Kromatografi

KROMATOGRAFİ
Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri
sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle
karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve
saflaştırılması yöntemidir.

KROMATOGRAFİ
İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903)
tarafından geliştirilen bir yöntemdir.
Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin
renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır.
Kullandığı kolonda renkli bandlar
oluştuğundan, bu ayırma yöntemine
kromatografi adını vermişti

KROMATOGRAFİ
Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından
1 cm kadar yukarısına bir damla siyah
mürekkep damlatınız.

Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız
kısım su hizasının üstünde kalacak
şekilde su tankına batırınız ve dik bir
şekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiyle
kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken
mürekkebi çözer ve sürüklemeye
başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler
kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek
ayrılmış olur.

KROMATOGRAFİ
Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri
sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle
karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve
saflaştırılması yöntemidir.

Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit faz
üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya
sürüklenmeleri esasına dayanır.

Kromatografi ‘nin Sınıflandırılması

Ayrılma Mekanizmalarına Göre
Uygulama Biçimine Göre
Faz Tiplerine Göre


Ayrılma Mekanizmalarına Göre
• Adsorpsiyon kromatografisi
• Partisyon kromatografisi
• İyon değiştirme kromatografisi
• Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi
• İyon çifti kromatografisi
• Afinite kromatografisi


Uygulama Biçimine Göre
- Düzlemsel kromatografi
Kağıt kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi (TLC)
- Kolon kromatografisi
Gaz kromatografisi (GC)
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)


Faz Tiplerine Göre
- Sıvı kromatografisi
Sıvı-Katı kromatografisi
Sıvı-Sıvı kromatografisi
- Gaz kromatografisi
Gaz-Katı kromatografisi
Gaz-Sıvı kromatografisi

Ayrılma Mekanizmasına Göre
Adsorpsiyon Kromatografisi
Adsorpsiyon, bir karışımda bulunan sıvı veya gaz halindeki maddelerin katı
faz üzerine tutunmasıdır. Adsorpsiyon kromatografisi ise örnek bileşenlerinin
dolgu maddesinin yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen
bir ayırma işlemidir.
Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler katı olan sabit faz ile sıvı veya gaz
olan hareketli faz arasında etkileşir.

Faz tiplerine göre adsorpsiyon kromatografisi sıvı-katı
gaz-katı kromatografisidir.

Sabit faz : Durgun veya hareketsiz fazdır
Hareketli faz : Sabit faz üzerinde hareket ederek numune bileşenlerinin
ayrılmasını sağlayan fazdır

Adsorpsiyon Kromatografisi

Sabit faz

Ayrılması gereken maddeleri parçalamamalı

Ayrılması beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon vermemeli

Adsorpsiyon kapasitesi yüksek olmalı

Adsorpladıkları maddeleri kolaylıkla geri vermeli

Dağılma (Partisyon) Kromatografisi
Dağılma kromatografisinde; maddeler sıvı olan sabit faz ile sıvı veya gaz
olan hareketli faz arasında dağılır.
Birbiriyle karışmayan iki sıvıdan, yani iki fazdan oluşan bir faz sistemi içine
konulan madde bu sıvılardaki çözünürlüğüne bağlı olarak iki faz arasında
dağılır ve dengeye ulaşır. Böyle bir sistemde maddelerin dağılması sabit olup
dağılma katsayısı ile ifade edilir ve Kd ile gösterilir. Böylece Kd değerleri
birbirinden farklı olan maddeler kromatografik sistem içersinde farklı hızlarda
ilerleyerek birbirlerinden ayrılırlar.
Kd = C1/C2 C1 : Maddenin 1. fazdaki derişimi

C2 : Maddenin 2. fazdaki derişimi

Faz tiplerine göre partisyon kromatografisi sıvı - sıvı
sıvı - gaz kromatografisidir.

Destek:Dağılma kromatografisinde, sıvı sabit fazın adsorplandığı materyaldir.

İyon Değiştirme Kromatografisi
Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer
miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır.
İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon
değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına
göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi
veya katyon değiştirme kromatografisi olarak
adlandırılır.
Cl- ve I- karışımının nitrat bağlanmış anyon
değiştirici RNO3 ile bileşenlerine ayrılmasında
Anyon I-
Değiştirici geçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir:
Cl- Cl- + RNO3 RCl + NO3-
I- + RNO3 RI + NO3-

R: Çözünmeyen Matriks RNO3 : Anyon Değiştirici


İnorganik iyon değiştiriciler :

Na2Al2Si4O12 ⇒ Ca2+ Fe2+ Mn2+ Mg2+
Na2P

Organik iyon değiştiriciler:

Anyonik, Katyonik ve Amfoter Reçineler

İyon değiştirmeyi etkileyen faktörler
Hareketli faz derişimi
Hareketli faz pH’sı
Kompleks oluşturucu etki

İyon değiştirme kromatografisinin uygulanması
Ayrılmaları güç olan bazı iyonları ve asitlerin
Aminoasitler
Seyreltik iyon çözeltileri deriştirmede
Asit ve baz elde edilmesinde

NaCl ↔ NaOH + Cl-

Jel Filtrasyon (Moleküler Eleme) Kromatografisi
Karışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına
dayanır.

İyon Çifti Kromatografisi

Bu teknik, özellikle iyonlaşabilen asidik veya bazik maddelerin ayrılmasında
kullanılır. Hareketli faza ilave edilen iyon çifti reaktif sabit faz tarafından
adsorplanır ve iyonize olmuş maddeler bu iyon çiftleri ile iyonik etkileşime
girerek birbirinden ayrılır.

Afinite Kromatografisi
Seçiciliği fazla olan bu yöntem,
kromatografi tekniklerinin en yenisidir.
Antijen – Antikor
Enzim – Substrat
Reseptör – İlaç
gibi oldukça spesifik etkileşimlere
dayanır.

Düzlemsel Kromatografi

UV Lambası

Kolon Kromatografisi

1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken
kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı.
Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina
kullanılmaktadır.


Gaz Kromatografi (GC)

Yüksek Performanslı Sıvı
Kromatografi (HPLC)


Gaz Kromatografi
(GC)

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi
(HPLC)

YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ
HPLC

Sıvı Kromatografisi: Sıvı kromatografisi düzlemsel yüzeylere ve kolonlara uygulanabilen
bir kromatografi türüdür.

Normal Faz Sıvı Kromatografisi:
Polar sabit faz ve apolar veya düşük polariteye sahip hareketli faz
Ters Faz Sıvı Kromatografisi:
Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır

HPLC

- Polar molekül
- Apolar molekül

Tanecik Apolar faz Hareketli faz

Kolon Normal-faz Ters-faz
Sabit Faz Polaritesi Yüksekten ortaya Ortadan düşüğe
Çözücü Polaritesi Ortadan düşüğe Yüksekten ortaya
Örnek Çıkış Yeri Apolar önce Polar önce

HPLC

Ters faz
C18
C8
C2

Normal faz


Ters faz kromatografisinin avantajları

1. Normal faz kromatografide, sıvı fazın kontrolü çok önemli ve kritiktir.
Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda belirgin
farklılıklara neden olabilir.
2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide çok yavaştır.
3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve
yayvan piklere sebep olur.
4. Apolar çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.


Sıvı kromatografisi yönteminin özel bir uygulaması olan yüksek performanslı
sıvı kromatografisi (HPLC) yönteminde, sabit faz olarak kullanılan dolgu
maddelerinin tanecik boyutunun küçültülmesi sonucu hareketli faz ile etkileşen
sabit faz yüzey alanı büyür ve böylece kolonun etkinliği arttırılmış olur. Çok sıkı
olarak doldurulmuş kolondan hareketli fazın belirli bir hızla geçebilmesi için
basınç uygulanması gerekir.

3 bar


HPLC’nin avantajları
• HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez
kullanılabilir.
• HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve
tekrarlanabilirlik daha yüksektir.
• Nicel analiz kullanılabilir.
• Analiz süresi kısadır.
• Duyarlık yüksektir.


HPLC Cihazı

•
Pompa Kolon
Dedektör
Enjektör
Hareketli faz
rezervuarı

Kromatografide Temel Parametreler

Alıkonma Zamanı ve Alıkonma Hacmi


Alıkonma Zamanı ve Alıkonma Hacmi
tr1
Dedektör

t0
cevabı

Zaman veya Hacim

t0 = Hareketli fazın alıkonma zamanı
tr = Alıkonma zamanı


Kapasite Faktörü

Alıkonma hacmi = VR = Vm + KVs

Akış hızı sabitse tr – t0
k' = (VR – V0) / V0 k′ = t
0

k' = K Vs / Vm
1 < k′ < 10

Etkinlik
2 2 2
16 t r
tr 5 . 55 t r
N = N= =
σ 2
w 2
w1 2
2

h
w1/2
1/2h
w

t0 tr

Seçicilik

İki maddeye ait kapasite faktörü oranına

α = k'2 / k'1 = (tR2 – t0) / (tR1 – t0)

Seçicilik, esas olarak sabit faz özelliklerine bağlıdır
ancak hareketli faz bileşimi de seçiciliği etkiler.

Ayırıcılık

R=0.50 R=0.75

t0 zaman t0 zaman

R≥1 R=1.00 R=1.50

t0 zaman t0 zaman

Ayırıcılık

R = 2 (t R2 – t R1) / (w1 + w2)

Nicel Analiz İçin HPLC’de Kullanılan Kalibrasyon Teknikleri:

Doğrudan Kalibrasyon Tekniği:
Alan
veya
Pik Yüksekliği

Derişim (ppm) Alan

S1 10 101
S2 20 212 Cx Derişim
S3 30 305
S4 40 410

İç Standart Tekniği:

IS N
Concentration

0 2 4 6 8 10 12
time

Yüksek kesinlik elde edilir; çünkü bu metot ile numune enjeksiyonu,
akış hızı ve kolon şartlarındaki değişmelerle oluşan belirsizlikler en
aza indirilir.


Derişim Alan
Derişim
Derşim IS oranı Numune IS Alan oranı
5 25,00 0,20 1881 16129 0,12
10 25,00 0,40 4495 17126 0,26
30 25,00 1,20 13430 15940 0,84
50 25,00 2,00 25001 16846 1,48
100 25,00 4,00 50141 16557 3,03

Bu metotta, standart ve numune çözeltilerinin her birisine dikkatle
ölçülmüş miktarda bir iç standart (IS) katılır.

4 y = 0,0307x - 0,0515
3 R2 = 0,9998
3
Alan oranı

2
2
1
1
0
0 20 40 60 80 100 120
Derişim

4 y = 0,7681x - 0,0515
3 R2 = 0,9998
3
Alan oranı

2
2
1
1
0
0 1 2 3 4 5
Derişim oranı


Standart Ekleme Tekniği:

Alan
600
500
400
300 y = 980x + 152
200 R2 = 0,9996
100
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Derişim (M)

Kromatografi

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

More from Betül Kaplan

More from Betül Kaplan (13)

Kromatografi