3. • Хорошо охарактеризованная ДНК или
олигонуклеотидные фрагменты (зонды) используются
для поиска близких последовательностей в тестовых
образцах
• Основаны на специфичности спаривания нуклеотидов
• Используется однонитевая ДНК
• Одна из цепей метится (радиоизотопы, химически
модифицированные группы), другая крепится на фазу
• Стабильность гетеродуплексов зависит от степени
комплементарности, а также от длины
комплементарного участка, температуры и ионного
состава раствора
Методы, основанные на
гибридизации нуклеиновых кислот
16. Методы, основанные на
гибридизации нуклеиновых кислот
• Southern blot, northern blot, western blot,
southwestern blot, eastern blot
• Microarray
• FISH, TISH
17. Southern Blot
• Разрезание ДНК
• Электрофорез ДНК
• Перенос ДНК на
мембранный фильтр
• Гибридизация
• Визуализация
18. Перенос на мембрану
• ДНК в геле денатурируется под воздействием
щелочи
• Пассивный перенос (за счет диффузии) ДНК из
геля на мембрану (нитроцеллюлоза или
нейлон)
• Мембрана отделяется от геля и гибридизуется
с зондами
19. Зонд
• Олигонуклеотид с известной
последовательностью ДНК
• Последовательность комплементарна
искомому гену (или другому фрагменту
хромосомы)
• Однонитевая ДНК
• Помечен радиоактивным фосфором или
флуоресцентной группой
20. Гибридизация
• Температура и солевой состав контролируются
для оптимальной гибридизации
• Зонд с целевой последовательностью
образуют двунитевую молекулу ДНК
• Несвязавшиеся зонды отмываются
21. Визуализация радиоактивной метки
• Мембрана контактирует с рентгеновской
пленкой
• Авторадиограмма на соответствует
положению радиоактивного зонда на
мембране
22. DNA from normal individual
digested with Eco R1 and
electrophoresed through agarose
DNA from mutant individual digested
with Eco R1 and electrophoresed
through agarose
25. Типы блоттинга
•ДНК
•Гибридизация с ДНК
Southern blot
•РНК
•Гибридизация с ДНК
Northern blot
•Белки
•Гибридизация с антителами
Western blot
•Белки, связанные с ДНК
•Гибридизация с ДНК
Southwestern blot
•Посттрансляционные модификации белков
•Гибридизация с антителами
Eastern blot
32. DNA-microarray
• Технология микрочипов позволяет
проводить огромное количество
гибридизаций одновременно
• Зонды зафиксированы на твердой фазе,
образцы ДНК мечены флуорофорами
33. Гибридизация на микрочипе
1. Получение одноцепочечных меченных молекул ДНК
исследуемого образца (PCR, RT-PCR)
2. Гибридизация
3. Отмывка несвязавшейся ДНК
4. Считывание флюоресценции
38. Применение микрочипов
• Анализ экспрессии
• Сравнительная гибридизация геномов
• Идентификация организма
• Анализ полиморфизмов
• Иммунопреципитация хроматина на чипе
• Анализ альтернативного сплайсинга
• Анализ перестроек
45. Прямая иммобилизация на твердой фазе
• Ковалентное связывание зонда с твердой
поверхностью (стекло)
• Нанесение зондов на твердую фазу при помощи
роботизированных систем печати
48. FISH — fluorescence in situ hybridization
Флуоресцентная гибридизация in situ
in situ (лат.) – на месте
49. Зонды метят флуорофорами или метками с непрямой детекцией
Образец ДНК денатурируют в фиксированных препаратах клеток
50. Этапы FISH
Подготовка зондов
Подготовка препарата
•(фиксация хромосом)
Гибридизация
•Денатурация
•Гибридизация
•Отмывка после гибридизации
Анализ результатов
51. • Центромерные зонды
• Суб-теломерные специфичные зонды
• Хромосомные красители
• Зонды, детектирующие уникальные
последовательности хромосомных
транслокаций
• Зонды, детектирующие делеции
• Зонды, детектирующие ген
Зонды для FISH
(размер до нескольких сотен килобаз)
