TẾ BÀO GỐC

1. TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG TỰ THÂN
ĐIỀU TRỊ BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
Huỳnh Duy Thảo, Nguyễn Bảo Tường, Trần Thị Thanh Thủy,
Trần Công Toại
 Bộ môn Mô – Phôi, ĐHYK Phạm Ngọc Thạch
 Khoa Bỏng, BV. Nhi Đồng I

2. NỘI DUNG
ĐẶT VẤN ĐỀ1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3
KẾT QUẢ4
KẾT LUẬN5

3. ĐẶT VẤN ĐỀ

8. SỐ LIỆU BV. NHI ĐỒNG I
• Mỗi năm có khoảng 2000 bệnh nhi khám và
điều trị tại khoa bỏng
• 1/3 bỏng < 10% diện tích cơ thể
• 1/3 bỏng rộng > 30% (80 – 90%)
=> nhóm bệnh có nguy cơ tử vong cao, nguy cơ
tàn tật cao và mang di chứng ảnh hưởng nặng
nề đến thẩm mỹ

9. CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ
• Vài trăm ngàn => vài chục triệu
• Cá biệt : 120.000.000 đồng
=> thực hành giảm chi phí kháng sinh/ngày điều
trị

10. GIẢI PHÁP ĐIỀU TRỊ BỎNG
NẶNG Ở TRẺ EM
• 1/3 bỏng rộng > 30% diện tích cơ thể
 Tìm được nguồn da ghép để ghép sớm
 Khó khăn:
+ Không ghép được nguồn da đồng loại, dị
loại
+ Chỉ sử dụng được vật liệu che phủ: màng
trung bì, màng ối, màng collagen nhận tạo …

11. ĐÂY LÀ NHÓM CẦN THIẾT
PHẢI ĐƯỢC GHÉP DA
• VÌ:
 Có nguy cơ tử vong cao
 Cần nhiều da để ghép
 Chi phí điều trị cao: nằm viện lâu, dùng nhiều
kháng sinh …

12. MỤC TIÊU CUỐI
• Trẻ hòa nhập hoàn toàn với xã hội
 Không tàn tật
 Không tự ti, mặc cảm về ngoại hình
 Nâng cao chất lượng cuộc sống

14. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
ẢNH HƯỞNG RẤT NẶNG NỀ ĐẾN
BẢN THÂN, GIA ĐÌNH VÀ XÃ HỘI

15. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
GIẢI PHÁP
GHÉP DA
TỰ THÂN

16. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
GIẢI PHÁP HẠN CHẾ

17. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
GIẢI PHÁP
TẤM TẾ BÀO
SỪNG

18. ĐỐI TƯỢNG –
PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

19. CẤU TẠO MÀNG ỐI

20. CẤU TẠO MÀNG ỐI

21. THU NHẬN MÀNG ỐI

22. CẤU TẠO MÔ DA
Tế
bào
lớp
đáy
Tế bào
lớp gai
Tế
bào
lớp
hạt
Phóng thích thể
mỏng
Thể mỏng
Hạt keratohyalin
Bộ máy Golgi
Thể mỏng
Tế bào
hóa
sừng
Vỏ tế
bào

24. Lớp sừng
Lớp gai
Lớp hạt
Lớp đáy
CƠ CHẾ TỰ ĐỔI MỚI

25. CƠ CHẾ BIỆT HÓA
Tế bào gốc
biểu mô
Tế bào khuếch đại
chuyển
Tế bào gốc
biểu mô
Các tế bào biểu bì
đã biệt hóa
Tế bào gốc
Biểu mô
Tế bào khuếch đại
chuyển

26. ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG
Tế bào
gốc
Tự làm
mới
Tế bào
khuếch đại
chuyển
Biệt hóa Tế bào đang
biệt hóa ở hậu
kỳ của gián
phân
Tế bào lớp
gai
Tế bào lớp hạt
Tế bào lớp vảy
sừng

27. ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG
- Nhuộm p63: đỏ
- Nhuộm involucrin: xanh lá cây

30. Màng lọc của đĩa lồng
Tế bào sừng
Môi trường nuôi tế bào
sừng
Màng collagen
MÔ HÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG
Đĩa lồng

31. Mẫu da người
Nuôi, nhân tế
bào sừng
Cấy tế bào sừng
lên màng collagen
Tạo nhiều lớp tế bào
sừng trên màng collagen
Đánh giá
Phân lập tế bào
Màng collagen
Loại biểu mô
Màng ối người
Theo dõi, đánh
giá sản phẩm
Ghép tự thân
trên bệnh nhân

32. TẠO MÀNG COLLAGEN TỪ MÀNG ỐI
-Hóa chất:
+ Nước cất
+ Dung dịch PBS
+ Nước muối sinh lý
+ Trypsin 0.25%

33. ĐÁNH GIÁ MÀNG ỐI
BA
Kết quả nhuộm trichrom (A) và nhuộm
PAS (B) của màng ối đã loại biểu mô

34. Màng ối được thu nhận
trong DPBS – kháng sinh
Rửa, lắc trong DPBS
cho sạch máu
Cạo bỏ lớp tế bào biểu mô
Đóng gói
Lắc trong trypsin/EDTA
30 phút, 37oC
Để khô tự nhiên trong tủ cấy
khoảng 2 giờ
Chiếu xạ bằng tia ,
suất liều 25kGy
Bảo quản ở nhiệt độ
phòng

35. GIÁ THỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO SỪNG
GIÁ THỂ = Màng collagen (từ màng ối người)

37. TH1 TH2 TH3
PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, NHÂN KHỐI
TẾ BÀO SỪNG
TH1 TH2 TH3

38. MẪU DA
A B

39. QUY TRÌNH Mẫu da được thu nhận
trong DPBS – kháng sinh
Rửa trong DPBS, loại bỏ lông,
mỡ, một phần lớp trung bì
Cắt thành từng mảnh nhỏ
Tách rời lớp biểu bì và lớp trung bì
Thay môi trường sơ cấp bằng môi
trường không huyết thanh
Ủ trong trypsin 0,25% - EDTA
0,02% (tỷ lệ 1 - 4) 18 giờ, 4oC
Huyền phù để thu nhận
tế bào sừng rời
Nuôi tế bào trong môi trường sơ cấp ở
37oC, 5% CO2 với mật độ 3 x 105 tế
bào/cm2 bề mặt chai nuôi trong 2 ngày
Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2, thay
môi trường 2 ngày/lần

40. Biểu bìTrung bì

41. Biểu bìTrung bì

42. Biểu bìTrung bì

44. ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG
0.959
0.721
0.565
0.419
0.321
0.2
0.4
0.6
0.8
1
2 3 4 5 6
Ngày
M?tđ?quang

45. ĐÁNH GIÁ NST ĐỒ

46. KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GIEN
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
300bp
600bp
500bp
400bp
+ M - Thang
+ 1, 3, 5, 7, 9 - Sản phẩm khuếch đại các gen tương ứng p63
(440bp), K14 (390bp), K5 (475bp), involucrin (373bp), -actin
(587bp)
+ 2, 4, 6, 8, 10 - Sản phẩm khuếch đại gen của mẫu da bình
thường đối chứng tương ứng p63, K14, K5, involucrin, -actin

47. TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG

48. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
A B
Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn trên màng collagen

49. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
Kết quả tạo tấm tế bào sừng. Tấm tế bào sau 7 ngày nâng lên bề mặt không
khí (A Kính hiển vi đảo ngược, 100X) và (B, H&E).
A B

50. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
AMàng collagen B
Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho tấm tế bào sừng.
Sau 7 ngày các tế bào bắt màu nâu: dương tính p63.
A: Mẫu nghiên cứu
B: Mẫu da người

51. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
Màng collagen

52. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP

54. BÁO CÁO SƠ BỘ NHỮNG TRƯỜNG HỢP
NUÔI CẤY DA ĐÃ THỰC HIỆN

56. BÁO CÁO SƠ BỘ NHỮNG TRƯỜNG HỢP
NUÔI CẤY DA ĐÃ THỰC HIỆN

59. BÁO CÁO SƠ BỘ NHỮNG TRƯỜNG HỢP
NUÔI CẤY DA ĐÃ THỰC HIỆN

62. KẾT LUẬN

63. KẾT LUẬN
• Thứ nhất, tấm tế bào sừng có thể dùng điều trị tổn thương mất da ở trẻ em
=> giảm diện tích da cho để ghép, giảm đau hậu phẫu và cho sẹo mềm mại
hơn so với kỹ thuật ghép da mỏng hiện đang sử dụng.
• Thứ hai, việc sử dụng tấm tế bào sừng vẫn còn những khó khăn như diện
tích da nuôi cấy chưa đủ che phủ toàn bộ thương tổn, khó đánh giá độ bám
dính, sẹo vẫn phì đại, đỏ và ngứa nhưng tốt hơn sẹo do ghép da mỏng hoặc
để lành tự nhiên.
• Thứ ba, cần nghiên cứu thêm để giải quyết những tồn tại trên và nghiên cứu
thêm để nhuộm màu cho tấm tế bào sừng để đáp ứng nhu cầu thẩm mỹ, ghép
thêm tấm lưới sợi trên bề mặt tấm tế bào sừng để cố định mảnh ghép tốt hơn,
gửi mẫu nuôi cấy nhiền đợt để có thể che phủ toàn bộ vết thương …

64. HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• Thứ nhất, đồng nuôi cấy tế bào sắc tố để tạo màu sắc cho mảnh ghép.
• Thứ hai, thử nghiệm nuôi trực tiếp không qua nhân khối để rút ngắn thời
gian ghép cho bệnh nhi.
• Thứ ba, ghép thành nhiều đợt để gia tăng thể tích ghép cho bệnh nhi.