Monoclonal hybridoma technology for blood group reagents production

1. 1
รายงานการฝึกอบรมดูงานการสร้างเซลล์สายพันธุ์ไฮบริโดมาเพือผลิตนํายาตรวจหมู่โลหิตด้วยวิธี
Murine/Human Monoclonal HybridomaTechnology
ระหว่างวันที 4 ตุลาคม 2555ถึงวันที 20 ธันวาคม 2555
ณ Kanto-Koshinetsu Block Blood Center, Japanese Red Cross กรุงโตเกียว ประเทศญีปุ่ น

2. 2
คํานํา
เนืองจากศูนย์บริการโลหิตแห่งชาติ สภากาชาดไทยมีความต้องการจะพัฒนาการสร้างเซลล์สายพันธุ์ไฮบริโดมา
เพือผลิตนํายาตรวจหมู่โลหิต Minor blood group เช่น anti-C3d, anti-D, anti-E, anti-c, anti-M, anti-N และ anti-Mia เป็นต้น
ด้วยวิธี Murine/Human Monoclonal Hybridoma Technology จึงได้ขอความช่วยเหลือไปยัง Kanto-Koshinetsu Block Blood
Center, Japanese Red Cross กรุงโตเกียว ประเทศญีปุ่น เพือส่งเจ้าหน้าทีในฝ่ายผลิตนํายาแอนติซีรัมและผลิตภัณฑ์เซลล์ ไป
ฝึกอบรมและดูงาน แบ่งเป็นสามชุด ชุดละหนึงปีเป็นระยะเวลาทังสินสามปี ดังนี
ชุดที 1 ตุลาคม-ธันวาคม พ.ศ. 2555
1. นางสาวกัลยา เกิดแก้วงาม ผู้ชํานาญการนักวิทยาศาสตร์การแพทย์6
2. นางสาวกาญจนา เอียมอัมพร ผู้ชํานาญการนักวิทยาศาสตร์การแพทย์6
ชุดที 2 กันยายน-พฤศจิกายน พ.ศ. 2556
1. นางสาวศิริพร พลเสน นักวิทยาศาสตร์การแพทย์5
2. นายสมพงศ์ บุญให้ ผู้ชํานาญการนักเทคนิคการแพทย์6
ชุดที 3 กันยายน-พฤศจิกายน พ.ศ. 2557
1. นายอุดม ติงต้อย หัวหน้าฝ่ายผลิตนํายาแอนติซีรัมและผลิตภัณฑ์เซลล์
2. นายสุวิทย์โพธินิมิตร ผู้ชํานาญการนักวิทยาศาสตร์การแพทย์6
รายงานนีจัดทําขึนโดยนางสาวกัลยา เกิดแก้วงาม ผู้ชํานาญการนักวิทยาศาสตร์การแพทย์6 เพือรายงานผลการ
ฝึกอบรมดูงานที Kanto-Koshinetsu Block Blood Center, Japanese Red Cross กรุงโตเกียว ประเทศญีปุ่น ระหว่างเดือน
ตุลาคม-เดือนธันวาคม พ.ศ. 2555

3. 3
สารบัญ
เรือง หน้า
การสร้างเซลล์สายพันธุ์เพือผลิต Anti-C3d
ด้วยวิธี Murine Monoclonal Hybridoma 1
การฉีดกระตุ้นสัตว์ทดลอง 1
วิธีทํา C3b/C4b sensitized red blood cells 3
วิธีทํา C3d/C4d sensitized red blood cells 4
การทําเซลล์Fusion 4
การทดสอบ Anti-C3d 6
วิธีทํา C3b sensitized red blood cells 6
วิธีทํา C3d sensitized red blood cells
การเตรียม 0.1% Trysin solution 8
การทํา Limiting dilution เพือคัดเลือก monoclone
การหาความแรงของแอนติบอดี (Titer) ด้วย 96 well plates (U plate) 9
การแช่แข็ง hybridoma ในไนโตรเจนเหลว 9
การสร้างเซลล์สายพันธุ์เพือผลิต Anti-Mia
ด้วยวิธี Murine Monoclonal Hybridoma 10
การฉีดกระตุ้นสัตว์ทดลอง 10
การทําเซลล์Fusion 10
การทดสอบ Anti-Mia
10
การสร้างเซลล์สายพันธุ์เพือผลิต anti-A และ anti-B
ด้วยวิธี Human Monoclonal Hybridoma 11
การ Transform EB virus 11
การ Treat เม็ดเลือดแดงแกะด้วย AET
(2-amino-ethyl-thio-isouronium bromind hydrobromind) 11
การเตรียม AET solution 11
การทดสอบ Transform cell 12
การทําเซลล์Fusion 12
การทดสอบ Fusion cell 12
การเตรียม Epstein-Barr Virus (EBV) 12
การเตรียม HAT-Ouabain selection medium (human) 13
การสร้างเซลล์สายพันธุ์หลังการฝึกอบรมดูงาน 13

4. 4
การสร้างเซลล์สายพันธุ์เพือผลิตAnti-C3d ด้วยวิธี Murine Monoclonal Hybridoma
การฉีดกระตุ้นสัตว์ทดลอง ใช้หนูทดลอง BAL B/c by J เพศเมีย อายุ4-5 สัปดาห์ 2 ตัว
วิธีที 1
1. ใช้Purified Human ComplementProtein C3 0.250 ml (1.2 mg/ml)
2. ใส่ PBS (pH=7.35) sterile 50 ul เพือ dilute โปรตีน C3 ให้มีความเข้มข้น 1mg/ml
3. ใช้ Freund 's Adjuvant Complete 250 ul ผสมกับโปรตีน C3 ทีละลายใน PBS 250 ul ผสมจน
เข้ากัน
4. ฉีดกระตุ้นหนูทีตําแหน่งฝ่าเท้าหรือส้นเท้าขาหลัง ฝ่าเท้าแต่ละข้างใช้ปริมาตรสารละลาย 50 ul
ฉีดทุก ๆ สองสัปดาห์หรือสามสัปดาห์ 3 ครัง ครังทีสาม ฉีดสามวันก่อนทํา cell Fusion โดยตัด
lymph node ทีโคนขาและข้างลําตัวหนูเพือใช้ในการทํา cell Fusion ดังแสดงในรูปข้างล่าง

5. 5
วิธีที 2
1. ใช้C3d/C4d sensitized red blood cells ความเข้มข้น 20% ใน NSS
2. ฉีดกระตุ้นหนูทีตําแหน่งท้อง (Intraperitoneal Injections) ใช้เซลล์เม็ดเลือดแดงเข้มข้น 20%
ปริมาตร 200 ul ต่อหนูหนึงตัว ดังแสดงในรูปข้างล่าง ฉีดทุก ๆ สองสัปดาห์หรือสามสัปดาห์ 3
ครัง ครังทีสามฉีดสามวันก่อนทํา Mouse Cell Fusion โดยตัดม้ามเพือใช้ในการทํา Mouse Cell
Fusion

6. 6
การทําเซลล์ Mouse Cell Fusion
1. เลียง NS-1 (mouse myeloma cell line) ด้วย RPMI ใน flash ขนาด 175 cm2
จํานวน 2 flash
ประมาณหนึงสัปดาห์ก่อนทําFusion
2. ฆ่าหนูทีฉีดกระตุ้นครบสามครังแล้วด้วยdry ice (CO2)
3. แช่หนูทีตายแล้วด้วย 75% alcohol เพือทําความสะอาด เช็ดทําความสะอาดด้วยสําลีปราศจาก
เชือ นําเข้าไปไว้ใน laminar air flow
4. ใส่อาหารเลียงเซลล์RPMI 1640 free serumในจานแก้วเล็ก 5ml

7. 7
5. ผ่าท้องหนูตัดเอาม้ามออกมาใส่ในจานแก้วเล็ก ในกรณีทีฉีดกระตุ้นแบบ foot pad ให้ตัดต่อม
นําเหลืองทีโคนขาและข้างลําตัวหนู
6. เลาะไขมันทีติดอยู่ทีม้ามหรือต่อมนําเหลืองออกให้หมด บดม้ามหรือต่อมนําเหลืองให้ละเอียด
ดูดของเหลวทีได้ใส่หลอด 10 ml
7. ล้างจานแก้วด้วยRPMI 1640 free serum5 ml ดูดของเหลวในใส่หลอด 10 ml หลอดเดิม
8. ปันล้างด้วยRPMI 1640 free serum3 ครัง 1,000 rpm 10 นาที ล้างเสร็จใส่ RPMI free serum 10
ml ในหลอดเพือ resuspension เม็ดเลือดขาวหนูทีแยกได้
9. นํา culture cell (NS-1) mouse myeloma cell line ทีเลียงไว้ใน flash 175 cm2
ออกมาล้างด้วย
RPMI 1640 free serum 3 ครัง โดยใส่หลอด 50 ml 4 หลอด ปันอาหารเลียงเซลล์ทิงแล้วรวม
เป็นหลอดเดียว ล้างต่ออีกสามครัง ปัน 1,000 rpm 5 นาที resuspension NS-1 ด้วย RPMI 1640
free serum20 ml
10. นับเซลล์เม็ดเลือดขาวหนูและ myeloma NS-1 โดยใช้ PBS(-) เป็นตัว dilulte โดยใช้ cell
suspension 30 ul ต่อ PBS(-) 30 ul ผสมให้เข้ากัน ดูด 30 ul ไปใส่ในสี Trytophen blue 30 ul
ผสมให้เข้ากันใส่ในสไลค์นับเซลล์ Petroff-Haussercounting chamber นับเซลล์จากสีช่อง
สไลด์ตาห่าง ดังแสดงในรูป
11. จํานวนเซลล์เม็ดเลือดขาวหนูและ NS-1 myeloma เข้าสูตร ความเข้มข้นเซลล์ = จํานวนเซลล์ที
นับได้ x 2 x 1/4 x 105
cell/ml สําหรับเซลล์เม็ดเลือดขาวหนูให้คํานวณหาจํานวนเซลล์ทังหมด
จาก cells suspension 10 ml โดยนําจํานวนเซลล์ทีนับได้คูณ 10 สําหรับ NS-1 myeloma

8. 8
นําไปคํานวณหาปริมาตรทีต้องการใช้ โดยใช้เซลล์เม็ดเลือดขาวหนู 1 ส่วนต่อ NS-1 myeloma
10 ส่วน ดังข้อ 12
12. สูตรคํานวณจํานวน NS-1 myeloma ทีต้องการ
จํานวน NS-1 myeloma ทีต้องการ = [ความเข้มข้นของเซลล์เม็ดเลือดขาวจากหนูทีนับได้(cell)/
ความเข้มข้นของNS-1 myeloma (cell/ml)] x 1/10
13. Autoclave PEG molecular weight 4000 จํานวน 1 กรัม
14. ใส่ 1 ml RPMI free serum ทําเป็น 50% PEGแล้ว Incubate 37 °c 1นาที
15. รวมเซลล์เม็ดเลือดขาวหนูทังหมดกับ NS-1 myeloma ทีคํานวณได้ตามข้อ 12. ปัน 1000 rpm 5
นาที ดูด supernate ทิง
16. ใส่ 50% PEG 1 ml ลงในหลอด Fusion cell 50 ml ครังละ 1-2 หยด แล้วค่อยผสมเซลล์กับ PEG
โดยเอียงหลอดเบา ๆ จน cell กับ PEG ผสมกัน ทําเช่นนีจน PEG หมด ขันตอนนีควรทําอย่าง
รวดเร็วใช้เวลาประมาณ 5 นาทีหรือตํากว่า เพราะ PEG เป็นพิษกับเซลล์ ถ้าใช้เวลานานเซลล์
อาจจะตายได้
17. Incubate 37 °c 1 นาที ใส่ RPMI free serum 10 ml อย่างช้า ๆ เพือ resuspension เซลล์ปัน 1000
rpm 5 นาที
18. ดูด supernatant ทิง resuspenion ใส่ RPMI with serum + HAT คํานวณให้มีความเข้มข้นเซลล์5
x106
cells/ml โดยเซลล์ทีนํามาคํานวณความเข้มข้นเป็นเซลล์เม็ดเลือดขาวจากหนูเท่านัน ดัง
สูตร จํานวน RPMI with serum + HAT ทีต้องการ (ml) = จํานวนเซลล์เม็ดเลือดขาวของหนู
ทังหมด/ 5 x106
(cell/ml)
19. ใส่ 96 well platesหลุมละ 200 ul เลียงในตู้เลียงเซลล์จนกว่าจะเกิด hybridoma
20. ตรวจกรองแอนติบอดีด้วย C3b/C4b และ C3d/C4d sensitized red blood cells ย้ายหลุมทีให้ผล
บวกเลียงใน 48well plates เลียงอีกประมาณ 1 สัปดาห์
การทําLimiting dilution เพือคัดเลือก monoclone
1. กวน hybridoma ใน 48 well plates ทีให้ผลบวกกับ C3b/C4b และ C3d/C4d sensitized red
blood cells ให้ผสมกับนําเลียงเซลล์แล้วดูดออกมา 50 ul เพือนับเซลล์
2. คํานวณหาความเข้มข้นของเซลล์ใน 48 well plates เสร็จแล้วคํานวณให้มีความเข้มข้นเซลล์
เท่ากับ 7 cells/ml ประมาณ 1cell/well
3. ตัวอย่างการคํานวณ เช่น นับเซลล์ในสไลค์ Petroff-Haussercounting chamber ได้ 29 cells
ความเข้มข้นของhybridoma ใน 48 well plates = 29x2x1/4x104
= 1.45x105
cell/ml
4. เจือจาง = 1.45x105
/7 cell/ml= 20,714 เท่า ประมาณ 20,000 เท่า
5. ทําการเจือจางสองขันตอน

9. 9
5.1 เจือจางขันที 1 เจือจาง 100 เท่า hybridoma จาก 48 well plates 50 ul เจือจางในอาหาร
เลียงเซลล์RPMI+IL6จํานวน 5ml ใส่รวมกันในหลอด 15ml ผสมจนเข้ากันดี
5.2 เจือจางขันที 2 เจือจาง 200 เท่า ดูด hybridoma จากข้อ 5.1 จํานวน 300 ul เจือจางใน
อาหารเลียงเซลล์ RPMI+IL6 จํานวน 60 ml ผสมจนเข้ากันดีในขวดปราศจากเชือ 100
ml
6. Cell suspension จากข้อ 5.2 เลียงใน one field 96 well plates จํานวน 4 plates โดยใส่ Cell
suspension well ละ 150 ul เลียงประมาณ 1-2 สัปดาห์ หรือจนกว่าจะเกิด monoclone
hybridoma
การแช่แข็ง hybridomaในไนโตรเจนเหลว
1. ผสม hybridoma กับนําเลียงเซลล์ใน 15 ml flash จนเข้ากันดี ดูดใส่หลอด 15 ml ปัน 1,000 rpm
5 นาที
2. ดูด supernate ทิงหรือเก็บไว้ทดสอบ เขย่าหลอดจน hybridoma หลุดจากก้นหลอด
3. เติม Freezing solution 1 ml ใส่ในหลอด 15 ml ผสมจน hybridoma เข้ากันดีกับ Freezing
solution
4. ดูดใส่หลอดขนาด 1ml สําหรับแช่แข็งเซลล์ปิดฝา labelชือ clone และวันที freeze
5. แช่ในตู้ -80 °c หนึงคืน วันรุ่งขึนย้ายไปแช่ในถังไนโตรเจนเหลว กรอกข้อมูลตําแหน่งเก็บ
clone ในแผนทีถังไนโตรเจนเหลว
การทดสอบทาง Serology
การทดสอบ anti-C3d และ anti-C3c
1. หลังการ Fusion และเลียงเซลล์ประมาณสองสัปดาห์ ให้ตรวจสอบดูจะมี hybridoma เกิด
ใน 96 well plate ถ้ากลุ่มของ hybridoma ส่วนใหญ่โตขึนจนมีขนาด ¾ ของ well ให้เก็บนํา
เลียงเซลล์จาก 96 well platesหลุมละ 100 ul
2. ทดสอบกับ C3b/C4b Coated red blood cellsโดยใส่ 3% cell suspension หลุมละ 25 ul
3. Incubate ทีอุณหภูมิห้อง 1 ชัวโมง อ่านผล well ใดให้ผลบวก ให้ย้ายไปเลียงต่อใน 48 well
plates จน hybridomaโตและแข็งแรงดี
4. เก็บนําเลียง 200 ul นํามาทดสอบกับ C3b/C4b Coated red blood cells และ C3d/C4d
Coated red blood cells เพือจําแนกว่าเป็น anti-C3c หรือ anti-C3d โดย anti-C3c ให้ผลบวก
กับ C3b/C4b Coated red blood cells เซลล์เดียว ส่วน anti-C3d ให้ผลบวกทังสองเซลล์
เซลล์ทีไม่สร้าง antibodies ให้ผลลบทังสองเซลล์

10. 10
5. ทํา limiting dilution เพือแยกเซลล์ให้เหลือ 1 hybridoma cell/well โดย Clone ทีได้ต้อง
เจริญขึนมาจากเซลล์เพียงเซลล์เดียวเท่านัน
6. เลียงเซลล์ต่ออีก 1-2 สัปดาห์ จนเกิด monoclone ใน 96 wells plates เก็บนําเลียงเซลล์50 ul
ทดสอบกับ C3b/C4b Coated red blood cells ทําการคัดเลือก monoclone ทีให้ผลบวก แล้ว
ย้ายไปเลียงต่อใน 24 well platesจน hybridoma โตและแข็งแรงดี
7. เก็บนําเลียงเซลล์ 100 ul เพือหาความแรง (titration) กับ C3b/C4b Coated red blood cells
ในกรณีเป็น anti-C3c
8. เก็บนําเลียงเซลล์ 200 ul เพือหาความแรง (titration) กับ C3b/C4b Coated red blood cells
และ C3d/C4d Coated red blood cells ในกรณีทีเป็น anti-C3d
9. เลือก Clone ทีมีความแรงมากทีสุด ขยายไปเลียงใน 15 ml flash โดยใส่อาหารเลียงเซลล์
ประมาณ 5ml วันต่อมาเพิมอาหารเลียงเซลล์อีก 5 ml
10. เมือ hybridoma โตจนเกือบเต็มพืน flash ให้ขยายเป็น 2 flash เมือ hybridoma เจริญจนเต็ม
พืน flashอีกครังให้เก็บนําเลียงมาเพือหาความแรง
11. เก็บ hybridoma ทีได้แช่แข็งในไนโตรเจนเหลวเพือเก็บไว้เป็นต้น Clone ต่อไป นําเลียงที
เก็บได้ทังหมด 20 ml เก็บไว้เพือทดสอบทาง Serology กับ C3b Coated red blood cells
และ C3d Coated red blood cellsอย่างละเอียดต่อไป
วิธีทําC3b/C4b sensitized red blood cells
(สําหรับตรวจกรองanti-C3d และ anti-C3c)
1. 10 g Sucrose ละลายในนํากลัน 10 ml ได้สารละลาย 10 % Sucrose 10 ml
2. Pecked Red Cell group Oล้างแล้วด้วยNSS 3 ครัง 2ml
3. FreshSerum groupใดก็ได้1ml
4. ผสมข้อ 1-3 ให้เข้ากันในหลอดทดลองขนาด 50ml
5. Incubate 37 °c 30 นาที โดนเขย่าบ่อย ๆ
6. ล้าง 3 ครังด้วยPBS
7. ทดสอบกับ anti-C3c และ anti-C3d ในผลบวกกับทังสองแอนติบอดี 3+ ถึง 4+
8. เก็บเซลล์ใน Alsever 's solutionได้นาน 1 สัปดาห์
วิธีทําC3d/C4d sensitized red blood cells
(สําหรับตรวจกรองanti-C3d และ anti-C3c และฉีดกระตุ้นหนู)
1. เตรียม 0.1% Trysin จาก stock 0.25% Trysin โดยใช้ 0.1% Trysin 120 ul ผสมกับ PBS 180 ul
ใส่หลอด 50 ml

11. 11
2. เติม Packed C3b/C4b sensitized red bloodcells 300 ul
3. Incubatate 37°c 30 นาที หลังจากนันล้างสามครังด้วยNSS
4. ทดสอบกับ anti-C3c และ anti-C3d ต้องให้ผลบวกกับanti-C3d 3+ ถึง 4+ และต้องให้ผลลบกับ
anti-C3c
5. เก็บเซลล์ใน Alsever 's solutionได้นาน 1 สัปดาห์
วิธีทําC3b sensitized red blood cells (สําหรับตรวจแยก anti-C3d และ anti-C3c)
1. การเตรียมsolution A
1.1 Sucrose 23.1 g
1.2 NaH2PO4.2H2O 193 mg
1.3 EDTA.2Na 395 mg
1.4 ละลายสารเคมีข้อ 1.1-1.3 ในนํากลัน 250ml
2. การเตรียมsolution B
2.1 Sucrose 23.1 g
2.2 Na2HPO4.2H2O 449 mg
2.3 EDTA.2Na 395 mg
2.4 ละลายสารเคมีข้อ 2.1-2.3 ในนํากลัน 250ml
3. การเตรียมsolution C (MgCl2)
3.1 MgCl2.6H2O 0.8 g
3.2 ละลายในนํากลัน 10 ml
4. การเตรียม coated-solutionใช้ solution B ประมาณ 13 ml ปรับ pH solution A จนกระทัง
solution A มี pHเท่ากับ 5.1 solution นีคือcoated-solution
5. แยก plasma ออกจาก fresh blood group O
6. เจือจาง plasma ด้วย PBS ดังแสดงในรูปด้านล่าง แต่ละหลอดใส่ plasma ทีเจือจางแล้ว 1/4,
1/8, 1/16 และ 1/32 จํานวน 600 ul
7. ล้างเม็ดเลือดแดง 3 ครังด้วย NSS แต่ละหลอดของ plasma ทีเจือจางแล้ว 1/4, 1/8, 1/16
และ 1/32 ใส่ PRC 600 ul

12. 12
8. ใส่ coated-solution 19 ml ใน beaker ขนาด 100 ml จํานวน 4 beaker โดย Lebel ข้าง
beaker 1/4, 1/8, 1/16 และ 1/32
9. นํา beaker ทังสี beaker และหลอดทดลองทังสีหลอดแช่ในอ่างนําแข็งดังรูปข้างล่าง ใส่
magnetic stirrer ลงในแต่ละ beaker แช่ไว้ประมาณ 10นาที
10. ใส่ 1 ml เม็ดเลือดแดง+plasma ทีเจือจางแล้วแต่ละ dilution ลงในแต่ละ beaker ตาม
dilution ที labelไว้ข้างbeaker กวนแต่ละbeaker ด้วยmagnetic stirrer
11. ใส่ solution C จํานวน 100ul ลงในแต่ละ beaker อย่างรวดเร็ว ทิงไว้ประมาณ 60 นาที
12. ล้าง coated RBCs ด้วยNSS เย็น 3 ครัง
13. ทดสอบ coated RBCs แต่ละ dilution ด้วย anti-C3d เลือก coated RBCs dilution ทีมีความ
แรงสูงสุดเก็บไว้ใช้งาน
14. เก็บรักษาcoated RBCs ใน Alsever solution
วิธีทําC3d sensitized red blood cells (สําหรับตรวจแยก anti-C3d และ anti-C3c)
1. เตรียม C3b sensitized red bloodcells
2. ใส่ 100 ul 0.1% Trysinลงในหลอดทดลอง
3. ใส่ 100 ul C3b sensitized PRCs ลงในหลอดทดลองข้อ 2 ผสมให้เข้ากันดี
4. Incubate หลอดทดลองในอ่างนําร้อนอุณหภูมิ 37 °c 30นาที
5. ล้าง coated RBCs ด้วยNSS 3 ครัง
6. เก็บรักษาcoated RBCs ใน Alsever solution
การเตรียม 0.1% Trysin solution
1. การเตรียมSolution A

13. 13
0.1 M Na2HPO4 .2H2O 8.9 gละลายในนํากลัน 500ml
2. การเตรียมSolution B
0.1M KH2PO4 6.8 gละลายในนํากลัน 500 ml
3. ปรับ pH solution A 9.49 ml ด้วยsolution B 0.51 ml ให้ได้pH = 8.0
4. ใส่ 90 ml NSS ลงใน solution A+B
5. ใส่ 0.1 g Trysin ลงในสารละลายข้อ 4 กวนจนละลาย
6. แบ่งสารละลายในข้อ 5 ใส่หลอดทดลองสําหรับแช่แข็งหลอดละ 1 ml
7. เก็บรักษา 0.1% Trysin ที -20 °c เป็นสต๊อก รอนํามาใช้งานต่อไป
การหาความแรงของแอนติบอดี(Titer) ด้วย 96well plates (U plate)
1. ดูดนําเลียงเซลล์ทีต้องการหาความแรง ใส่แถวที 1 (Aถึง H) wellละ 100 ul
2. ดูด NSS ใส่ในแถวที 2-12 (A ถึง H) wellละ 50 ul
3. Transfer นําเลียงเซลล์จากแถวที 1 (A ถึง H) จํานวน 50 ul ใส่ในแถวที 2 (A ถึง H) ผสมจน
เข้ากันดี แล้วดูดต่อไปแถวที 3 ทําเช่นนีจนครบ 12 แถว
4. ดูด 1-3% red cell suspension ใส่ 96 well plates well ละ 25 ml Incubate 1 ชัวโมงที
อุณหภูมิห้อง อ่านผลความแรง โดยแถวที 1 ไม่เจือจาง แถวที 2 เจือจาง 2 เท่า แถวที 3 เจือ
จาง 4 เท่า จนถึงแถวที 12 เจือจาง 2048 เท่า

14. 14
การสร้างเซลล์สายพันธุ์เพือผลิตAnti-Mia
ด้วยวิธีMurine Monoclonal Hybridoma
การฉีดกระตุ้นสัตว์ทดลอง ใช้หนูทดลอง BAL B/c by J เพศเมีย อายุ4-5 สัปดาห์ 2 ตัว
1. ใช้MiIII หรือ MiVi red blood cellsความเข้มข้น 20% ใน NSS
2. ฉีดกระตุ้นหนูทีตําแหน่งท้อง (Intraperitoneal Injections) ใช้เซลล์เม็ดเลือดแดงเข้มข้น
20% ปริมาตร 200 ulต่อหนูหนีงตัว ดังแสดงในรูปหน้า 3 ฉีดทุก ๆ สองสัปดาห์หรือสาม
สัปดาห์ 3 ครัง ครังทีสาม ฉีดสามวันก่อนทํา cell Fusion โดยตัดม้ามเพือใช้ในการทํา cell
Fusion
การทําเซลล์ Mouse Cell Fusion,Limitingdilution และการแช่แข็งเซลล์สายพันธุ์
ทําเช่นเดียวกับการสร้างเซลล์สายพันธุ์เพือผลิต anti-C3d ในหน้าที 3 ถึงหน้าที 6
การทดสอบทาง Serology
การทดสอบ Anti-Mia
1. หลังการ Fusion และเลียงเซลล์ประมาณสองสัปดาห์ ให้ตรวจสอบดูจะมี hybridoma เกิด
ใน 96 well plate ถ้ากลุ่มของ hybridoma ส่วนใหญ่โตขึนจนมีขนาด ¾ ของ well ให้เก็บนํา
เลียงเซลล์จาก 96 well platesหลุมละ 100 ul โดยแบ่งเป็น 2 plates ๆ ละ 50 ul
2. ทดสอบกับ MiIII หรือ MiVI red blood cells และ Mia
(-) red blood cells โดยใส่ 3% cell
suspension หลุมละ 25 ul
3. Incubate ทีอุณหภูมิห้อง 1 ชัวโมง อ่านผล จดบันทึกหลุมทีให้ผลบวก ล้าง plates ด้วย NSS
3 ครัง ใส่ murine AHS 25 ul ตังทิงครึงชัวโมง อ่านผล หลุมให้ผลบวกทังหมด ให้ย้ายไป
เลียงต่อใน 48 well plates จน hybridomaโตและแข็งแรงดี
4. เก็บนําเลียง 300 ul มา identify ชนิดของแอนติบอดี เพือจําแนกว่าเป็นแอนติบอดีชนิดใด
โดยใช้ A cell และ B cell, screening cell O1และ O2, MiIII และ MiVI red blood cells
คัดเลือกเซลล์ทีให้บวกกับบางเซลล์และให้ผลลบกับบางเซลล์ หรือให้ความแรงของ
ปฏิกิริยาไม่เท่ากันทุกเซลล์มาทํา limiting dilution
5. ทํา limiting dilution เพือแยกเซลล์ให้เหลือ 1 hybridoma cell/well โดย Clone ทีได้ต้อง
เจริญขึนมาจากเซลล์เพียงเซลล์เดียวเท่านัน
6. เลียงเซลล์ต่ออีก 1-2 สัปดาห์ จนเกิด monoclone ใน 96 wells plates เก็บนําเลียงเซลล์50 ul
ทดสอบกับ MiIII หรือ MiVI red blood cells เพือทําการคัดเลือก monoclone ทีให้ผลบวก
แล้วย้ายไปเลียงต่อใน 24 well platesจน hybridoma โตและแข็งแรงดี

15. 15
7. เก็บนําเลียงเซลล์100 ul เพือหาความแรง (titration) กับ MiIII หรือ MiVI red blood cells
8. เลือก Clone ทีมีความแรงมากทีสุด ขยายไปเลียงใน 15 ml flash โดยใส่อาหารเลียงเซลล์
ประมาณ 5ml วันต่อมาเพิมอาหารเลียงเซลล์อีก 5 ml
9. เมือ hybridoma โตจนเกือบเต็มพืน flash ให้ขยายเป็น 2 flash เมือ hybridoma เจริญจนเต็ม
พืน flashอีกครังให้เก็บนําเลียงมาเพือหาความแรง
10. เก็บ hybridoma ทีได้แช่แข็งในไนโตรเจนเหลวเพือเก็บไว้เป็นต้น Clone ต่อไป นําเลียงที
เก็บได้ทังหมด 20 ml เก็บไว้เพือทดสอบทาง Serology อย่างละเอียดเพือจัดจําแนกชนิด
ของแอนติบอดีต่อไป
การสร้างเซลล์สายพันธุ์เพือผลิตAnti-AและAnti-B ด้วยวิธี Human Monoclonal Hybridoma
การ Transform EB virus
1. ใส่ Whole blood group O 20-30 ml ลงในหลอดทดลองขนาด 50ml ปัน 3,000 rpm 7 นาที
2. ค่อย ๆ ดูดชันของ buffy coatซึงอยู่ด้านบนออกจาก packed red cell
3. ผสม buffy coatทีดูดออกมาได้กับPBS ในปริมาตรทีเท่ากัน
4. ใส่ ficoll ลงในหลอดขนาด 15 ml ค่อย ๆ ใส่ส่วนผสมของ buffy coat กับ PBS ลงบนผิวหน้า
ของ ficoll อย่างเบามือ โดยชันของbuffy coat กับPBS ลอยอยู่เหนือผิวหน้าของficoll
5. ปัน 2,200 rpm 12 นาที ชันของเม็ดเลือดขาว (T cell + B cell) สีขาวแยกอยู่ตรงกลางลอยอยู่
เหนือ ficoll ให้ดูดชันของเม็ดเลือดขาวออกมาใส่หลอดทดลองขนาด 15ml
6. ล้างด้วยPBS 2-3 ครัง ปันด้วยความเร็ว 2,500 rpm 7 นาที
7. เมือล้างเสร็จ resuspend เม็ดเลือดขาวใน PBS 5 ml นําไปผสมกับ 2% AET treated Sheep Red
Blood Cells (SRBC) 10 ml เพือแยกเม็ดเลือดขาว T cell ออกจาก B cell
8. Incubate ในตู้เย็น 4 °c นาน 1 ชังโมง
9. ดูดส่วนผสมของเม็ดเลือดขาวและเม็ดเลือดแดงแกะทีตกอยู่ก้นหลอดผสมกันอย่างเบามือ ใส่
ficoll ลงในหลอดขนาด 15 ml ค่อย ๆ ใส่ส่วนผสมลงบนผิวหน้าของ ficoll อย่างเบามือโดยให้
ส่วนผสมลอยอยู่เหนือผิวหน้าของ Ficoll
10. ปัน 1,600 rpm 30 นาที ดูดเม็ดเลือดขาวชนิด B cell ทีอยู่ชันกลางออกมาใส่หลอด 15 ml ล้าง
ด้วยPBS 2-3ครังปัน 2,500 rpm 7 นาที
11. ดูด supernantออก resuspendใน 5 ml PBS นับจํานวนเม็ดเลือดขาว B cellทีแยกได้
12. ปัน 2,500 rpm 7 นาที ดูด supernatantทิง ใส่ EB virus solution แล้วผสมให้เข้ากันดี

16. 16
13. Incubate 37 °c 75 นาที resuspend ด้วย RPMI/FCS+ ให้มีความเข้มข้นเซลล์ 2.5 x 105
cell/ml
ดูดใส่ 96 well plate หลุมละ 100 ul เลียงไว้จนกว่าจะเกิด clone
การทําHuman Cell Fusion
1. ย้ายเซลล์ทีสร้างแอนติบอดีหลัง Tranform ใส่ในหลอด 15 ml ปัน 1000 rpm 10 นาที
2. ดูด supernate ทิง ล้างอีก 3 ครังด้วยRPMI free serumปัน 1000 rpm 10 นาที นับเซลล์
3. เลียง JMS-3 (Human myeloma cell line) ใน flash 25 ml ไว้ประมาณ 1 สัปดาห์ จนมีปริมาณ
เซลล์มากพอจะทํา fusion นับเซลล์
4. ผสมเซลล์ทีสร้างแอนติบอดีหลัง Tranform กับ JMS-3 เข้าด้วยกันในอัตราส่วน 1:1 ปัน 1000
rpm 5 นาที
5. ค่อย ๆ ใส่ 50 PEG 1 mlลงในหลอดทดลองอย่างเบามือ ภายในเวลา 1 นาที
6. ใส่ RPMI free serum 10 ml ลงในหลอดทดลองอย่างเบามือ ภายในเวลา 30 วินาที
7. ปัน 1000 rpm 5 นาที ดูด supernate ทิง
8. Resuspend ใน HAT-ouabain +RPMI with serum โดยคํานวนให้มีความเข้มข้นเซลล์เท่ากับ 2.5
x 105
cell/ml ใส่ใน 96 well platesเลียงจนเกิด clone
การ Treat เม็ดเลือดแดงแกะด้วย AET (2-amino-ethyl-thio-isouronium bromind drobromind)
1. ล้างเม็ดเลือดแดงแกะด้วยPBS ปัน 3,000 rpm 5 นาที
2. ผสมเม็ดเลือดแดงแกะกับAET ในอัตราส่วน 1:4 Incubate 37 °c 10 นาที
3. ล้างเม็ดเลือดแดงแกะด้วยPBS 3 ครัง 3,000 rpm 5 นาที
4. ดูด supernate ทิง resuspensionใน Alsever solution เก็บไว้ใช้ได้1 เดือน
การเตรียมAET (2-amino-ethyl-thio-isouronium bromind hydrobromind Solution)
1. 1.5 กรัมAET ละลายในนํากลัน 50ml ปรับpH ให้เท่ากับ 8.4 ด้วย 10N NaOH
2. กรองสารละลายในข้อ 1 ด้วยfilter ขนาด 0.22uM
การเตรียมEpstein-Barr Virus (EBV)
1. เลียงเซลล์B95-8 จากลิงเล็ก ทีสร้างEBV ในอาหารเลียงเซลล์ที 37 °c เก็บแช่แข็งไว้เป็นสต๊อก
2. ละลายเซลล์B95-8 ทีแช่แข็งไว้เลียงใน 10ml RPMI with serum ด้วยflashเล็ก
3. เมือเซลล์โตจนได้ประมาณ 70% ของ flash ทํา suspension cell ให้มีความเข้มข้น 3x105
cells/ml แล้วขึน flashเล็ก flashใหม่ incubate 37 °C1 สัปดาห์ ทําจนครบ 100flash
4. เก็บนําเลียงเซลล์ทีมี Virus ปัน 3,000 rpm 5 นาที แล้วกรองด้วยหัวกรอง 0.22uM

17. 17
5. แบ่งใส่หลอดแช่แข็งหลอดละ 5 ml เก็บแช่แข็งที -80 °C
6. นํา supernant ทีเก็บได้ไปTransform cellเพือเปรียบเทียบกับsupernant lot เก่า
การเตรียมHAT-Ouabain selection medium (human) เข้มข้น 100 เท่า
1. Hypoxanthine (ความเข้มข้น 10 mg/ml) 13.61 ml
2. Aminopterin (ความเข้มข้น 10 mg/ml) 4.40 ml
3. Thymidine (ความเข้มข้น 10 mg/ml) 9.69 ml
4. 2’-Deoxycytidine (ความเข้มข้น 1 mg/ml) 2.27 ml
5. สารละลายข้อ 1-4 ผสมกัน เติมนํากลันให้ครบ 100ml
6. กรองHAT solution ด้วยหัวกรองขนาด 0.2mm
การเตรียม10-2
M Ouabain
ใส่ 58 mg Ouabain (SIGMA: O-3125) ในหลอดทดลองขนาด 15 ml เติม 10 ml PBS
การเตรียมHAT medium
1. 20% FCS with Medium 198 ml
2. HAT solution เข้มข้น 100 เท่า 2 ml
3. 10-2
M Ouabain solution 10 ul
4. ผสมข้อ 1-3 เข้าด้วยกัน
การทดสอบทาง Serology
การทดสอบ Transform cell
1. ดูดนําเลียงเซลล์100 ul แบ่งเป็น 2 plates plate ละ 50 ul
2. Plate หนึงทดสอบกับA cell 25 ul อีก plate หนึงทดสอบกับ B cell 25 ul
3. บันทึกผลว่าหลุมใด ให้ผลบวกกับ A cell หลุมใดให้ผลบวกกับ B cell และหลุมใดให้ผลบวก
ทังสอง cellใช้เป็นข้อมูลในการคัดเลือกหลุมทีให้ผลบวกเพือทํา cell fusion ต่อไป
การทดสอบ Fusion cell
1. ดูดนําเลียงเซลล์100 ul แบ่งเป็น 2 plates plate ละ 50 ul
2. Plate หนึงทดสอบกับA cell 25 ul อีก plate หนึงทดสอบกับ B cell 25 ul

18. 18
3. บันทึกผลว่าหลุมใด ให้ผลบวกกับA cellหลุมใดให้ผลบวกกับB cell
4. เลือกหลุมทีให้ผลบวกกับA cellและ B cellมาทํา limiting เพือคัดเลือก monoclone
การสร้างเซลล์สายพันธุ์หลังการฝึกอบรมดูงาน
1. วิธี Human Monoclonal Hybridoma เลียงขยาย JMS-3 human myeloma ทีได้รับจากญีปุ่นแช่แข็งไว้
เป็น stock ทําการ Transform เม็ดเลือดขาวทีสร้าง anti-Mia
จาก buffy coat แต่ยังไม่ประสบ
ความสําเร็จ
2. วิธี Murine Monoclonal Hybridoma ทําการฉีดหนูทังหมด 16 ตัว ด้วยวิธี Intraperitoneal Injections
และด้วยวิธี Foot pad Injection ใช้เซลล์เม็ดเลือดแดง group O MiVI และ MiIII แบ่งทํา 8 fusion แต่
ละ Fusion ใช้หนูสองตัว สามารถสร้าง anti-Nและ anti-M hybridoma ได้สําเร็จ มีรายละเอียดดังนี
สามารถสร้างเซลล์สายพันธุ์ไฮบริโดมาได้ทังสิน 1,513 โคลน เป็นโคลนทีให้ผลบวกกับ screening
cell O1(M+) หรือ O2 (N+) เพียงเซลล์เดียวจํานวน 361 โคลน แต่เมือย้ายเซลล์จากจานพลาสติก
เพาะเลียงเซลล์ขนาด 96 หลุม ไปเลียงในจานพลาสติกเพาะเลียงเซลล์ขนาด 24 หลุม โคลนที
อ่อนแอจะตายไป ส่วนโคลนทีเหลือส่วนใหญ่สูญเสียความสามารถในการสร้างแอนติบอดี แต่
อย่างไรก็ตามหลังทําการตรวจแยกชนิดของแอนติบอดีพบว่าเป็นไฮบริโดมาทีสร้าง anti-N จํานวน
4 โคลน คือ NBC-N1(139G3G2), NBC-N2 (9A3D9), NBC-N3(9A5B7)และ NBC-N4(7D3D5) เป็น
ไฮบริโดมา ทีสร้าง anti-M จํานวน 2 โคลนคือ NBC-M1(4D11) และ NBC-M2(7H3B7) แต่โคลนที
สร้าง anti-M NBC-M1 (4D11) ได้ตายไปก่อนทําเจือจางลดสัดส่วน (limiting dilution) จึงทําให้
สูญเสียโคลนนีไป ผลการทดลองดังแสดงในตารางข้างล่างนี
Table 1 Anti-M and anti-N identification usingidentification panel cells of National Blood Centre
Clone Identifical panel cells phenotypes (lot.56060 exp.13JUL 2013) conclusion
N+N+ M+M+ M+N+ M+M+ M+N+ M+N+ N+N+ M+M+ M+M+ M+N+ M+M+
O1 O2 O3 O4 O5 O6 O7 O8 O9 O10 O11
anti-N NBC-N1 (139G3G2) 4+ 0 4+ 0 4+ 4+ 4+ 0 0 4+ 0 Anti-N
anti-N NBC-N2 (9A3D9) 4+ 0 4+ 0 4+ 4+ 4+ 0 0 4+ 0 Anti-N
anti-N NBC-N3 (9A5B7) 4+ 0 4+ 0 4+ 4+ 4+ 0 0 4+ 0 Anti-N
anti-N NBC-N4 (9D3D5) 4+ 0 4+ 0 4+ 4+ 4+ 0 0 4+ 0 Anti-N
anti-M NBC-M2 (7H32B7) 0 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 0 4+ 4+ 4+ 4+ Anti-M
Remark: culture supernatants that used for identify harvesting while the hybridoma cells are still alive, 4+= one solid agglutination and 0= no agglutination

19. 19
Figure 1 Picture of antigen profile of identification panel cell lot. 56060 exp. 13 JUL 2013 of National Blood Center
Table 2 Anti-M and anti-N identification using papainized identification panel cells of National Blood Centre
Clone Papainized identification panel cells (lot 56060 exp. 13 JUL 2013)
N+N+ M+M+ M+N+ M+M+ M+N+ M+N+ N+N+ M+M+ M+M+ M+N+ M+M+
O1 O2 O3 O4 O5 O6 O7 O8 O9 O10 O11
anti-N NBC-N1(139G3 G2) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
anti-N NBC-N2(9A3D9) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
anti-N NBC-N3(9A5B7) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
anti-N NBC-N4(9D3D5) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
anti-M NBC-M2(7H32B7) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Remark: 0 = no agglutination

20. 20
Table 3Results of M and N antigen phenotyping using monoclonal anti-M and anti-N compare with rabbit polyclonal anti-M and anti-N
Remark: 4+ = one solid agglutination and 0 = noagglutination
Table 4Potency of anti-M and anti-N titers produced by murine hybridoma
Clone RBC Reciprocal of Murine HybridomaCulture Supernatant Dilution Titers
1 2 4 8 16 32 64 128 256
anti-M NBC-M2 (7H32B7) M+M+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ 0 128
M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 1+ 1+w
0 0 64
anti-N NBC-N1 (139G3G2) N+N+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 1+ 0 128
M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ 0 0 64
Remark: 4+ = one solid agglutination, 3+ = several large agglutination, 2+ = medium-size agglutination, clear background, 1+ = small
agglutination, turbid background, 1+w
= very small agglutination, turbid background and 0 =no agglutination
Donor Group Phenotype Anti-M
(Monoclonal)
NBC-M2 (7H32B7)
Anti-M
(Polyclonal Rabbit)
Lot. 56010exp. 7 JAN15
Anti-N
(Monoclonal)
NBC-N1 (139G3G2)
Anti-N
(Polyclonal Rabbit)
Lot. 55010 exp. 20 MAR 14
1 A M+M+ 4+ 4+ 0 0
2 A M+M+ 4+ 4+ 0 0
3 A M+M+ 4+ 4+ 0 0
4 A N+N+ 0 0 4+ 4+
5 A N+N+ 0 0 4+ 4+
6 A N+N+ 0 0 4+ 4+
7 A N+N+ 0 0 4+ 4+
8 A N+N+ 0 0 4+ 4+
9 A N+N+ 0 0 4+ 4+
10 A M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
11 A M+N+ 4+ 4 4+ 4+
12 A M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
13 A M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
14 B M+M+ 4+ 4+ 0 0
15 B M+M+ 4+ 4+ 0 0
16 B M+M+ 4+ 4+ 0 0
17 B M+M+ 4+ 4+ 0 0
18 B N+N+ 0 0 4+ 4+
19 B N+N+ 0 0 4+ 4+
20 B N+N+ 0 0 4+ 4+
21 B N+N+ 0 0 4+ 4+
22 B N+N+ 0 0 4+ 4+
23 B M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
24 B M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
25 B M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
26 B M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
27 AB N+N+ 0 0 4+ 4+
28 AB M+M+ 4+ 4+ 0 0
29 AB M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+
30 AB M+N+ 4+ 4+ 4+ 4+