Recommended
Recommended
More Related Content
What's hot
What's hot (20)
Izoelektrik fokuslama
- 2. 2 Elektriksel yük özelliklerine göre protein saflaştırma yöntemleri Elektroforez Proteinler, elektrik yükü, büyüklük, şekil gibi özelliklerine göre ayrılırlar İyon Değişim Kromatagrafisi Proteinleri, üzerlerinde taşıdıkları net yüke göre ayırır İzoelektrik fokuslama İzoelektrikfokuslama, proteinlerin bir pH gradientinde izoelektrik noktalarına göre ayrılması prensibine dayanır.
- 3. 3 İzoelektrik Fokuslama Zwitter iyon Amino grubu karboksilik asitin asidik hidrojeni alip, artı yüklü halde iken karboksilik asit grubu da hidrojenini verdiği icin eksi halde bulunur. Amino aitin bu formuna Zwitter iyon denir. Aa ler bundan dolayı; Zwitter iyon Katı beyaz kristal halde bulunma Suda yüksek çözünürlük özelliklerine sahiptir. Kısmen yüksek erime noktasına sahip olma
- 4. 4 İzoelektrik Nokta pI 01 02 03 04 Amino asit üzerindeki + yükün – yüke eşit olduğu pH değeridir Aa üzerindeki net toplamı yük 0’dır pI değeri aa’in zwitter formundaki COO- ve NH4 + gruplarının pKA değerlerinin aritmetik ortalamasıdır aa, pI üzerindeki ortamlarda negatif altındaki değerlerde pozitif yüklenir
- 6. 6 İzoelektrik Fokuslama pI V pH M pH gradiyenti Voltaj İzoelektrik nokta Yüksek Mobilite Özellikle izozimleri ya da özellikleri çok benzeyen proteinleri ayırmak için kullanılır
- 7. 7 İzoelektrik Fokuslamait’s about creating the tools so people take action pH gradienti düşük molekül ağırlıklı amfoterik maddelerin (amfolitler) yardımıyla oluşturulur. proteinler yüklerine göre anoda ve katoda doğru hareket ederler. Proteinler jel üzerinde net yüklerinin sıfır olduğu pH değerine ( pI ) kadar göç ederler ve bu noktada hareketsiz kalarak dururlar. Protein Örneği uygula Elektrik Alanı Yarat pH gradienti oluşturmak için sisteme akım verilir. ve amfolitler izoelektrik noktalarına göre jelde düzenlenirler . En asidik olan anoda, en bazik olanda katoda doğru ilerler. pH gradienti
- 8. 8 İzoelektrik FokuslamaElektrik Alana Etki eden faktörler Moleküllerin hareketi için yüksek voltaj ve uzun zaman gereklidir. Fakat ayırma çok hassas gerçekleşir. Voltaj Sistem yüksek gerilimde ve uzun süre çalıştığından ortamda sıcaklık artar ve soğutma şistemiyle soğutulması gerekir. Isı Akım Yüksek olması durumunda ısı çok çabuk yükselir Akım Direnç
- 13. 13
- 14. 14
- 15. 15 İzoelektrik noktaların okunmasıit’s about creating the tools so people take action
- 16. 16 2D Elektroforez •Kompleks karışımları ayıran hassas bir tekniktir, kalın bantları ayırır Sırasıyla izoelektrik odaklama ve SDS elektroforez kullanımı 2D elektroforez olarak adlandırılır •E.coli de binden fazla protein Ayrıldığı gözlemlenmiştir. 2D elektroforez, jelden ekstrakte edilme ile tamamlanır •pI ları aynı ağırlıkları farklı yada tam tersi durumdaki protein çiftelerini ayırır
- 18. 18Principle of 2-dimensional electrophoresis pH 3 pH 10 SDS-PAGE 200 kD 20 kD + - - + IEF: izoelectrik fokusing
- 19. 19 Analiz 20% Jelden amfolitlerin uzaklaştır Çünkü amfolitler jelin tamamen boyanmasına neden olur. En çok kullanılan boyar madde “Coomassie blue” veya Daha duyarlı bir boyama tekniği ise gümüş boyama ile boyanarak gerekli analizler yapılır
- 20. 20 Sonuç Olarak IEF Karışım içinde bulunan protein sayısını tespit etmek Proteinlerin saflaştırıl- masında kullanılmaz ! Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini belirlemek Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını tayin etmek
- 21. 21 Teşekkürler