kỹ thuật sử dụng KHV, làm tiêu bản,

1. CHƯƠNG 8
QUAN SÁT TẾ BÀO VÀ CÁC THÀNH PHẦN CỦA TẾ BÀO
8.1 CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI
Kính hiển vi (microscope) là thiết bị để quan sát các vật thể có kích thước rất nhỏ mà mắt
thường không nhìn thấy được.
Hình ảnh hiển vi của vật thể được phóng đại thông qua một hoặc nhiều thấu kính, hình
ảnh này nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của thấu kính (hoặc các thấu kính). Khả
năng quan sát của kính hiển vi được quyết định bởi độ phân giải.
Năm 1590, hai cha con thợ làm kính mắt người Hà Lan: Hans Janssen và Zaccharias
Janssen đã phát minh ra kính hiển vi đầu tiên. Sau đó, Anton van Leeuwenhoek (1623 -
1732), Hà Lan, là người đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi để quan sát tế bào hồng cầu, nấm, vi
khuẩn, tinh trùng và các vi sinh vật trong nước..
Robert Hook (1635 – 1703) đã sử dụng nguồn sáng để quan sát thế giới vi sinh vật
bằng kính hiển vi, ông cũng chính là người đầu tiên quan sát được cấu trúc tế bào. Cuốn sách
“Hình ảnh hiển vi” được xuất bản năm 1665 đã mô tả rất nhiều đối tượng mà mắt thường
không nhìn thấy được. Ông cũng được tôn vinh là “Cha đẻ của khoa học hiển vi người Anh”.
Tuy nhiên, một số nhóm kính hiển vi có thể được tóm lược như sau:
+ Kính hiển vi quang học (kính hiển vi ánh sáng truyền qua, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi
phản pha, kính hiển vi soi ngược, kính hiển vi phân cực, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển
vi đồng tụ,…)
+ Kính hiển vi điện tử (kính hiển vi điện tử truyền qua - TEM, kính hiển vi điện tử quét -
SEM,…)
+ Kính hiển vi quét đầu dò (kính hiển vi lực nguyên tử - AFM, kính hiển vi quét chui hầm -
STM, kính hiển vi quang học quét trường gần – SNOM,…)
8.1.1 – Kính hiển vi quang học và huỳnh quang
a. Nguyên tắc hoạt động:
a1.Kính hiển vi quang học:
Sử dụng chùm sáng chiếu vào mẫu vật -> Xuyên qua 2 thấu kính -> Gửi hình ảnh
phóng to đến mắt

2. Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi ánh sáng truyền qua
a2. Nguyên lý hoạt động Kính hiển vi huỳnh quang
Sơ đồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang hoạt động dựa trên nguyên lý sử dụng ánh sáng có bước
sóng ngắn, năng lượng cao để kích thích các điện tử nội tại trong phân tử của mẫu nhảy lên
quỹ đạo cao hơn (có mức năng lượng cao hơn). Khi các điện tử này quay trở lại quỹ đạo cũ
(có mức năng lượng ban đầu khi chưa bị kích thích) chúng phát ra một ánh sáng có bước sóng

3. dài hơn, năng lượng thấp hơn (thường nằm trong phổ ánh ánh sáng nhìn thấy) để tạo ra hình
ảnh huỳnh quang.
Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn xenon hoặc thủy ngân để tạo ra ánh sáng tia
cực tím, qua bộ lọc để dẫn vào kính và đi đến gương lưỡng hướng sắc - loại gương có khả
năng phản xạ dải bước bước sóng nhất định và cho phép một dải bước sóng khác đi qua.
Gương này phản xạ ánh sáng tia cực tím lên mẫu để kích thích huỳnh quang nội tại trong các
phân tử của mẫu. Vật kính sẽ thu lại những ánh sáng có bước sóng huỳnh quang được tạo ra
đi đến gương lưỡng hướng sắc và thông qua một bộ lọc (để loại bỏ những ánh sáng không có
bước sóng huỳnh quang) dẫn đến thị kính để tạo ảnh huỳnh quang.
b. Cấu tạo
b1. Kính hiển vi quang học
Gồm các bộ phận chủ yếu sau:
- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen).
- Tụ quang để hội tụ chùm sáng
- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng (nếu có)
- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)
- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)
- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi
quan sát
- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua
mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có
thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật
lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x.
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)
- Ống nối với camera (nếu có).
Hình 1. Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (Eclipse 90i, Nikon)

4. (Phòng thí nghiệm hiển vi điện tử - Viện VSDTTƯ. Ảnh: Quang Huy)
b2. Kính hiển vi huỳnh quang
Gồm các bộ phận chủ yếu sau :
- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen)
- Nguồn sáng kích thích huỳnh quang (đèn hơi thủy ngân, đèn hồ quang xenon…)
- Tụ quang để hội tụ chùm sáng
- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng
- Gương lưỡng hướng sắc (hoặc bộ phân chia chùm tia lưỡng sắc)
- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)
- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)
- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi
quan sát.- Vật kính : là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên
qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có
thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính : là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật
lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)
- Ống nối với camera
Hình 4. Cấu tạo của kính hiển vi huỳnh quang (Nikon)
c. Quy trình sử dụng kính hiển vi
c1. Kính hiển vi ánh sáng truyền qua
i. Bật công tắc khối nguồn
ii. Nhấn công tắc khởi động trên kính
iii. Đưa bộ lọc sáng vào trục quang học (nếu có)
iv. Chỉnh tâm hai thị kính vào trục quang học
v. Tăng tụ quang (nếu có) đến vị trí cao nhất (sử dụng núm hội tụ tụ quang)
vi. Lựa chọn vật kính 10x đưa vào trục quang học

5. vii. Mở hoàn toàn màn chắn sáng và khẩu độ
viii. Đưa mẫu và dịch chuyển giá đỡ mẫu đến vị trí phù hợp để quan sát
ix. Điều chỉnh độ hội tụ
x. Điều chỉnh diop và thị kính phù hợp với mắt
xi. Điều chỉnh độ hội tụ và chuẩn tâm tụ quang
xii. Lựa chọn vật kính có độ phóng đại mong muốn (lưu ý: khi thay đổi vật kính, có thể
không quan sát được hình ảnh của mẫu, do đó phải điều chỉnh độ hội tu và khoảng
cách giữa vật kính và mẫu).
xiii. Khi chụp ảnh hoặc quan sát mẫu bằng camera, phải mở chốt ngăn trục quang học (chốt
này thường ở ngay dưới ống nối camera)
xiv. Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết thúc
C2. Kính hiển vi huỳnh quang
Quan sát ảnh hiển vi trường sáng
i. Bật công tắc nguồn
ii. Bật công tắc khởi động kính và điều chỉnh độ sáng thích hợp
iii. Đưa các bộ lọc ánh sáng vào trục quang học (ví dụ: đưa các bộ lọc ND8, ND32 và
NCB11 đến chế độ IN ở kính Eclipse 90i, Nikon).
iv. Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học để quan sát bằng hai thị kính.
v. Nâng tụ quang lên vị trí cao nhất (ví dụ: sử dụng núm chỉnh hội tụ tụ quang ở kính
Eclipse 90i, Nikon).
vi. Chọn vật kính 10x vào trục quang học
vii. Mở hoàn toàn màng chắn trường và màng chắn khẩu độ
viii. Đưa mẫu lên giá và dịch chuyển giá mẫu (lên, xuống hoặc/và theo chiều ngang, dọc)
đến trường quan sát
ix. Chỉnh hội tụ mẫu.
x. Chỉnh điốp và khoảng cách giữa các thị kính để phù hợp với mắt quan sát
xi. Chỉnh núm hội tụ tụ quang và chỉnh tâm tụ quang bằng các vít (cố định mâm tụ quang
xoay).
xii. Chọn vật kính thích hợp để quan sát mẫu
Quan sát hình ảnh huỳnh quang
xiii. Hạ thấp tụ quang đến vị trí thấp nhất
xiv. Tắt nguồn sáng truyền qua (diascopic)
xv. Đưa bộ lọc ánh sáng kích thích vào trục quang học
xvi. Mở hoàn toàn màng chắn khẩu độ cho ánh sáng kích thích huỳnh quang
xvii. Kiểm tra cửa trập cho ánh sáng kích thích huỳnh quang đã đóng và mở nguồn sánh
kích thích huỳnh quang.
xviii. Mở cửa trập của ánh sáng kích thích huỳnh quang và chỉnh tâm đèn.
xix. Đưa vật kính 10x vào trục quang học
xx. Đưa mẫu vào giá đỡ và và dịch chuyển giá mẫu (lên, xuống hoặc/và theo chiều ngang,
dọc) đến trường quan sát
xxi. Chỉnh hội tụ
xxii. Chỉnh tâm màng chắn trường

6. xxiii. Chọn vật kính thích hợp để quan sát mẫu
xxiv. Để ghi lại hình ảnh hiển vi bằng camera, ta thực hiện các bước sau:
+ Chỉnh kính để quan sát hình ảnh rõ ràng trước
+ Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học sang chế độ hiển thị trên camera
+ Điều chỉnh đầu camera đến đúng vị trí để đạt được hình ảnh rõ nét nhất trên màn hình.
+ Thiết lập các chế độ cài đặt của camera
+ Lựa chọn chế độ camera phù hợp cho đối tượng quan sát
+ Chỉnh chuẩn camera và hình ảnh
+ Chụp và lưu lại hình ảnh.
xxv. Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết thúc
d.Duy trì, bảo dưỡng, hiệu chuẩn thiết bị
- Đặt kính ở nơi khô thoáng, không bị nấm mốc.
- Giữ các vật kính và thị kính trong hộp để nơi khô thoáng cùng với chất hút ẩm (túi
silicagel, nếu có).
- Tắt nguồn điện và đợi cho nguồn sáng (bóng đèn) nguội hẳn rồi mới che đậy thiết bị.
- Khi không sử dụng kính, phải che phủ cẩn thận để tránh bụi.
- Kính hiển vi phải được hiệu chuẩn và bảo dưỡng định kỳ hệ quang học trong kính theo
hướng dẫn của nhà sản xuất (thường từ 3 – 6 tháng/lần). Giữ liên lạc thường xuyên với đại
diện của hãng kính hiển vi hoặc đại lý phân phối tại Việt Nam.
e. Quản lý thiết bị
- Phải có người phụ trách kỹ thuật và trang thiết bị: hiểu rõ về nguyên lý cũng như cách sử
dụng kính hiển vi, chịu trách nhiệm về tình trạng của kính.
- Có sổ theo dõi sử dụng kính hiển vi: ghi ngày, giờ sử dụng; mẫu quan sát; người sử dụng;
tình trạng của kính trước và sau khi sử dụng.
- Khi kính hiển vi có sự cố phải thông báo ngay với cấp trên và liên hệ sửa chữa, bảo dưỡng
với kỹ sư đại diện ở Việt Nam của hãng sản xuất kính.
- Khi kính hiển vi bị hỏng không thể khắc phục, phải báo với bộ phận có thẩm quyền để thanh
lý thiết bị theo quy định, không tự ý thanh lý thiết bị.
f. Lưu ý khi sử dụng
- Kiểm tra sổ theo dõi sử dụng kính để biết tình trạng của kính.
- Kiểm tra nguồn điện, nguồn sáng cho kính.
- Lau chùi bụi của kính hàng ngày bằng khăn lau sạch
- Không được làm xước, làm bẩn thấu kính, bộ lọc. Nếu thấu kính hay bộ lọc bị bẩn phải lau
chùi bằng giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen hoặc cồn.
- Không để đèn phát sáng bị bẩn.
- Không chạm tay vào nguồn sáng, dễ bị bỏng.
- Nguồn sáng tia cực tím của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến sức khỏe.
- Sử dụng dầu nhúng khi quan sát với vật kính có độ phóng đại lớn (tùy theo từng loại kính và
mẫu quan sát)
- Khi kết thúc quá trình quan sát mẫu, phải tắt nguồn điện và che phủ kính cẩn thận.

7. - Ghi vào sổ theo dõi sử dụng kính.
8.1.2. Kính hiển vi điện tử
Là nhóm kính hiển vi mà ở đó nguồn bức xạ ánh sáng được thay thế bằng các chùm điện
tử hẹp được tăng tốc dưới hiệu điện thế từ vài chục kV đến vài trăm kV. Thay vì sử dụng
thấu kính thủy tinh, kính hiển vi điện tử sử dụng các thấu kính từ để hội tụ chùm điện tử, và
cả hệ được đặt trong buồng chân không cao.
Kính hiển vi điện tử có độ phân giải giới hạn bởi bước sóng của sóng điện tử, nhưng do
sóng điện tử có bước sóng rất ngắn nên chúng có độ phân giải vượt xa các kính hiển vi
quang học truyền thống, và kính hiển vi điện tử truyền qua hiện đang là loại kính hiển vi có
độ phân giải tốt nhất tới cấp độ hạt nguyên tử. Ngoài ra, nhờ tương tác giữa chùm điện tử với
mẫu vật, kính hiển vi điện tử còn cho phép quan sát các cấu trúc điện từ của vật rắn, đem lại
nhiều phép phân tích hóa học với chất lượng rất cao.
Năm 1924 trong luân án tiến sĩ của mình,Louis De Broglie đưa ra giả thuyết:Các hạt vi
mô điều có tính chất sóng,hạt có động lượng P=mv ứng với sóng có bước sóng có bước
sóng λ=h/p=h/mv .Không lâu sau,năm 1927 ,thí nghiệm về nhiễu xạ điện tử cho thấy đúng
là điện tử(electron)có tính chất sóng,và bước sóng giống như công thức của de Broglie.Tính
toán ra, dùng điện trường tăng tốc điện tử thì khi V=50kV bước sóng của điện tử là
λ=0,005nm ,còn khi V=100kVthì bước sóng điện tử là λ=0,0037nm.
Vậy thay cho ánh sáng, dùng tia điện tử để làm kính hiển vi, năng suất phân giải sẽ
không bị hạn chế do bước sóng dài như ở kính hiển vi quang học nữa. Còn về thấu kính, thì
có thể dùng điện từ trường để lái đường đi của điện tử,tức là dùng thấu kính điện tử.
Trên cơ sở suy nghĩ trên,năm 1931 chiếc kính hiển vi điện tử truyền qua đầu tiên đã
được chế tạo.
Có thể đối chiếu kinh hiển vi điện tử truyền qua với kính hiển vi quang học để thấy,2
loại kính khác nhau rất cơ bản,nhưng vẫn có chỗ tương đồng là khuyếch đại bằng thấu
kính.thay cho bóng đèn tạo ra ánh sáng,ta dùng sóng điện tử tạo ra tia điện tử và được tăng
tốc bằng hiệu điện thế từ 50kV đến 100kV.Thay cho vật kính và thị kính bằng thuỷ tinh,ở đây
vật kính và thị kính điều là thấu kính điện từ. Đó là các cuộn dây điện có lỗi rỗng bằng sắt
non,hình dạng đặc biệt. Dòng điện chạy trong cuộn dây lớn hay nhỏ sẽ làm cho lỗi sắt non bị
từ hoá nhiều hay ít và chùm tia điện tử sẽ hội tụ gần hay xa. Nói cách khác, tiêu cự của thấu
kính điện từ có thể thay đổi được bằng cách thay đổi dòng điện qua thấu kính.
Một điều rất khác với kính hiển vi quang học,là tia điện tử cần điện thế cao để tăng tốc,
nếu trên đường đi của điện tử có các phân tử không khí thì điện tử sẽ va chạm và bị tán xạ rất
mạnh. Do đó, ở kính hiển vi điện tử truyền qua,từ nơi điện tử phát ra, qua các thấu kính,cho
đến nơi tạo ảnh cuối cùng, điều phải bảo đảm là chân không cao,cỡ 10-5torr. Khi làm việc,
thân máy phải được hút chân không. Năng suất phân giải của kính hiển vi điện tử truyền qua
thật tuyệt vời, loại trung bình có năng suất phân giải là 1nm, loại tốt năng suất phân giải có
thể hơn 0,1nm.

8. Việc khó có thể đạt năng suất phân giải cao hơn nữa không phải là do bước sóng λ của
tia điện tử mà là do khó chế tạo hoàn chỉnh các thấu kính điện từ.
Từ khi có kính hiển vi điện tử truyền qua,con người đã có những bước tiến vượt bậc, đi
sâu, quan sát kĩ thế giới nhỏ bé. Các nhà sinh vật thấy được cấu trúc chi tiết của tế bào,những
loại siêu vi trùng gây ra dịch bệnh. Các nhà khoa học vật liệu thấy được những loại sai hỏng
trong cách sắp xếp các nguyên tử tạo thành tinh thể với kính hiển vi điện tử thì dễ dàng thực
hiện phương pháp nhiễu xạ điện tử, vì chùm tia điện tử là 1 chùm sóng đơn sắc còn mẫu tinh
thể là cách tử không gian 3 chiều. Ảnh nhiễu xạ phối hợp với ảnh hiển vi cho biết rất nhiều
thông tin về cấu trúc vật chất. Bên cạnh những ưu điểm,kính hiển vi điển tử truyền qua, hay
nói đúng hơn phương pháp hiển vi điện tử truyền qua cũng có 1 số nhược điểm.
Trước hết, mẫu nghiên cứu ở kính hiển vi điện tử truyền qua phải là lát rất mỏng vào
cỡ hàng chục nm,có thế điện tự mới truyền qua được. Nhiều trường hợp rất khó làm mẫu
thành lát mỏng, lát mỏng làm ra dễ bị méo mó biến dạng, hình ảnh quan sát được không trung
thực, bị giả tạo.mặt khác mẫu phải đạt trong chân không cao, nếu mẫu ướt, có chất dễ bay hơi
thì khi đưa vào kính hiển vi, mẫu bị bay hơi biến dạng.
Ngoài ra, ở đây cũng dùng phương pháp tạo ảnh phóng đại bằng cách ghép thấu kính,
nên mẫu phải là lát phẳng,ảnh có độ phóng đại rất tốt theo 2 chiều ngang,dọc nhưng không
cho biết chính xác về chiều cao trên mẫu.
8.2 Làm tiêubản
8.2.1. Cố định mẫu :
a. Các cách cố định :
+ Cố định bằng nhiệt : hơ nóng tiêu bản cắt qua ngọn lửa đèn cồn 3 lần trong khoảng 3
giây
+ Cố định bằng hoá chất :

9. - Cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu
trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao.
- Người ta thường dùng các hoá chất là rượu và axêtôn để cố định vết bôi.
- Cách cố định : Có thể thực hiện một trong những cách sau :
+ Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 950 ngâm vết bôi từ 5 – 15 phút. Với rượu
mêtylíc ngâm khoảng 2 - 5 phút.
+ Ngâm vết bôi vào dung dịch axêtôn trong 5 phút.
+ Nhỏ vài giọt rượu 90 - 950 lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy
vài lần rồi để khô.
b. Tác dụng của cố định tiêubản:
• Làm tế bào đính chặt vào lam kính để không bị trôi trong quá trình nhuộm.
• Giết chết tế bào.
• Làm cho tế bào dễ bắt màu hơn
8.2.2 Nhuộm mẫu: nhuộm đơn, nhuộm kép, nhuộm huỳnh quang
Nguyên tắc :
- Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành
phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững.
- Tuỳ theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế
bào mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp.
- Có 2 cách nhuộm chính :
+ Nhuộm đơn : Chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.
+ Nhuộm kép : Dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.
a. Cách nhuộm đơn :
- Đặt tiêu bản lên cầu thuỷ tinh (đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thuỷ tinh).
- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl, để yên từ 1 - 2 phút.
- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ
qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa
- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn
- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 40) rồi chuyển sang vật kính (x 100) dùng dầu soi.
b. Cách nhuộm kép:
Nguyên tắc của việc nhuộm kép:
+ Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phần khác nhau của một cấu trúc thường có
tính chất lý học, hoá học cũng như khả năng bắt màu khác nhau.

10. + Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta có
thể quan sát và phân biệt các cấu trúc dễ dàng hơn.
Thông thường trong thực tập giải phẫu thực vật, mẫu vật thường được nhuộm kép với
thuốc nhuộm xanh metylen và đỏ Cacmin.
Quá trình nhuộm kép:
+ Mẫu cắt được ngâm trong dung dich tẩy màu ( nước Javen hay dung dịch
clorammin5%) trong 15- 20 phút để tẩy sạch nội chất của tế bào.
+ Rửa sạch bằng nước cất hay dung dịch axetic 1% để loại thuốc tẩy màu.
Nếu mẫu vật có tinh bột thì phải bỏ tinh bột bằng cloran hydrat ( một phần tinh thể,
một phần nước tính theo trọng lượng) trong 15 đến 30 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước
cất.
+ Nhuộm xanh bằng xanh metylen loãng ( 1/1000- 1/10000 trongnước cất) từ 10 giây
đến 1-2 phút ( thời gian nhuộm tuỳ nồng độ của thuốc nhuộm). Mẫu vật nhuộm trong
dung dịch đặc với thời gian ngắn thì không đẹp bằng mẫu nhuộm lâu trong dung dịch
loãng.
+ Rửa sạch bằng nước cất 3 lần.
+ Nhuộm đỏ bằng dung dịch Cacmin trong 20 phút đến 1 giờ.
+ Rửa lại bằng nước cất.
Sau đó lên kính bằng nước cất hay glyxerin, quan sát dưới KHV ta sẽ thấy những tế
baò có màng bằng xenluloza thì bắt màu đỏ còn những tế bào có màng đã hoá gỗ bắt màu
xanh.
Ngoài ra ta có thể dùng các cặp thuốc nhuộm khác để nhuộm kép như sau:
- Lục metyl – cacmim: màng tế bào bằng xenluloza bắt màu đỏ và màng tế bào hoá gỗ
bắt màu xanh lục.
-Lục metyl – fucsin: màng tế bào hoá gỗ bắt màu tím, phần còn lại có màu xanh lục.
-Hematoxylin- Safarin: màng tế bào hoá gỗ bắt màu đỏ, phần còn lại có màu xanh tím..
* Nhuộm nhân:
- Cacmin- axetic: mẫu vật cần nhuộm được đun trong thuốc nhuộm chừng vài phút rồi
lên kính bằng một giọt cacmin- axetic mới, nhân tế bào có màu đỏ đậm.
-Hematoxylin: nhuộm 3- 5 phút, nhân tế bào bắt màu xanh đen.
- Lục metyl – fucsin: nhuộm trong 10 phút, nhân tế bào bắt màu xanh lục.
c. Nhuộm huỳnh quang
c1. Thuốc nhuộm huỳnh quang

11. Một số sinh vật trong các sóng ngắn thành phần hóa học phổ chiếu xạ một cách tự
nhiên kích thích huỳnh quang, được gọi là tự phát huỳnh quang (Primaryfluorescence). Chẳng
hạn như một số loại vitamin (A, B2), sắc tố sinh học, chất béo, chất xơ đàn hồi, vv tự phát
huỳnh quang dưới kính hiển vi và các hiệu ứng hình ảnh hiệu ứng màu sắc rất yếu, và thời
gian hình ảnh là ngắn. Các mẫu sinh học được điều trị bằng một loại thuốc nhuộm huỳnh
quang sau khi chiếu xạ trong quang phổ sóng ngắn có thể truyền cảm hứng cho huỳnh quang
rực rỡ, được gọi là huỳnh quang thứ cấp, huỳnh quang hiệu ứng hình ảnh hiệu ứng màu sắc
trung học và rất mạnh mẽ. Vì vậy, nó chiếm trong kỹ thuật hiển vi huỳnh quang vị trí quan
trọng nhất. Hôm nay được tổng hợp trong kỹ thuật hiển vi huỳnh quang thuốc nhuộm huỳnh
quang hiệu quả hơn, để phát triển các dấu hiệu cụ thể hơn, thuốc nhuộm huỳnh quang và các
bước sóng kích thích về mối quan hệ giữa biến cường độ huỳnh quang và định lượng nhiễm
sắc thể quét nhuộm huỳnh quang, vv là tài liệu phân loại khám phá hướng
Sắc tố huỳnh quang có thể được chia thành ba loại nói chung:
1. Huỳnh quang nhuộm thuốc nhuộm kiềm như vậy trong một dung dịch axit dễ dàng
phân tách. Thành phần huỳnh quang với một điện tích dương. Đó là mẫu vật thể và sinh học
nhóm ion ràng buộc có tính axit. Trong dung dịch kiềm trong một trạng thái không phân ly.
2. Axit thuốc nhuộm huỳnh quang trong dung dịch kiềm thành phần dễ dàng phân ly
của sự phát huỳnh quang với một điện tích âm.
3. Huỳnh quang nhuộm axit kiềm thuốc nhuộm huỳnh quang nhuộm trung hoà về điện
trung tính hoặc yếu trong quá trình nhuộm phân ly không có ý nghĩa thiết thực. Sắc tố này
được sử dụng cho cấu trúc phân tử hiển thị.
c2. Phân loại các màu nhuộm
Màu cơ bản( màu thiên nhiên): các chất màu có sẵn trong các tế bào như chlorophyll,
hemoglobin, anthocvane…
Màu thứ cấp: các loại màu không có sẵn trong tế bào mà được dùng để nhuộm đưa vào
tế bào. Loại này gồm các loại màu thiên nhiên như Safranin, hoặc các màu nhân tạo…
Màu nhuộm sống: tất cả các loại màu dung để nhuộm tế bào còn sống.
Màu bright field: loại màu này hấp thu một phần ánh sáng và trong ánh sáng trắng của
kính sẽ hiện ra màu. Loại này cũng có tự nhiên trong tế bào như chlorophyll, hemoglobin
hoặc anthocyan.
Màu fluorescence: không chỉ hấp thu một phần ánh sáng chư bright field mà chúng còn
phóng một phần ánh sáng hấp thu ngược trở lại.
Qua quy trình nhuộm một số cấu trúc của tế bào cũng như thành phần của tế bào sẽ
hiện lên rõ hơn, chính xác hơn qua sự tương phản của ánh sáng.

12. Điều kiện tất yếu là dựa vào các tính chất lý hoá thuốc nhuộm sẽ thâm nhập vào từng
thành phần khác nhau của tế bào. Qua đó chúng ta sẽ phân biệt được các chi tiết mà khi
không nhuộm chúng ta không thấy được.
Mẫu vật sau khi nhuộm sẽ hấp thụ một phần sóng của ánh sáng. Chúng ta nhận ra màu
khi phần còn lại của ánh sáng được vật thể phản chiếu lại. Sóng nào của ánh sáng được
hấp thụ và chúng ta nhận ra màu gì lệ thuộc vào loại thuốc nhuộm được sử dụng.
Có thể phân chia các loại màu nhuộm theo tính chất lí hoá:
+ Phần nhiều các loại thuốc nhuộm, dựa trên tính chất lí hoá của chúng sẽ thâm nhập cấu
trúc tế bào hoặc vào trong tế bào.
+ Trong màu nhuộm, các chất có tính tạo màu thường ở dạng ion. Khi chất màu này có
điện dương +, thì chúng có tính chất kiềm. Khi chất màu có mang điện âm(-), thì chúng có
tính axit. Lệ thuộc vào độ pH của dung môi, chất màu sẽ ở dạng ion hoặc không ở dạng ion.
c3. Các cách nhuộm
 Nhuộm sống: Qui trình nhuộm được diễn ra ở các vật còn sống để theo dõi quá trình
sinh lý vật cần xét nghiệm.
 Nhuộm các vật chết, các tế bào đã làm chết trước đó: Cần thiết trước đó phải qua qui
trình cắt, xén hoặc thuốc nhuộm không thể xâm nhập vào các tế bào sống như màng tế
bào quá dày..
 Nhuộm mẫu cắt: cắt mẫu vật trước khi nhuộm.
 Nhuộm nguyên miếng: Nhuộm trước khi cắt.
 Phương pháp nhuộm hút nước, bốc hơi: Cây cỏ được cho vào thuốc nhuộm, thuốc
nhuộm sẽ thâm nhập vào cây cỏ khi cây hút nước( như hoa đang cắm trong bình):
kiểm tra theo dõi dòng lưu thong trong các tế bào cây cỏ…
 Nhuộm qua phương pháp tiêm chích: Bơm thẳng màu vào tế bào, xác định vị trí màu
bám vào.
 Phương pháp immersion: Vật mẫu được ngâm trong màu sau đó đem ra rửa sạch.
 Phương pháp nhuộm Progressive: Để màu phản ứng cho đến khi có được kết quả
mong muốn ( cần ít thuốc nhuộm)
 PP nhuộm regressive: Ngâm vào dung dịch màu có nồng độ đậm đặc: tất cả mọi thành
phần sẽ được nhuộm màu, sau đó ngâm vật mẫu vào dung dịch rửa, chỗ nào bám
không chặt sẽ bị rửa sạch.
 PP đơn màu: Chỉ dung một loại thuốc nhuộm để nhuộm.
 PP đa màu: Vật mẫu được nhuộm bằng nhiều màu khác nhau theo 2 cách: nhuộm bằng
màu tổng hợp đã được trộn trước hoặc nhuộm từng màu một( cho kết quả đẹp hơn).
8. 2.3 – Phương pháp làm tiêu bản hiển vi
a. Làm tiêu bản ép:
- Cắt lớp mỏng, độ dày bằng vài lớp TB :
+ Kẹp mẫu vật vào giữa 2 miếng cà rốt, khoai lang ... hình trụ
+ Dùng máy cắt thành từng lát mỏng -> Dùng kim mác lấy mẫu ra ngoài
+ Cắt bằng dao mỏng (dao lam): Lát cắt dứt khoát ->+ Lát cắt vuông góc với mẫu vật

13. - Quan sát cấu trúc bên trong cơ thể TV
Chuẩn bị lát cắt -> Nhỏ glycerin hoặc nước cất vào lam kính -> Đặt mẫu vào, đậy lame
nghiêng 450 tránh tạo bọt khí -> Lau khô, dán mép kính bằng paraphin
b. Làm tiêu bản cố định (vài chục năm)
Tẩy màu lát cắt (javen/cloramin), tẩy tinh bột (cloral hydrat), rửa sạch bằng nước cất ->
Nhuộm màu, khử nước bằng cồn -> Nhỏ Bôm Canada, đặt mẫu vào, đậy lamen, đặt nơi
thoáng gío để Bôm khô cứng, cố định tiêu bản
VD: Quan sát phân bào nguyên nhiễm ở tế bào rễ hành
Ngâm cho hành ra rễ trước thí nghiệm độ 4 – 7 ngày (ngâm củ trong cốc có nước).
Khi có rễ dài khỏang 1cm, dùng dao cạo cắt 1 đoạn 0,5cm (kể từ chóp rễ). Cố định rễ trong
dung dịch cố định trong 2 giờ.
Mẫu rễ sau khi đã được cố định thì rửa sạch bằng nước cất và cho vào các dung dịch thuốc
nhuộm (dung dịch carmin axetic 2% : HCl 1N (9:1)) trong 2 ngày.
Rễ đã nhuộm trên đây, thuỷ phân trong 45% dung dịch axetic nóng trong khoảng 30 giây trên
ngọn đèn cồn.
Lấy rễ ra đặt lên lam kính, dùng dao lam cắt bỏ chóp rễ, sau đó cắt một lát mỏng phần
đỉnh sinh trưởng (phần đỉnh rễ nhuộm màu đậm). Nhỏ thêm một giọt 45% axetic hoặc 1%
axêto–carmin. Đậy bằng lamen và đặt lam kính trong một tờ giấy thấm gấp đôi, dùng đầu que
diêm hoặc đầu panh gõ nhẹ thẳng góc lên mẫu. Đưa lam kính hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn (tránh
để qua nóng làm khô mẫu và không khí lọt vào) khoảng 5 – 10 giây. Đặt lam kính trở lại tờ
giấy thấm và dùng đầu ngón tay cái ép thẳng góc lên lamen mẫu qua lớp giấy thấm.
CHÚ Ý: Phải ép đều và thẳng góc tránh vỡ lamen mà mẫu được trải đều. Đặt lên kính hiển
vi, điều chỉnh cho rõ. Quan sát, vẽ hình, phân biệt các pha phân chia, gọi tên các pha đó.
c. Tiêu bản “ép lam”
Dùng để nghiên cứu sự sắp xếp của tế bào một cách tự nhiên trong khuẩn lạc như hình
dạng cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử của xạ khuẩn hay nấm mốc. Có thể ép lam theo cách:
*Phương pháp Henrici:
+ Nhỏ lên lam vô trùng 2ml môi trường thạch vô trùng , để nguội.
+ Dùng dao vô trùng cắt bỏ một nửa miếng môi trường rồi dùng que cấy vòng cấy lên nấm
mốc ( hoặc xạ khuẩn) lên mặt vừa cắt của môi trường.
+Dùng kẹp vô trùng úp lamen vô trùng lên tiêu bản.
+ Đặt tiêu bản lên que thuỷ tinh bẻ cong trong đĩa petri vô trùng ẩm.
Cách chuẩn bị petri vô trùng ẩm: Miếng giấy lọc được thấm nước và đặt ở đáy hộp , trên
miếng giấy đặt một thanh thuỷ tinh bẻ cong, thanh trùng ở nồi áp suất 1210C trong 30 phút.
+ Gói đĩa petri vào túi nilon vô trùng, để vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.

14. Bào tử của nầm hoặc xạ khuẩn khi sinh trưởng sẽ lan sang mép lam. Khi quan sát lấy tiêu bản
ra khỏi đĩa petri, đặt lên bàn kính và quan sát dưới hệ kính khô.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1- Hoàng Thị Sản, Nguyễn Tề Chỉnh,1982, Thực hành hình thái giải phẫu thực vật, NXB Giáo
dục
2- Instruction of microscope - eclipse 90i, Nikon
3- Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào,2011, Thực hành vi sinh vật
học,NXB Đại học Sư phạm.
4- http://www.microscopyu.com
5- http://www.olympusmicro.com
6- http://www.leica-microsystems.com
7- Julian P. Heath. Dictionary of Microscopy. Wiley, 2005
.