. Bào tƣơng giàu RNA còn nhân giàu ADN. Bằng kính hiển vi điện
tử có thể phân biệt đƣợc các cấu trúc đại phân tử với đƣờng kính khoảng 200 Ao
(Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome. Các
phân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein. Trong tế bào vi khuẩn
không thể hiện rõ nhân nhƣ trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật,
nhƣng trong bào tƣơng thƣờng có thể phân biệt đƣợc “những nhiễm sắc thể” mà
thƣờng đƣợc xem nhƣ tƣơng ứng với nhân. Tế bào chất nằm trong màng bào tƣơng,
ngoài màng bào tƣơng lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có
hình dạng nhất định. Thức ăn vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao
đổi hình thành trong bào tƣơng cũng qua màng đó mà bị thải ra ngoài (Kinaly và cs.,
1983; Izrainxki, 1988; Mehan et al., 1994).
1.5.2. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum
Vi khuẩn R. solanacearum là vi khuẩn háo khí, không hình thành bào tử và
nhuộm gram âm. Vi khuẩn này có khả năng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate nhƣ là
nguồn các bon dự trữ. Vi khuẩn R. solanacearum không hóa lỏng gelatin, không thủy
phân tinh bột, không có khả năng tạo indol và không sử dụng arginin. Tuy nhiên, loài
vi khuẩn này có khả năng tạo ra H2S, khử nitrat, có khả năng thủy phân Tween 80,
phản ứng dƣơng tính Le-van, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidase và
catalase, urê, pectin, ôxi hóa acetat, malonate và gluconate. Vi khuẩn R. solanacearum

14
chịu đựng kém với muối NaCl. Các isolate của vi khuẩn R. solanacearum không thể
phát triển trên môi trƣờng chứa 2% NaCl và bị kìm hãm ở môi trƣờng có 0,5% đến
1,5% NaCl (Hayward, 1964; He et al., 1983; Ryan et al., 2008).
1.5.3. Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum
Vi khuẩn R. solanacearum tồn tại trong đất, trong tàn dƣ thực vật. Nhiều loài
cỏ dại còn là ký chủ phụ của loài vi khuẩn này, là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây
trồng. Vi khuẩn còn tồn tại trong hạt giống. Ở Indonesia và Trung Quốc, hạt lạc thu
từ những cây nhiễm bệnh có thể truyền bệnh cho vụ sau. Vi khuẩn tồn tại trên vỏ
hạt, vỏ lụa và trong phôi hạt (Middleton và Hayward, 1990; Machmud, 1993;
Anitha et al., 2003).
Vi khuẩn R. solanacearum xâm nhập vào cây lạc qua vết thƣơng cơ giới
hoặc qua lỗ mở tự nhiên ở rễ của cây và đƣợc nhân lên nhanh chóng trong mạnh
dẫn làm cho mạnh dẫn trở nên bị tắc nghẽn, vi khuẩn có thể tiếp tục xâm nhập vào
những mô lân cận. Trong quá trình này, vi khuẩn sản sinh ra các hệ men nhƣ
pectinase, cellulose để phân hủy mô, tế bào cây và sinh ra các độc tố làm tắc mạch
dẫn, cản trở vận chuyển nƣớc, nhựa nguyên và nhựa luyện trong cây làm cây bị héo
nhanh chóng. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum có độc tính đƣợc
quyết định bởi hệ gen độc hrp (hypersensitive response and pathogenicity).
Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là bệnh lây lan chủ yếu qua đất. Trong số các
vi khuẩn hại cây trồng thì vi khuẩn R. solanacearum bền vững nhất trong đất. Vi
khuẩn R. solanacearum có thể sống sót trong đất bỏ hóa vài năm thậm chí cả khi
không có cây trồng trên đất đó. Vi khuẩn R. solanacearum có thể qua đông trong đất,
đất bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh ban đầu quan trọng nhất. Vi khuẩn tồn tại lâu trong
đất khi trồng liên tục cây ký chủ nhiễm bệnh hoặc có sự kết hợp với cây ký chủ khác
xen kẽ trên đồng ruộng. Vi khuẩn tồn tại tốt ở đất đủ ẩm, thoáng khí, nhƣng bị kìm
hãm ở đất khô và đất bị ngập nƣớc. Vi khuẩn R. solanacearum lây lan chủ yếu qua
đất nhƣng cũng dễ dàng truyền lan theo nguồn nƣớc, qua mƣa gió và qua những vết
thƣơng cơ giới, qua dụng cụ sản xuất của con ngƣời, cũng có thể qua vết thƣơng ở rễ
do côn trùng và tuyến trùng gây ra (Middleton và Hayward, 1990).

15
1.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh
héo xanh vi khuẩn hại lạc
Sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có liên quan chặt
chẽ với các yếu tố thời tiết khí hậu nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, mƣa, gió, độ pH đất,... Từ lúc
xâm nhiễm tới khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên của bệnh phải trải qua một khoảng
thời gian nhất định. Thời gian đó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh.
Bệnh phát triển mạnh, thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm nhất là ở
nhiệt độ từ 25o
C đến 35o
C nên bệnh gây hại chủ yếu là ở vùng nhiệt đới. Đất có độ
ẩm cao >60% và độ pH 5 - 6,8 thích hợp cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn (Anitha et
al., 2003). Bệnh hại nặng hơn trên đất cát pha, thịt nhẹ, trên ruộng nghèo chất hữu
cơ, độc canh cây ký chủ… Bệnh phát triển kém, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn trên
các ruộng luân canh lạc với lúa nƣớc, các loài cây không phải là ký chủ và trên đất
kiềm hoặc bón vôi.
Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1995) cho rằng bệnh HXVK hại lạc
là một trong những bệnh phổ biến phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt
độ và ẩm độ tƣơng đối cao. Theo Lê Lƣơng Tề (1997b), bệnh HXVK hại lạc thƣờng
phát sinh ở cả hai thời vụ trồng là lạc Xuân và lạc Thu. Trong điều kiện nhiệt độ
tƣơng đối cao, ẩm ƣớt, cây sinh trƣởng kém, đất cát, nhất là trên đất trồng độc canh
cây lạc, bệnh gây hại nặng. Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại
lạc với các yếu tố sinh thái, kỹ thuật, Lê Lƣơng Tề (1997b) cho rằng bệnh có thể phát
sinh ở các giai đoạn sinh trƣởng của cây, cao điểm của bệnh là thời kỳ cây ra hoa đến
quả non, sau đó bệnh giảm ở giai đoạn quả già. Về ảnh hƣởng của phân bón thì vôi và
kali có tác dụng hạn chế tác hại của bệnh, cho năng suất lạc cao hơn so với đối chứng.
Chế độ luân canh có ảnh hƣởng tới sự phát triển của bệnh, chu kỳ luân canh càng dài,
mức độ gây hại của bệnh càng giảm. Ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc
thì tỷ lệ bệnh HXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc Xuân - lạc Thu hoặc
lúa - khoai tây - lạc. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng ở phía bắc Việt Nam,
bệnh HXVK phát sinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sông, còn trên
đất luân canh với lúa nƣớc thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn. Đỗ Tấn Dũng (1999)
nghiên cứu bệnh HXVK hại lạc ở vùng Đông Anh, Hà Nội có nhận xét bệnh phát
sinh và gây hại nặng từ giai đoạn cây lạc ra hoa rộ đến quả non.

16
Nguyễn Văn Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tƣơng quan giữa
bệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc liên tục trên đất gò đồi và đất dốc
miền núi làm gia tăng tích lũy nguồn bệnh và làm tăng tỷ lệ bệnh các năm tiếp theo.
1.5.5. Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh
Trên đồng ruộng có thể xác định bệnh nhanh bằng cách cắt một đoạn thân
ngắn khoảng 3 cm gần gốc thân cây bị bệnh, ngâm vào cốc nƣớc, sau một thời
gian xuất hiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt. Cắt dọc theo
thân cây, dễ dàng nhận thấy mạch dẫn bị chuyển màu thành nâu sẫm hoặc nâu
nhạt (Wang và Hou, 1983). Phƣơng pháp chẩn đoán này cũng đã đƣợc áp dụng tại
Việt Nam (Burgess et al., 2009; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010).
Có nhiều phƣơng pháp để xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo
xanh hại lạc nhƣ phân lập trên môi trƣờng, phƣơng pháp huyết thanh, phƣơng pháp
phân tích PCR (Mehan và Mc. Donald, 1995).
Theo Mehan (1995), môi trƣờng tetrazolium chloride agar (TZCA) phù hợp
để phân lập vi khuẩn R. solanacearum, còn môi trƣờng sucrose peptone agar (SPA)
phù hợp để nhân vi khuẩn R. solanacearum. Trên môi trƣờng TZCA khuẩn lạc vi
khuẩn R. solanacearum tròn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu
phớt hồng, còn trên môi trƣờng SPA, khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum có
hình dạng tròn, nhẵn bóng, màu trắng sữa.
Nhiều công trình nghiên cứu về phƣơng pháp và ứng dụng kỹ thuật PCR
(polymerase chain reaction) trong chẩn đoán bệnh trên cây trồng và các ứng dụng
khác trong bệnh học thực vật đã đƣợc công bố. Phƣơng pháp PCR có nhiều lợi thế
hơn hẳn so với các phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống nhờ có độ nhạy cao, tốc độ
nhanh. Bằng phƣơng pháp ứng dụng PCR, chỉ một vài giờ, từ một đoạn ADN ban
đầu và đoạn mồi có thể nhân lên hàng trăm triệu lần sau đó đi sâu phân tích kiểu
gen, xác định, nhận biết một cách chính xác nòi, biovar vi khuẩn R. solanacearum ở
trong mẫu cây bệnh cũng nhƣ trong đất nhiễm bệnh.
Theo kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệm tham gia mạng lƣới
nghiên cứu vi khuẩn héo xanh ở các nƣớc và vùng lãnh thổ châu Á, Thái Bình
Dƣơng nhƣ: Australasia, Đài Loan, Philippines,… thì sản phẩm PCR của các mẫu

17
phân lập thuộc loài R. solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có kích thƣớc
không đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) và chỉ có các isolate cho sản phẩm PCR có
kích thƣớc nhƣ vậy mới có tính độc (Opina et al., 1997).
1.6. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc
1.6.1. Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum
Trong hơn 40 năm qua, nhiều tác giả sử dụng khái niệm nòi và biovar để
phân biệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum. Biovar của vi khuẩn
R. solanacearum đƣợc xác định dựa trên khả năng chuyển hóa cácbon hydrat, cụ thể
là khả năng ô xy hóa 3 đƣờng đôi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rƣợu Hexo -
cacbon (dulcitol, manitol, sorbitol) (Hayward, 1964; He et al., 1983). Hiện nay, 5
biovar của vi khuẩn R. solanacearum đã đƣợc ghi nhận bao gồm:
- Biovar 1: không ô xy hóa cácbon hydrat.
- Biovar 2: ô xy hóa đƣờng nhƣng không ô xy hóa rƣợu.
- Biovar 3: ô xy hóa tất cả các bon hydrat.
- Biovar 4: chỉ ô xy hóa rƣợu.
- Biovar 5: ô xy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhƣng không
ô xy hóa sorbitol, dulcitol.
Các mẫu R. solanacearum thuộc biovar 2 phân lập từ vùng Amazon (châu
Mỹ) có đặc tính sinh hóa khá khác biệt (dựa trên khả năng sử dụng đƣờng ribose và
đƣờng trehalose). Nhóm này đƣợc đặt tên là biovar 2-T (hoặc N2) còn biovar 2 gốc
đƣợc đổi thành biovar 2-A (Hayward, 1995b).
Biovar 1, biovar 3 và biovar 4 gây hại cho lạc còn biovar 2 và biovar 5 không
gây bệnh cho lạc. Biovar 1 gây bệnh trên lạc ở Mỹ, còn hầu hết các isolate gây bệnh
trên cây lạc ở các nƣớc châu Á, châu Phi chủ yếu là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1.
Theo Wu et al. (2013), 11 isolate của vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ các tỉnh
khác nhau của Trung Quốc thuộc biovar 3.
Buddenhahem và Kelman (1964), Hayward (1964), He et al. (1983) đã phân
chia các isolate vi khuẩn R. solanacearum thành 5 nòi (race) dựa trên phổ ký chủ.
Năm nòi của R. solanacearum gồm:

18
Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà
(Solanaceae) và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân bố chủ yếu ở vùng đất
thấp của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nòi 1 gồm biovar 1, biovar 3 và biovar 4.
Nòi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và
Nam Mỹ gồm biovar 2 và biovar 3.
Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua
và đƣợc tìm thấy ở vùng ôn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao. Nòi 3 chỉ
có biovar 2.
Nòi 4 (race 4): Gây hại trên gừng, tìm thấy chủ yếu ở Philippines. Nòi 4 chỉ
có biovar 4.
Nòi 5 (race 5): Gây hại trên cây dâu tằm, lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở
Trung Quốc. Nòi 5 chỉ có biovar 5.
Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn
R. solanacearum phân lập đƣợc kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc và một
số cây ký chủ khác, các mẫu phân lập đƣợc đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4.
Đỗ Tấn Dũng (1999) cho rằng, tác nhân gây ra bệnh HXVK trên cây cà chua,
cà pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do loài vi khuẩn R. solanacearum Smith,
thuộc nòi 1, biovar 3. Các isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ các cây ký
chủ đều có khả năng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnh khác nhau, điều đó
thể hiện tính độc, tính gây bệnh giữa các isolate vi khuẩn cũng khác nhau.
Phân tích các mẫu bệnh HXVK thu thập từ một số vùng trồng lạc, Nguyễn
Thị Yến và cs. (2002) cũng xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh
hại lạc là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (2002) đã cho
biết trồng lạc ở đất đồi gò, đất bãi ven sông thƣờng bị bệnh héo xanh gây hại nặng
và cũng đã xác định đƣợc biovar 3 và biovar 4 gây hại trên lạc ở Việt Nam.
1.6.2. Chủng
Cho tới nay, không có một định nghĩa chính thức về chủng (strain) của vi
khuẩn R. solanacearum. Các tác giả trên thế giới thƣờng sử dụng thuật ngữ chủng
để chỉ các mẫu vi khuẩn R. solanacearum khác nhau về bất cứ đặc điểm nào nhƣ
nguồn gốc phân lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền.

19
Chủng của vi khuẩn R. solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ,
phân bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn
(Buddenhagen và Kelman, 1964). Bên cạnh phƣơng pháp truyền thống xác định nòi
dựa vào phạm vi ký chủ và xác định biovar dựa vào phản ứng sinh hóa, nhờ thành
tựu của sinh học phân tử, ngày nay phân tích ADN trở thành phƣơng pháp chính
xác và phù hợp để xác định chủng nhiều loại ký sinh. Bên cạnh phƣơng pháp truyền
thống xác định nòi và biovar, Hayward (1990) cho biết, bằng phân tích ADN qua
phƣơng pháp RFLP đã xác định vi khuẩn R. solanacearum gây hại lạc gồm 2 nhóm
chính là nhóm I và nhóm II.
Nguyễn Văn Tuất và cs. (2007) đã phân tích tính đa hình của 25 isolate vi
khuẩn với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và
phân chia thành 2 nhóm gồm nhóm I và nhóm II.
1.6.3. Loài phức
Khi phân tích đa dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh, Gillings và Fahy (1993)
đã nhận thấy vi khuẩn R. solanacearum rất đa dạng và gợi ý rằng vi khuẩn này có lẽ
là một loài phức (complex species). Theo Fegan và Prior (2005) “loài phức” là một
tập hợp các cá thể có quan hệ gần gũi nhƣng thuộc các loài khác nhau. Các nghiên
cứu đa dạng vi khuẩn dựa trên lai ADN cho thấy vi khuẩn héo xanh cực kỳ đa dạng
với mức độ tƣơng đồng ADN của các mẫu vi khuẩn thƣờng < 70% (là ngƣỡng
thƣờng đƣợc sử dụng để phân biệt vi khuẩn ở mức loài). Hiện nay, vi khuẩn
R. solanacearum chính thức đƣợc xem là một loài phức (Meng, 2013).
1.6.4. Kiểu gây bệnh
Các chủng vi khuẩn héo xanh còn đƣợc phân biệt thành các kiểu gây bệnh
(pathotype) dựa trên phản ứng đối với một loại cây trồng nào đó. Theo Tan et al.
(1994), 36 mẫu vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ 6 tỉnh của Trung Quốc đã
đƣợc xếp thành 7 kiểu gây bệnh khác nhau cụ thể dựa trên độc tính của chúng đối
với 6 giống lạc chỉ thị (Xiekangking, Taishan sanlirou, Huangchuan zhigan, Lukang
qing, Fuhua Sheng, Ehua 1).
1.6.5. Kiểu quan hệ phả hệ
Gần đây, một hệ thống phân loại nữa gọi là kiểu quan hệ phả hệ (phylotype)

20
đã đƣợc áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R. solanacearum. Cách phân loại
này dựa trên phân tích trình tự các gen mã hóa nhƣ gen 16S RNA ribosome, gen
egl, gen hrpB, và gen mutS (Poussier et al., 2000; Allen et al., 2005; Prior và Fegan,
2005). Có 4 phylotype (Denny, 2006) đã đƣợc ghi nhận và phân tích cho thấy các
phylotype tƣơng quan với nguồn gốc địa lý của các chủng: phylotype I gồm các
chủng chủ yếu từ châu Á, phylotype II từ châu Mỹ, phylotype III từ châu Phi và các
đảo thuộc Ấn Độ Dƣơng và phylotype IV từ Indonesia (Remenant et al., 2011).
Nhìn chung, phylotype là hệ thống phân loại rất ổn định và có ý nghĩa về mặt tiến
hóa đối với phức hợp loài vi khuẩn R. solanacearum (Meng, 2013).
1.7. Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc
1.7.1. Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh
Trên thế giới, từ năm 1910 biện pháp dùng giống kháng bệnh HXVK đã đƣợc
biết đến trên cây lạc. Việc chọn tạo và đƣa vào ứng dụng giống lạc Schwarz 21 kháng
bệnh HXVK tại Indonesia năm 1927 và sau đó giống này trở thành vật liệu khởi đầu
cho chọn giống lạc kháng bệnh nhƣ Gajah, Pelanduk, Tupai (Middleton và Hayward,
1990). Ở Trung Quốc cũng đã tạo đƣợc những giống lạc kháng bệnh HXVK cho
năng suất cao và chất lƣợng tốt nhƣ Luhua 3, Guiyou 28, Zhong Hua 2, Yue You 92,
Jinyou 3121. Những giống lạc kháng R. solanacearum thƣờng tỷ lệ nhiễm bệnh
trong khoảng 10%, trong khi đó ở những giống nhiễm bệnh thì ở cùng điều kiện tỷ lệ
nhiễm bệnh lên đến 90% (Mehan et al., 1994). Ở Uganda, Busolo-Bulafu et al.
(1993) đã nghiên cứu đánh giá chọn lọc nhiều giống lạc và đã tìm ra đƣợc một số
giống lạc kháng bệnh HXVK đƣa vào thực tế sản xuất nhƣ Igola-1, AT474/3/5/3.
Chƣơng trình chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã rất đƣợc chú ý ở
Trung Quốc. Những giống lạc vừa có tính kháng bệnh HXVK vừa có khả năng cho
năng suất cao đã đƣợc đƣa vào sản xuất có vai trò hết sức quan trọng trong việc
kiểm soát bệnh và tăng sản lƣợng lạc ở những vùng nhiễm bệnh HXVK (Mehan et
al., 1986). Cuối những năm 1960 đã có một số lƣợng giống lạc kháng bệnh HXVK
đáng kể đƣợc đƣa vào sản xuất (Mehan et al., 1994).
Việc xác định nguồn gen kháng bệnh HXVK luôn đƣợc coi là một hƣớng ƣu
tiên và đƣợc xúc tiến ngay từ những giai đoạn nghiên cứu đầu tiên về bệnh HXVK ở

21
nhiều quốc gia (Mehan et al., 1994). Một số nƣớc nhƣ Uganda, Mỹ, Thái lan,
Malaysia, Philippines, Sri Lanka cũng luôn coi việc sử dụng giống chống bệnh là
biện pháp chính và quan tâm nhất trong chƣơng trình kiểm soát bệnh HXVK (Mehan
et al., 1994). Từ đó cho thấy sử dụng giống khánh bệnh luôn là hƣớng ƣu tiên hàng
đầu trong chiến lƣợc phòng chống bệnh HXVK ở hầu hết các nƣớc mà có bệnh
HXVK gây hại.
Trong các thập kỷ 1960 - 1980 việc sàng lọc giống lạc kháng bệnh HXVK
tiếp tục đƣợc thực hiện và đã xác định đƣợc nhiều dòng có tính kháng nhƣ:
PI 341884, PI 341885, PI 341886, R12, 708, ICGS 5313, ICGS 7968. Với sự hợp tác
của ICRISAT, nhiều giống và dòng lạc đƣợc nhập từ ICRISAT đƣợc tiếp tục đánh
giá tính kháng ở Uganda (Busolo-Bulafu et al., 1993).
Ở Việt Nam, công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã đƣợc nghiên
cứu thành công và ứng dụng trong sản xuất. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1993) đã
chọn đƣợc một số giống lạc kháng bệnh HXVK nhƣ giống KPS17, đặc biệt là giống
MD7 có tính kháng bệnh HXVK cao, đƣợc đƣa vào khảo nghiệm diện rộng và sản
xuất tại một số vùng sinh thái. Theo Nguyễn Văn Liễu và cs. (1998) giống lạc Gié
Nho Quan là giống có mức kháng bệnh HXVK cao nhất trong tập đoàn (tỷ lệ cây
sống sót trong vƣờn nhiễm trung bình là 94,9 ± 1,9%). Phổ kháng bệnh của giống
này rộng với nhiều nguồn bệnh ở các vùng sinh thái khác nhau thuộc miền Bắc và
ổn định qua nhiều vụ, nhiều năm. Hầu hết các giống trong bộ giống lạc kháng bệnh
HXVK quốc tế đều biểu hiện ở mức kháng và kháng cao trong điều kiện miền Bắc
Việt Nam. Giống MD7 đã đƣợc công nhận là giống chính thức và phát triển ở nhiều
tỉnh trồng lạc trọng điểm (Nguyễn Xuân Hồng và cs., 2002). Theo kết quả nghiên
cứu của Nguyễn Văn Tuất và cs. (2007), trong số 94 mẫu giống lạc tham gia đánh giá
chỉ có 5 mẫu lạc kháng cao và kháng trung bình, còn lại các giống đều bị nhiễm. Kết
quả nghiên cứu này khẳng định đƣợc rằng tỷ lệ các mẫu giống lạc kháng bệnh HXVK
là rất ít. Do vậy công tác nghiên cứu, xác định nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác
chọn tạo giống lạc kháng bệnh là cần thiết và đòi hỏi nhiều công sức. Nguyễn Thị
Vân và cs. (2013) đã chọn tạo thành công giống lạc TK10 kháng bệnh HXVK và đã
phát triển ở nhiều vùng sản xuất đem lại hiệu quả kinh tế cao.

22
1.7.2. Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác
1.7.2.1. Biện pháp canh tác
Trên thế giới, phòng chống bệnh bằng biện pháp luân canh cây trồng để làm
giảm thiệt hại của bệnh HXVK là biện pháp đã đƣợc Smith đƣa ra lần đầu vào năm
1896, sau đó đã có nhiều công bố về vấn đề này. Những công bố đó đã chỉ ra rằng:
nhiều loại cây không phải là ký chủ khi luân canh với cây lạc hoặc các cây họ cà có
thể làm giảm đáng kể tỷ lệ và mức độ gây hại của bệnh. Việc luân canh lạc với lúa
nƣớc đƣợc ứng dụng rộng rãi ở những vùng có tƣới nƣớc thuộc miền Nam Trung
Quốc, nơi mà bệnh HXVK gây hại nặng. Công thức luân canh này cũng phù hợp với
những vùng đất có tƣới hoặc những vùng có lƣợng mƣa lớn thuộc Nam và Đông Nam
Á (Mehan et al., 1994). Ở những vùng đất khô hạn, theo Tan et al. (1994) thì luân
canh lạc với ngô hoặc cao lƣơng với chu kỳ từ 4 đến 5 năm hoặc với mía từ 2 đến 5
năm cũng làm giảm đáng kể thiệt hại do bệnh HXVK gây ra. Đặc biệt biện pháp luân
canh lạc với ngô là có tính khả thi ở nhiều vùng bị bệnh HXVK gây hại nặng thuộc
một số nƣớc ở Đông Nam Á. Việc luân canh lạc với cây không phải là ký chủ nhƣ
ngô, lúa, mía là một biện pháp hữu hiệu để kiểm soát bệnh (Mehan et al., 1994).
Luân canh cây trồng không phải là ký chủ của vi khuẩn héo xanh hại lạc là
một trong những giải pháp quan trọng giúp giảm mật độ vi khuẩn trong đất và hạn
chế tối đa nguồn bệnh từ các tàn dƣ thực vật vụ trƣớc. He (1990) cho rằng ngâm
ruộng 15 ngày đến 30 ngày trƣớc trồng lạc hoặc luân canh với cây lúa nƣớc từ 2 đến
4 năm có tác dụng giảm tỷ lệ nhiễm bệnh của lạc. Ở các công thức luân canh khác
nhau, hiệu quả phòng chống bệnh HXVK cũng khác nhau (Machmud, 1993). Đối với
các vùng đất cao, khó khăn trong việc trồng lúa nƣớc và có tƣới nƣớc nói chung thì
luân canh với cây lúa mì, đại mạch, tiểu mạch, ngô trong chu kỳ từ 4 năm 5 năm cũng
có tác dụng giảm tỷ lệ bệnh (Wang và Hou, 1983; Mehan et al., 1994). Trên đất sét,
bón vôi kết hợp với phân hữu cơ cũng có hiệu lực phòng bệnh nhƣng không ổn định.
Xử lý và cải tạo đất bằng việc bón tăng cƣờng phân chuồng, lƣu huỳnh,
canxi cũng đem lại những kết quả khác biệt nhau (Kelman et al., 1994). Tuy nhiên,
một số tác giả cho rằng việc bổ sung các chất hữu cơ và vô cơ trên đã làm tăng sức
đề kháng của cây do vi khuẩn R. solanacearum rất mẫn cảm với điều kiện khô, vì

23
vậy việc cày ải đất cũng có tác dụng làm giảm bệnh HXVK rất rõ, hơn nữa việc cày
ải còn làm hạn chế sự phát triển của cỏ dại, vì cỏ dại cũng rất có thể là ký chủ của vi
khuẩn héo xanh hại lạc (Mehan et al., 1994).
1.7.2.2. Biện pháp sinh học
Biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK chủ yếu sử dụng các chế phẩm
vi sinh vật đối kháng. Nhiều loại vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo
xanh hại lạc nhƣ Pseudomonas cepacia, Ps. fluorescens, Bacillus polymyxa,
B. subtilis, v.v.,…(Nawangsih et al., 2012; Wang và Liang, 2014). Tại Indonesia,
Nawangsih et al. (2012) sử dụng các chế phẩm Pseudomonas fluorescens RH4003
và Bacillus subtilis AB89, Bacillus sp. KS2 có hiệu quả cao trong phòng chống
bệnh vi khuẩn héo xanh hại lạc.
Ở Việt Nam, đối với biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK hại lạc,
Nguyễn Thu Hà và cs. (2006) đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Bacillus
sp. nhằm hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn và nâng cao năng suất đối với cây lạc. Lê
Nhƣ Kiểu và cs. (2010) đã xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật
(VSV) phòng chống bệnh HXVK hại lạc qui mô phòng thí nghiệm. Mức độ sống
sót và hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm duy trì sự ổn
định sau 3 tháng bảo quản. Tác giả đã sử dụng chủng vi sinh vật để sản xuất chế
phẩm vi sinh vật cho lạc gồm Ps1 (Pseudomonas fluorescens), TS6 (Pseudomonas sp.),
BK1 (Bacillus sp.), Ba5.1 (Bacillus subtilis) và T15 (Bacillus megaterium).
1.7.2.3. Biện pháp hóa học
Biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vật đƣợc cho là ít có hiệu quả trong phòng
chống vi khuẩn R. solanacearum do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm
gây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch của cây. Xử lý đất bằng các loại thuốc
xông hơi ít có tác dụng hạn chế bệnh.
Wang và Hou (1983) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho
lạc đã đƣợc tiến hành từ những năm 1960. Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin
liều lƣợng 300 kg/ha xử lý đất trƣớc khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt. Một số
thuốc khác nhƣ Thiabendazol (C5H6N6S2) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhƣng
do thuốc này có độ độc cấp tính cao với con ngƣời và gia súc nên chƣa thể áp dụng

24
vào sản xuất (Tan et al., 1994). Nhiều tác giả khác cũng công bố kết quả góp phần
chứng minh luận điểm dùng hóa chất phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả thấp.
Dùng thuốc kháng sinh đƣợc coi là biện pháp hạn chế bệnh HXVK có triển
vọng, thay thế thuốc hóa học do thuốc kháng sinh đƣợc hấp phụ tốt, chuyển dịch trong
mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng. Tuy nhiên, dùng thuốc kháng sinh dễ tạo ra các
chủng vi khuẩn mới kháng thuốc. Hơn nữa thuốc kháng sinh có giá thành cao cũng là
một trở ngại cho việc ứng dụng rộng rãi. Theo Kiraly và cs. (1983) thì dùng
streptomycine với liều lƣợng từ 200 đến 400 mg/lít đã kìm hãm sự sinh trƣởng và sinh
sản của vi khuẩn, tuy nhiên nếu dùng streptomycine không cẩn thận có thể gây ra sự
phát triển của những chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng thuốc ở ngƣời và kết quả là
rất nguy hiểm nếu dùng rau quả tƣơi có sử dụng streptomycine để phòng chống bệnh.
Hartman và Elphinstone (1994) cũng đã nghiên cứu việc xử lý đất bằng một số
loại muối nhƣ KNO3, NaNO3, NaCl và KCl với nồng độ 1% cũng thấy mật độ vi
khuẩn R. solanacearum ở trong đất giảm đáng kể tới mức không thể phân lập đƣợc
nữa ở 4 đến 25 ngày sau xử lý, tùy loại muối. Nhƣ vậy, cho tới nay việc dùng hóa
chất để kiểm soát bệnh HXVK là chƣa có tính khả thi trong điều kiện sản xuất đại trà.
1.7.2.4. Biện pháp quản lý tổng hợp
Để kiểm soát và phòng chống bệnh HXVK, yếu tố quan trọng là sử dụng
giống sạch bệnh, dùng giống chống chịu với bệnh HXVK, luân canh với những cây
trồng không phải là ký chủ của bệnh, áp dụng những biện pháp canh tác tốt (vệ sinh
đồng ruộng và cây trồng, quản lý giun đất, loại bỏ thân cây bị bệnh, làm cỏ, khử
trùng nông cụ, không tƣới nƣớc bị ô nhiễm, cày ải phơi nắng đất,…). Hạn chế làm
đất sau khi trồng (việc làm đất chỉ tại thời điểm trồng để tránh gây tổn thƣơng đến
rễ cây). Việc làm cỏ cũng nên làm bằng tay để tránh tổn thƣơng đến cây trồng. Áp
dụng biện pháp kiểm dịch: Khi bệnh HXVK đã xuất hiện, việc kiểm dịch cần phải
đƣợc áp dụng triệt để tránh sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh héo xanh ra các vùng
khác chƣa nhiễm bệnh. Vì vậy biện pháp quản lý tổng hợp mới thành công trong
việc giảm sự lây lan và phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả.

25
1.8. Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn
lọc giống kháng bệnh
1.8.1. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống kháng bệnh
Trong thời gian gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cũng
nhƣ trong việc sàng lọc giống kháng bệnh và tính chống chịu đƣợc đặc biệt quan
tâm. Xác định đƣợc chỉ thị ADN liên kết chặt với tính trạng nào đó thì có thể sử
dụng cho chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (marker assisted selection-MAS).
Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình. Chỉ thị phân tử
đƣợc chia làm hai loại chính: (1) Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP);
(2) Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR (RAPD, AFLP…).
1.8.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Ở loài A. hypogaea, sự khác biệt ở mức độ phân tử đã đƣợc phát hiện bằng
kỹ thuật RFLP (Kochert et al., 1991; Halward et al., 1991). Kochert et al. (1991) đã
chỉ ra không có sự khác biệt giữa A. hypogaea và A. monticola. Tuy nhiên, một sự
khác biệt đáng kể giữa các loài Arachis đã đƣợc ghi nhận.
Để chọn giống có hiệu quả, cần phải nghiên cứu mối liên kết giữa tính trạng
mong muốn với một lƣợng lớn chỉ thị để đánh giá quần thể với nhiều tính trạng
nhƣ: năng suất, tính kháng, mùi vị... Một bản đồ liên kết với nhiều chỉ thị, đặc biệt
là đƣợc lập với một số lƣợng lớn chỉ thị (mức độ bão hòa) có thể đƣợc sử dụng để
phân lập các gen quan tâm. Bằng phân tích quần thể F2, một bản đồ RFLP đã đƣợc
lập ở lạc của cặp lai nhị bội (2n = 2x = 20) giữa A. stenosperma Krapov. và W.C.
Gregory và A. cardenasii Krapov và W.C. Gregory. Bản đồ có chiều dài 1.063 cM
với 117 chỉ thị trong 11 nhóm liên kết, 15 chỉ thị không liên kết cũng đã đƣợc thông
báo (Halward et al., 1993).
Bản đồ di truyền thứ 2 trên cơ sở chỉ thị RFLP đƣợc lập bởi Burow et al.,
(2001) của cặp lai tứ bội Florunner x 4x [A. batizocoi Krapov và W.C. Gregory
(A. cardenasii x A. diogoi Hoehne)]. Phần lớn trong 380 chỉ thị RFLP đƣợc lập bản
đồ có tính di truyền bởi nhiều cặp nhiễm sắc thể, với một số trƣờng hợp ngoại lệ một
nhóm liên kết có thể ở trên nhiều nhiễm sắc thể.

26
Kỹ thuật RFLP cũng đƣợc sử dụng để phân tích đa dạng giữa các giống thuộc
loài Arachis (giống đại diện sẽ đƣợc sử dụng để lai với A. hypogaea) và tạo nên các
nhóm bằng việc sử dụng các phân tích đa chiều tƣơng ứng chặt chẽ với các nhóm
hình thái. Thể tứ bội đƣợc tách biệt rõ ràng với thể nhị bội (Kochert et al., 1991).
Stalker et al. (1995) đã sử dụng kỹ thuật RFLP trong nghiên cứu đa dạng di
truyền giữa 18 dòng của loài A. duranensis Krapov và W.C. Gregory và đã phát
hiện một lƣợng lớn khác biệt giữa các dòng trong loài này, sự khác biệt giữa các
mẫu trong dòng cũng đƣợc xác định bằng RFLP. Kochert et al. (1991) kết luận
rằng, giống lạc trồng trọt là kết quả lai giữa A. duranensis và A. ipaensis Krapov và
W.C. Gregory, phân tích lục lạp cũng chỉ ra rằng A. duranensis đóng vai trò là mẹ
trong cặp lai.
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các
alen của cùng một locut gen. Do vậy có thể phân biệt đƣợc các cá thể đồng hợp tử
(AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ƣu việt của loại chỉ thị
RFLP. Hạn chế của phƣơng pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lƣợng
công việc cồng kềnh. Đặc biệt là tiêu hao một lƣợng lớn ADN mà số lƣợng đa hình
thu đƣợc rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận đƣợc đa hình.
1.8.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR
Phản ứng PCR dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN nhờ enzym ADN
polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, mồi
(primer), các nucleotide (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+
hoạt
động nhƣ một chất xúc tác. Tùy theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có
những hệ thống chỉ thị đặc trƣng.
a) Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Chỉ thị RAPD đƣợc tạo ra do sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên
(random primer) dài khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ bắt mồi thấp. Sản phẩm của
phản ứng đƣợc phân tích bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium
bromide và quan sát dƣới đèn cực tím. RAPD là chỉ thị trội do không phân biệt
đƣợc thể dị hợp tử. Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP.
Lợi thế của chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (Rohlf, 2000).

27
Trên cơ sở kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị RAPD, nghiên cứu của Halward et al.
(1993) cho thấy sự khác nhau rất ít ở loài A. hypogaea. Chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử
dụng để xác định các giống và dòng trong chi Arachis. Các chỉ thị RAPD sử dụng
trong nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt di truyền lớn giữa các giống thuộc loài
Arachis (Halward et al., 1991; Subramanian et al., 2000; Mondal et al., 2007; Vyas
et al., 2014; Vadodariyagopal et al., 2014).
Chỉ thị RAPD có một hạn chế nữa là độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào
điều kiện của phản ứng, đặc biệt đối với những sinh vật có hệ gen lớn. Garcia (1995)
sử dụng kỹ thuật RAPD đã phát hiện ra sự tƣơng đồng giữa chỉ thị RAPD và RFLP.
Nghiên cứu cho thấy, trong mỗi thế hệ tự phối đã phát hiện số lƣợng của các chỉ thị
phân tử biến mất do sự giảm phân bất thƣờng và kết quả của sự mất gen ngẫu nhiên.
Tuy nhiên, trong quần thể tam bội đƣợc tạo ra bởi tự phối lục bội, có thêm gen của
loài A. cardenasii vào bộ gen của loài A. hypogaea ở 10 trong 11 nhóm liên kết trên
bản đồ phân tử nhị bội. Điều đó chỉ ra rằng, sự thêm gen có thể xảy ra từ các dạng nhị
bội đến các dạng trồng trọt và bộ gen của loài A. hypogaea rất giống nhau.
b) Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Simple Sequence Repeat-SSR)
Đối với cây lạc, SSR là một chỉ thị đƣợc ƣa thích trong việc lập bản đồ liên
kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chƣơng trình chọn giống. SSR còn gọi
là vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp
lại gồm từ 2 đến 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn. Bản chất đa hình của vi vệ tinh
là do sự khác biệt về số lần lặp của các đơn vị lặp. Sự đa hình của các locut vi vệ
tinh đƣợc xác định bằng phản ứng PCR dùng 2 mồi đƣợc thiết kế trên trình tự bản
thực ở 2 đầu của vùng lặp. Chỉ thị vi vệ tinh là chỉ thị có nhiều ƣu điểm vì nó là chỉ
thị đồng trội và mức độ đa dạng của quần thể có thể đƣợc xác định khi dùng nhiều
chỉ thị vi vệ tinh phân bố trên toàn bộ bộ gen. Những chuỗi đa hình đơn giản này đã
đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tƣợng động vật và thực vật
(Perrier và Colette, 2006).
Hopkins et al. (1999) đã ghi nhận 6 chỉ thị SSR đa hình ở A. hypogaea với số
alen ở mỗi chỉ thị dao động từ 2 đến 14 alen. Sự khác biệt giữa 15 trong số 19 giống
lạc đã đƣợc ghi nhận.

28
Chỉ thị SSR đƣợc sử dụng có hiệu quả trong việc xác định sự đa dạng di
truyền của các loài lạc trồng trọt đã đƣợc công bố (Hopkins et al., 1999;. Ferguson
et al., 2004;. Mace et al., 2006).
Bản đồ liên kết di truyền với các chỉ thị SSR đã đƣợc xây dựng cho bộ đôi lặp
lại AA trong bộ gen (Moretzsohn et al., 2004), BB (Moretzsohn et al., 2005, 2013), bộ
bốn AABB (Li et al., 2004; Varshney et al., 2005, 2009; Hong et al., 2008, 2010).
Gần đây, có nhiều nghiên cứu về cơ sở di truyền có tính chuyên sâu để phát
triển chỉ thị SSR cung cấp các công cụ di truyền phục vụ cho nghiên cứu tổng thể
giống lạc, các chỉ thị SSR đang đƣợc tập trung nghiên cứu, đã có hàng trăm chỉ thị
SSR đa hình đã đƣợc nhận biết ở loài lƣỡng bội Arachis đƣợc công bố (Gimenes et
al., 2007; Guo et al., 2009; Varshney et al., 2009; Hong et al., 2010; Gautami et al.,
2009; Ravi et al., 2011; Mondal và Badigannavar, 2010; Qin et al., 2012; Sujay et al.,
2012; Shirasawa et al., 2012).
1.8.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại
lạc và chọn lọc giống kháng bệnh
Kết quả nghiên cứu và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lạc
kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trên thế giới còn hạn chế so với một số cây
trồng khác. Trên cây lạc, chỉ thị RAPD đƣợc ứng dụng để đánh giá đa dạng di
truyền đối với một số bệnh hại lạc, trong đó có bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc. Các
kết quả nghiên cứu cho thấy, chỉ thị RAPD có mức đa hình thấp giữa các giống lạc
nghiên cứu (Subramanian et al., 2000;. Dwivedi et al., 2003; Mondal et al., 2007;
Kumari et al., 2009). Tuy nhiên, ứng dụng chỉ thị RAPD cho kết quả tốt trong việc
nghiên cứu đa hình của các giống lạc kháng tuyến trùng và kháng bệnh rỉ sắt gây
hại trên cây lạc (Mondal et al., 2007; Mondal và Badigannavar, 2010).
Bera et al. (2014) đã sử dụng 10 mồi RAPD để phân tích đa hình ADN của
34 mẫu giống lạc nghiên cứu tại Ấn Độ. Đối với mồi RAPD, số phân đoạn ADN tạo
đƣợc trên bản gel điện di từ 11-18 phân đoạn với kích thƣớc từ 500-1.500 bp. Trong
đó, mồi OPT6 tạo ra số phân đoạn nhiều nhất (18 phân đoạn) và mồi OPT5 tạo ra số
phân đoạn ít nhất (11 phân đoạn). Mức độ đa hình của các mẫu giống lạc đánh giá
từ 72,7% đến 100%.

29
Đối với cây lạc, SSR là một công cụ về di truyền phù hợp trong việc lập bản
đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chƣơng trình chọn giống. Các chỉ
thị phân tử đối với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc đã đƣợc một nhóm các
nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu bằng các chỉ thị SSR cũng nhƣ về biểu hiện
gen liên quan đến bệnh héo xanh vi khuẩn. Việc nhận biết các dòng, giống lạc kháng
bệnh héo xanh vi khuẩn thuyết phục nhất là đánh giá phản ứng của các dòng, giống
khi lây nhiễm với vi khuẩn gây bệnh, theo dõi vật liệu lây nhiễm qua một số vụ.
Theo Tang et al. (2007), sử dụng 34 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền
của 24 giống lạc trồng (Arachis hypogaea L.) đã cho thấy có 10 đến 16 chỉ thị SSR
cho đa hình. Mức độ khác biệt di truyền của các giống lạc cao, biểu đồ quan hệ di
truyền cho thấy hình thành 4 cụm khác nhau của các giống lạc nghiên cứu.
Các dòng lạc kháng bệnh đƣợc xác định thông qua việc sàng lọc trên đồng
ruộng khi lây nhiễm với vi khuẩn gây bệnh. Với 33 chỉ thị phân tử SSR đánh giá
trên 46 kiểu gen đƣợc chọn lọc đã phát hiện ra 107 alen, trong đó có 101 alen đa
hình (chiếm 99,4%). Tỷ lệ đa hình alen dao động từ 0,103 đến 6,669 với giá trị
trung bình là 0,386. Phân tích cây phả hệ cho thấy 2 nhóm riêng biệt trong nguồn
gen kháng bệnh phổ biến, tƣơng ứng với 2 phân loài hypogaea và fastigiata của loài
A. hypogaea. Tuy nhiên, những dòng của 2 loài phụ gồm peruviana và aequatoriana
nằm cùng nhóm với những dòng của phân loài hypogaea, mà không nằm cùng với
những dòng khác thuộc phân loài fastigiata. Ngoài ra, phân tích sự thay đổi phân tử
đã ghi nhận đƣợc 15% trong tổng số những thay đổi của nhóm có phản ứng với
bệnh héo xanh vi khuẩn. Điều này hết sức có ý nghĩa trong việc chọn kiểu gen bố
mẹ cho các cặp lai tạo quần thể lập bản đồ và lai tạo nhằm mở rộng nguồn di truyền
cho các dòng, giống lạc trong tƣơng lai (Mace et al., 2007).
Jiang et al., 2007a xác định có 29 chỉ thị trong số 78 chỉ thị SSR phát hiện đa
hình đã đƣợc xác định dựa trên một tập đoàn 31 giống lạc có mức độ kháng bệnh héo
xanh vi khuẩn khác nhau. Trong một nghiên cứu khác, 32 chỉ thị SSR đƣợc xây dựng
từ 45 giống lạc cũng đƣợc phát hiện 99,4% đa hình (Mace et al., 2007). Jiang et al.
(2007b) đã dựa trên quần thể F6 của cặp lai giữa hai giống Yuanza 9102 và Chico phân
tích trên 354 chỉ thị SSR đã nhận đƣợc 8 nhóm liên kết, trong đó nhận đƣợc 2 chỉ thị
SSR là 7G2 và PM137 liên kết với bệnh héo xanh vi khuẩn.

Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam

Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam

Similar to Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (14)

Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam