Hoofdstuk 5 - Spectrofotometrie

Hoofdstuk 5
Spectrofotometrie
1 Chemie Analytische Chemie II 1
Bron: https://cen.acs.org/articles/96/i23/cuvettes-difficult-come.html

Hoofdstuk 5
Spectrofotometrie
Fotocredits: Ignace De Coninck
De analyse van albumine met behulp van het Folin-Ciocalteu-reagens.
De interactie van licht met materie biedt verschillende
mogelijkheden om zowel kwalitatieve als kwantitatieve metingen uit
te voeren.
Veel chemische reacties genereren heldere kleuren die voldoende
informatie verschaffen om een analyse te doen.
Sommige kleurveranderingen zijn te subtiel → instrumenten!
Spectrofotometrie = eender welke techniek die gebruik maakt van
licht om chemische concentraties te meten.
Colorimetrie = procedure gebaseerd op de absorptie van zichtbaar
licht.

5.1 De eigenschappen van licht
Wat is licht?
Bron: https://science.nasa.gov/ems/03_behaviors
Elektromagnetische straling voorgesteld als een golf die zich verspreidt doorheen de ruimte met zowel elektrische componenten als magnetische
veldcomponenten.
Twee beschrijvingswijzen.
• Licht bezit de eigenschappen van golven
• Licht is opgebouwd uit afzonderlijke energiedeeltjes
Golf-deeltje dualiteitsprincipe
https://phys.org/news/2015-03-particle.html
Beide denkbeelden zijn noodzakelijk om op een adequate manier te beschrijven hoe licht zich gedraagt en
interageert met de materie.

5.1.1 Licht als golfverschijnsel
Klassieke beschrijvingswijze.
Lichtgolven bestaan uit loodrecht oscillerende elektrische en magnetische velden
Voorstelling van vlakgepolariseerde elektromagnetische straling
dat propageert langs de x-as.
Het elektrisch veld van het vlakgepolariseerde licht is beperkt tot
één enkel vlak. Ongepolariseerd licht heeft elektrische
veldcomponenten in alle vlakken.
Het elektrisch veld (E) bevindt zich in het xy-vlak
Het magnetisch veld (B) bevindt zich in het xz-vlak
De golflengte (λ) is de afstand tussen de twee toppen van de golf.
De frequentie (ν) is het aantal volledige oscillaties dat een golf kan maken
per seconde. (1/s)
Eén oscillatie per seconde = één hertz
De relatie tussen de frequentie en de golflengte is
met c de lichtsnelheid in vacuüm (2,998 × 108 m/s)

Voorbeeld 6.1
Wat is de golflengte van de straling in een microgolfoven waarvan de frequentie 2,45 GHz bedraagt?
2,45 GHz = 2,45 ×109 Hz = 2,45 × 109 s–1

In een medium anders dan vacuüm is de snelheid van het licht gelijk aan c/n met n de brekingsindex of refractie-index.
Voor zichtbare golflengten is n >1 voor de meeste stoffen.
Wanneer licht beweegt doorheen media met verschillende brekingsindices, zal de frequentie constant blijven, maar zal de golflengte veranderen.

5.1.2 Het elektromagnetische spectrum
Infraroodstraling zal zorgen voor vibraties in moleculen. Zichtbaar licht alsook ultraviolette straling zullen elektronen doen promoveren naar
hogere energie-orbitalen. X-stralen en korte golflengte ultraviolette stralen zullen chemische bindingen doorbreken en moleculen doen ioniseren.
Schematische voorstelling voor de verschillende gebieden van het elektromagnetisch spectrum. Het zichtbare gebied
strekt zich uit van 400 nm tot 700 nm.
Een enorm bereik van golflengten en frequenties (en bijgevolg energieën). Logaritmische schalen worden gebruikt.

5.1.3 Het deeltjeskarakter van licht
Wanneer we in termen van energie denken, is het handig om over licht te spreken als ware het deeltjes die fotonen worden genoemd.
Dit deeltjeskarakter van licht vormde de basis van de kwantumtheorie.
Elk foton bezit de energie, E, die wordt gegeven door
met h de constante van Planck (6,626 × 10-34 Js)
het golfgetal

Voorbeeld 6.2
5.1.3 Het deeltjeskarakter van licht
Met hoeveel joules wordt de energie van een molecule verhoogd wanneer het (a) zichtbaar licht absorbeert met een golflengte van 500 nm of (b)
infraroodstraling absorbeert met een golfgetal van 1251 cm–1?
(a) De golflengte van zichtbaar licht is 500 nm = 500 × 10-9 m.
De energie van één foton dat wordt geabsorbeerd door één molecule.
Voor één mol moleculen dat één mol fotonen absorbeert

https://www.nasa.gov
5.2 Absorptie van licht
Absorptie is het proces waarbij een chemische stof in een transparant medium selectief bepaalde frequenties van de elektromagnetische straling
doet verminderen.

Absorptie is het proces waarbij een chemische stof in een transparant medium selectief bepaalde frequenties van de elektromagnetische straling
doet verminderen.

5.2.1 Absorptie en emissie
Volgens de kwantumtheorie bezit elk elementair deeltje (atoom, ion of molecule) een unieke reeks van energietoestanden waarbij de laagste de
grondtoestand wordt genoemd.
Grondtoestand
Bij kamertemperatuur bevinden de meeste elementaire deeltjes zich in de grondtoestand.
Wanneer een stralingsfoton een elementair deeltje nadert, kan absorptie mogelijk worden
enkel en alleen indien de energie van het foton exact overeenkomt met het energieverschil
tussen de grondtoestand en één van de hogere energietoestanden.
Onder deze omstandigheden zal de energie van het foton worden overgedragen op het
atoom, ion of molecule zodat het omgezet wordt naar een hogere energietoestand: de
geëxciteerde of aangeslagen toestand.
Absorptie
Aangeslagen toestanden
De excitatie van een deeltje M naar de aangeslagen toestand M ⃰ kan worden voorgesteld
als
Na een zeer korte periode (10-6 tot 10-9 s), zal het geëxciteerde deeltje relaxeren naar de originele toestand of de grondtoestand waarbij de
overmaat aan energie wordt overgedragen aan andere atomen of moleculen in het medium.
Emissie
Dit proces, dat een kleine verhoging in temperatuur van de omgeving zal veroorzaken, wordt beschreven door
Relaxatie kan zich eveneens voordoen bij fotochemische ontbinding van M ⃰ om nieuwe deeltjes te vormen of door fluorescerende of
fosforescerende emissie of straling.

5.2.2 Absorptiespectra
Wanneer licht wordt geabsorbeerd door een staal, zal de lichtintensiteit worden verlaagd. De lichtintensiteit, I, is de energie per seconde per
oppervlakte-eenheid van de lichtbundel.
De absorberende karakteristieken van een deeltje worden gewoonlijk beschreven door middel van een absorptiespectrum dat een plot is van een
functie voor de vermindering van straling versus golflengte, frequentie of golfgetal.
Twee termen worden gewoonlijk gebruikt als kwantitatieve maten voor deze stralingsvermindering, namelijk transmissie (doorlaatbaarheid) of
absorbantie.
Transmissie
Schematische weergave voor de verzwakking van een lichtstraal
doorheen een medium met dikte b en een absorberende oplossing met
concentratie c.
Als gevolg van de interacties tussen de fotonen en de absorberende deeltjes,
zal de lichtintensiteit van de lichtbundel verzwakken van I0 tot I.
De transmissie, T, van het medium is een fractie van de inkomende straling
doorgelaten door het medium.
Transmissie wordt vaak uitgedrukt als een percentage of

Absorbantie
De absorbantie, A, van een medium wordt gedefinieerd als
Daar I0 en I beiden worden gemeten als een eenheid van vermogen (W), zullen beide eenheden elkaar opheffen zodat de absorbantie een
eenheidsloze hoeveelheid is.
In tegenstelling tot de transmissie, zal de absorbantie van het medium verhogen wanneer de verzwakking van de lichtstraal groter wordt.
Stel I = I0, dan is de intensiteit van de uitkomende lichtbundel = de intensiteit van de inkomende lichtbundel zodat I0/I = 1 zodat
Wanneer 90 % van het licht wordt geabsorbeerd, zal 10 % worden getransmitteerd en is I = I0/10 zodat
Wanneer 99 % van het licht wordt geabsorbeerd, zal 1 % worden getransmitteerd en is I = I0/100 zodat
De absorbantie wordt gemeten door het vergelijken van de intensiteit van een inkomende en doorgelaten lichtbundel doorheen een staal. De
intensiteit van de lichtbundel kan worden gedetecteerd door toestellen zoals een fotomultiplicator. De verhouding tussen de inkomende en
doorgelaten lichtbundelintensiteiten kan worden berekend om de absorbantie van een staal te berekenen.

Voorbeeld 6.3
Een gekleurde oplossing wordt in een UV/Vis-spectrofotometer geplaatst. Bij 465 nm vertoont het staal een absorbantie van 0,79. Bereken het
percentage licht dat wordt geabsorbeerd.
Als I0 = 1, is 6,166 = 1/I zodat
Er wordt bijgevolg 16,22 % van het inkomende licht doorgelaten. Hieruit volgt dat ( 100 – 16, 22) = 83,78 % van het inkomende licht wordt
geabsorbeerd.

Voorbeeld 6.4
Een oplossing in een UV/Vis-spectrofotometer vertoont een absorbantie van 0,67 bij een golflengte van 560 nm. Wat is het percentage straling dat
wordt doorgelaten?
Als I0 = 1, is 4,677 = 1/I zodat
Er wordt 21,38 % van het inkomende licht doorgelaten.

Het uitzetten van spectrale data
Ultraviolet en zichtbare absorptiespectra worden gewoonlijk bekomen door het meten van een verdunde oplossing van het analyt in een
transparant solvent.
Absorptiespectra voor kaliumpermanganaat (KMnO4) in oplossing waarbij b = 1 cm.

5.2.3 Complementaire kleuren
De absorptiespectra voor Chlorofyl a en Chlorofyl b.
Chlorofyl of bladgroen zijn de pigmenten die de groene kleur in planten
en algen veroorzaken. Deze pigmenten zijn verantwoordelijk voor de
absorptie van licht dat wordt omgezet in chemische energie voor de
fotosynthese.
Het licht wordt niet geabsorbeerd tussen 500 en 600 nm zodat de
kleurstoffen een groene kleur krijgen.

Absorbantiespectra van Fast Yellow AB, Rhodamine B en Methyleenblauw waarbij b = 1 cm.
Een oplossing van de kleurstof ``Fast Yellow AB´´ is geel van kleur omdat
deze kleurstof de violet-blauwe component van de inkomende witte
lichtbundel absorbeert en de gele component doorlaat of transmitteert.
Fast Yellow AB vertoont een maximale absorbantie tussen 380 en 440 nm.
Algemeen geldt dat de straling die wordt geabsorbeerd een
complementaire kleur geeft aan het analyt in oplossing.
Rhodamine B absorbeert maximaal rond 550 nm zodat de
waargenomen kleur violet zal zijn.
Methyleenblauw absorbeert maximaal rond 660 nm waardoor de
kleur blauw wordt waargenomen.

5.3 Soorten absorptie
5.3.1 Atomaire absorptie
Wanneer een bundel polychromatische UV- of zichtbare stralen doorheen een medium gaat dat gasvormige atomen (bijvoorbeeld natriumatomen)
bevat, zullen slechts bepaalde frequenties worden afgezwakt door absorpties. Het bekomen spectrum bestaat uit een aantal zeer fijne (ongeveer
0,005 nm) absorptielijntjes.
Deze transities houden de excitatie in van een enkel
buitenste elektron van natrium van de grondtoestand 3s-
orbitaal naar de 3p, 4p en 5p orbitalen. Deze excitaties
worden veroorzaakt door de absorptie van fotonen
waarvan de energie exact overeenkomt met de
verschillen in energieën tussen de geëxciteerde
toestanden en de 3s-grondtoestand.
UV/Vis-absorptiespectrum voor gasvormige natriumatomen
Schematische weergave van een lijnenspectrum voor
natriumdampen.
Partieel energiediagramma
voor natrium dat de transities toont uit de absorpties bij 590,
330 en 285 nm.

5.3.2 Moleculaire absorpties
Drie soorten van gekwantiseerde transities wanneer moleculen worden geëxciteerd door ultraviolette, zichtbare en infrarode straling.
Naast de elektronische transities, kunnen moleculen twee andere soorten van stralingsgeïnduceerde transities ondergaan, namelijk vibrationele
transities en rotationele transities. Vibrationele transities komen voor omdat een molecule een meervoud heeft van gekwantiseerde niveaus (of
vibrationele toestanden) geassocieerd met de bindingen die een molecule samenhouden.
Bij ultraviolette en zichtbare straling betekent de excitatie dat er een elektron dat zich bevindt in een molecuul- of atoomorbitaal met lagere
energie-inhoud zal promoveren naar een orbitaal met hogere energie-inhoud. De energie hν van het foton moet exact hetzelfde zijn als het
energieverschil tussen de twee orbitaalenergieën. De transitie van een elektron tussen twee orbitalen wordt de elektronische transitie genoemd en
het absorptieproces wordt de elektronische absorptie genoemd.

De energieën E1 en E2, twee van de verschillende elektronische geëxciteerde toestanden van
een molecule, worden relatief getoond ten opzichte van de energie in de grondtoestand E0.
De relatieve energieën van enkele van de vele vibrationele toestanden die geassocieerd zijn
met elke elektronische toestand worden weergegeven door lichtere horizontale lijnen.
Schematische weergave van een partieel energieniveaudiagramma met enkele mogelijke processen die voorkomen wanneer een
polyatomisch deeltje infrarode, zichtbare en ultraviolette straling absorbeert.

Rekvibraties
De vibrationele toestanden Stel een binding in een molecule voor als een trillende veer met aan de beide uiteinden atomen.
Bij rekvibraties zal de afstand tussen twee atomen volgens de bindingsas veranderen.

De vibrationele toestanden
Bij buigen zal de hoek tussen de bindingsassen veranderen.
Buigingsvibraties in het vlak
Stel een binding in een molecule voor als een trillende veer met aan de beide uiteinden atomen.

Buigingsvibraties uit het vlak
De vibrationele toestanden
Bij buigen zal de hoek tussen de bindingsassen veranderen.
Stel een binding in een molecule voor als een trillende veer met aan de beide uiteinden atomen.

Enkele vibrationele energieniveaus zijn weergegeven met 1, 2, 3 en 4. Het laagste vibrationeel
niveau is aangegeven met 0.
Een molecule bezit eveneens gekwantiseerde rotationele toestanden die overeenkomen met de
rotationele bewegingen van een molecule rond het zwaartepunt (niet getoond).
Het energieverschil tussen de vibrationele toestanden is meestal een grootteorde kleiner dan
tussen de energieniveaus van de elektronische toestanden.
De rotationele energietoestanden liggen bovenop elk van de vibrationele toestanden die werden
getoond in het energiediagramma. De energieverschillen tussen de rotationele toestanden zijn
eveneens een grootteorde kleiner dan deze tussen de vibrationele toestanden.

De totale energie E geassocieerd met een molecule wordt gegeven door
met Eelektronisch de energie die overeenkomt met de elektronen in de verschillende buitenste
orbitalen van het molecule, Evibrationeel de energie van een molecule als een geheel veroorzaakt
door interatomaire vibraties en Erotationeel de energie voor de rotaties van het molecule rond zijn
zwaartepunt.

Infrarode absorptie
Infrarode straling is gewoonlijk te weinig energetisch om elektronische overgangen te
veroorzaken, maar kan wel overgangen induceren in de vibrationele en rotationele toestanden
die geassocieerd zijn met de grond elektronische toestand van het molecule.
Enkele van deze overgangen zijn gevisualiseerd in het laagste gedeelte. Opdat absorptie zich
zou voordoen, moet de bron straling uitzenden met frequenties die exact overeenkomen met de
energieën die worden voorgesteld met de lengten van de vier pijlen

Absorptie van ultraviolette en zichtbare straling
De middelste pijlen stellen dat het molecule zichtbare straling absorbeert van vijf
golflengten waarbij elektronen promoveren naar de vijf vibrationele niveaus van
het geëxciteerd elektronisch niveau E1.

Absorptie van ultraviolette en zichtbare straling
De meer energetische ultraviolette fotonen zijn nodig om de absorptie te
induceren die wordt voorgesteld door de vijf rechtse pijlen.
Moleculaire absorptie in het UV- en zichtbare gebied bestaat uit absorptiebanden van
dicht op elkaar liggende lijnen.

5.4 De wet van Lambert-Beer
5.4.1 Algemeen
De botsing tussen enerzijds een foton met een welbepaalde energie-inhoud en anderzijds het te analyseren molecule resulteert in de absorptie van
licht.
Wanneer een groot aantal moleculen worden geplaatst in de baan van de lichtbundel is er een grotere kans dat er zich effectief botsingen voordoen
zodat absorptie kan worden waargenomen.
Stel een glas zwarte bessensap waardoorheen we kunnen kijken. Het lijkt het alsof de drank een paarse
kleur bezit. We weten dat er bepaalde golflengten worden geabsorbeerd terwijl er andere gemakkelijk
worden doorgelaten waardoor de drank zijn karakteristieke kleur bekomt.
Wanneer we een tweede gelijkaardig glas zwarte bessensap plaatsen voor het eerste, lijkt de kleur
tweemaal zo intens te worden omdat we beseffen dat er minder licht doorheen de twee glazen wordt
doorgelaten.
De waarschijnlijkheid van botsingen tussen de fotonen en de licht absorberende moleculen is namelijk
verhoogd.

5.4.1 Algemeen
Stel nu een eenvoudige doorzichtige cel of een cuvet voor die een oplossing bevat die straling bij een welbepaalde golflengte absorbeert.
ε staat ook gekend als de extinctiecoëfficiënt.
De absorptie zal evenredig zijn met de concentratie van het absorberende moleculaire deeltje en ook met de weglengte
waardoorheen het licht zich moet voortplanten.
De wet van Lambert-Beer relateert de absorptie van de meeste moleculaire deeltjes aan de concentratie, c, de weglengte, b, en de
molaire absorptiviteit, ε, volgens de vergelijking
Verschillende handboeken gebruiken verschillende manieren om de eenheden van ε en b uit te drukken, maar de meest voorkomende eenheid voor
ε is l/(mol cm) zodat de weglengte b in cm moet staan.
De wet van Lambert-Beer wordt soms uitgedrukt in termen van transmissie, T, waarbij T = 1/A.
Een weglengte van één cm wordt gewoonlijk gekozen om de berekeningen van de absorbantie of molaire absorptiviteit te vereenvoudigen.
De wet van Lambert-Beer is één van de meest gebruikte relaties in de analytische chemie en staat centraal in de meeste UV- en zichtbare
kwantitatieve analysemethoden.

5.4.1 Algemeen
Voorbeeld 6.5
Een cuvet waarin zich een 0,1 molaire oplossing bevindt met een weglengte van 1 cm wordt in een UV/Vis-spectrofotometer geplaatst en vertoont
een absorbantie van 0,95. Bereken de molaire absorptiviteit voor deze stof.
zodat

5.4.2 Afleiding voor de wet van Lambert-Beer
We beschouwen een monochromatische lichtbundel die doorheen een cuvet gaat met daarin een absorberende stof
Schematische weergave voor de vermindering van een lichtstraal die doorheen een
absorberende stof gaat.
De lichtstraal wordt voorgesteld met een intensiteit I en I+dI is de intensiteit is van de lichtbundel die
uit de cuvet komt.
waarbij k een evenredigheidsconstante is, 𝑐 de molaire concentratie en
dx de dikte van de cuvet.
Differentiaalvergelijking!
De intensiteit van de lichtbundel is gelijk aan het aantal fotonen (of
lichtkwanta) die per tijdseenheid doorheen een eenheidsgebied gaan dat
loodrecht staat ten opzichte van de richting van de lichtbundel.
De cuvet waarin zich de absorberende stof bevindt, heeft een breedte dx.
Wanneer het aantal fotonen wordt voorgesteld met I, is –dI het aantal
fotonen dat wordt geabsorbeerd door een absorberende stof over de afstand
dx. De vermindering in intensiteit, –dI, is dus evenredig met de dikte dx
van de cuvet en met het aantal absorberende moleculen of de concentratie
van de absorberende deeltjes die zich in de cuvet bevindt. We kunnen de
vermindering in intensiteit dus schrijven als

Differentiaalvergelijking van de eerste orde en de eerste graad!
Oplossen door de scheiding van veranderlijken toe te passen.
Integreren aan beide zijden van de vergelijking van I = I0 op
x = 0 tot I=I op x=l
Uitwerking
We bekomen voor de intensiteit, I, van een monochromatische lichtbundel die doorheen een cuvet gaat, dat
In spectroscopie is het meer gebruikelijk dat er Briggse logaritmen of logaritmen met een grondtal 10 (log10) worden gebruikt in plaats van de
natuurlijke logaritmen (ln). We vervangen het natuurlijk grondtal e (het Getal van Euler) door 100,43429… zodat

We definiëren dat ε ≡ 0,4343k zodat
De constante ε is de molaire absorptiecoëfficiënt van de absorberende stof of de extinctiecoëfficiënt. De transmissie, T, wordt gedefinieerd door
waardoor T een bereik heeft tussen 0 en 1. Het percentage transmissie is eenvoudigweg %T en heeft een bereik tussen 0 en 100 %.
Verhoogt de absorbantie met een eenheid, dan verlaagt de transmissie met een factor 10. Wanneer er geen licht wordt geabsorbeerd is I=I0 en A=0.
Indien de wet van Lambert-Beer wordt gevolgd, wordt de absorbantie gegeven door
Daar 𝑐 wordt uitgedrukt in mol/dm3, l in meter en A een getal is zonder eenheden, zal de SI-eenheid ε gelijk zijn aan m2/mol.
waarbij c in mol/l en b de lengte is van de cuvet in cm zodat ε wordt uitgedrukt in lmol–1cm–1.
De molaire absorptiecoëfficiënt wordt traditioneel echter gedefinieerd door

5.4.3 Beperkingen van de wet van Lambert-Beer
Een groot voordeel van de wet van Lambert-Beer is dat het kan worden gebruikt om de concentratie van een stof te relateren aan de absorptie van
eender welk type van licht. De wet van Lambert-Beer stelt namelijk dat een plot van de absorbantie A in functie van de concentratie c een rechte
moet zijn door de oorsprong met helling εb.
Desalniettemin moet steeds in het achterhoofd worden gehouden dat er verschillende benaderingen werden gemaakt in de vergelijking die de
situaties beperken waaronder de wet kan worden gebruikt.

Een werkelijke beperking op de wet van Lambert-Beer
Een schijnbare instrumentele benadering in de wet van Lambert-Beer
Eveneens kan het gebeuren dat licht de detector van de spectrofotometer bereikt zonder door het staal te gaan waardoor er fouten kunnen
voorkomen in de gemeten absorbantiewaarden. Dit strooilicht leidt tot een negatieve afwijking op de wet van Lambert-Beer.
Anderzijds kan er aan het oppervlak van de cuvet, waarin zich het staal bevindt, ook reflectie van het licht optreden waardoor dit licht de detector
niet bereikt. Dit effect verhoogt de schijnbare absorptie van licht en zorgt voor een positieve afwijking op de wet van Lambert-Beer.
De wet is enkel geldig is voor verdunde stalen (< 0,01 M). In de afleiding wordt er vanuit gegaan dat alle absorberende deeltjes in het staal
onafhankelijk van elkaar handelen. Afwijkingen komen voor bij hogere concentraties omdat bij hogere concentraties de afstand tussen de
individuele deeltjes zodanig klein wordt dat het elektrisch veld rond één deeltje de absorptie van licht rond een ander deeltje zal beïnvloeden.
Daardoor wordt de gemeten absorbantie bij hoge concentraties lager dan men zou verwachten (negatieve afwijking).
De wet stelt dat absorbantie van het staal wordt gemeten gebruik makend van monochromatisch licht of licht dat bestaat uit één enkele golflengte.
In de praktijk is het onmogelijk om spectrofotometers te bouwen die perfect monochromatisch licht uitzenden. Spectrofotometers zenden steeds
polychromatisch licht of licht bestaande uit twee of meerdere golflengten uit. Bij het gebruik van polychromatisch licht zal de molaire
absorptiecoëfficiënt ε wijzigen zodat een negatieve afwijking op de wet van Lambert-Beer wordt bekomen. Om deze reden worden
absorbantiemetingen uitgevoerd nabij het maximum van een piek in een absorptiespectrum.

Bij het gebruik van polychromatisch licht zal de molaire absorptiecoëefficiënt ε wijzigen zodat
een negatieve afwijking op de wet van Lambert-Beer wordt bekomen. Om deze reden worden
absorbantiemetingen uitgevoerd nabij het maximum van een piek in een absorptiespectrum.
Bron: https://pharmaxchange.info/2012/05/ultraviolet-visible-uv-vis-spectroscopy
Figure A: Shows the difference in deviations in absorbance when values are obtained at
maximum wavelength of absorbance (band A) vs other wavelengths of absorbance (band B).
Figure B: shows the deviations in Beer-Lambert law due to observations made at wavelengths
other than lambda max.

Schijnbare chemische afwijkingen op de wet van Lambert-Beer treden op wanneer de absorberende deeltjes deelnemen aan een chemische reactie.
Dit probleem kan voorkomen in de chemische evenwichtsreacties van zwakke zuren of zwakke basen waarbij protonen worden uitgewisseld.

Schijnbare chemische afwijkingen op de wet van Lambert-Beer treden op wanneer de absorberende deeltjes deelnemen aan een chemische reactie.
Dit probleem kan voorkomen in de chemische evenwichtsreacties van zwakke zuren of zwakke basen waarbij protonen worden uitgewisseld.
Bron: https://pharmaxchange.info/2012/05/ultraviolet-visible-uv-vis-spectroscopy
Acid and Base forms of phenol red along with their UV spectra at different pH demonstrates
chemical deviations of Beer-Lambert law in UV-Visible spectroscopy

5.5 De spectrofotometer
Een schematische weergave van een enkelstralig spectrofotometrisch experiment waarbij I0 de lichtintensiteit van de
bundel voorstelt dat het staal binnenkomt; I de lichtintensiteit van de bundel die uit het staal komt; l de lengte van het
pad doorheen het staal.
Een rudimentair spectrofotometrisch experiment.
Het licht gaat doorheen een monochromator (een prisma, een rooster of zelfs een filter) om één welbepaalde golflengte te selecteren. Van licht
dat slechts uit een smal golflengtebereik bestaat, wordt gezegd dat het monochromatisch is (“één kleur”). Het monochromatisch licht met
lichtsterkte I0, treft een staal met lengte l. De lichtsterkte van de bundel die opduikt aan de andere kant van het staal is I. Een gedeelte van het
licht kan worden geabsorbeerd door het staal zodat I ≤ I0.

5.5.1 Lichtbronnen
• Lichtbron nodig met een constante intensiteitsontwikkeling of vermogen.
• De lichtbron moet voldoende intens zijn zodat er voldoende straling wordt doorgelaten om te kunnen worden gedetecteerd.
• Het te onderzoeken staal moet op elk moment bestraald worden met een stralingsbron die zo monochromatisch mogelijk is. Dit betekent dat het
bereik van de golflengte zo nauw mogelijk moet zijn. Een monochromator is het meest gebruikte toestel om een lichtgolflengte te selecteren
zodat een staal kan worden bestraald.
• Het stralingsvermogen van vele lichtbronnen stijgt exponentieel stijgen met het toegepast voltage en zeer kleine fluctuaties in de toegepaste
elektrische voeding kunnen significante variaties veroorzaken in de intensiteit van de inkomende straling zodat er in de praktijk vaak
voltageregulatoren worden gebruikt in de stroomlijn van de lichtbron.

5.5.1 Lichtbronnen
Gloeidraadlampen van wolfraam
Het merendeel van de UV- en zichtbare spectrofotometers gebruiken gloeidraadlampen van wolfraam om straling te verschaffen in het
golflengtegebied tussen 320 en 2500 nm dat het zichtbare gebied van het elektromagnetisch spectrum grotendeels bedekt. Gewoonlijk zal de
temperatuur waarbij de wolfraam gloeidraadlampen worden gebruikt, liggen in een bereik van 2900 tot 3000 K.
Bron: Séamus P J Higson, Analytical Chemistry, Oxford University Press (2004)
Bron: https://www.flickr.com/photos/zeissmicro/
Scanning electron micrograph of light bulb filament
Pure tungsten has some amazing properties including the highest melting
point (3695 K), lowest vapor pressure, and greatest tensile strength out of
all the metals. Because of these properties it is the most commonly used
material for light bulb filaments. Image taken with ZEISS EVO
SEM www.zeiss.com/sem

Wolfraam-halogeenlampen bevatten kleine hoeveelheden jood.
In dergelijke halogeenlampen kan de temperatuur verhoogd worden tot 3600 K zodat dit toelaat dat de intensiteit van de bekomen straling kan
worden verhoogd en dat er ook nog intensiteit is waar te nemen tot ongeveer 3000 nm. Zowel de wolfraam en wolfraam-halogeenlampen zijn
geschikt voor het meten in het zichtbare gebied van het spectrum.
5.5.1 Lichtbronnen
Gloeidraadlampen van wolfraam
Het emissiespectrum van een wolfraam infraroodlamp.

5.5.1 Lichtbronnen
Waterstoflampen en deuteriumlampen
De waterstoflampen en deuteriumlampen zijn twee andere lichtbronnen die kunnen
worden gebruikt in UV/Vis-spectroscopie.
Beide lampen bestaan uit twee inerte elektroden in kwartbehuizing die
gevuld is met H2 of D2. Door een hoge spanning aan te leggen tussen de twee
elektroden, zal er eerst een excitatie optreden van H2 of D2 en de daaropvolgende
dissociatie in H- of D-atomen resulteert in de emissie van licht. Waterstof- en
deuteriumlampen bieden ultraviolette straling als een continue band tussen 180 en 370
nm.
Een deuteriumlamp is iets meer gebruikelijk in moderne labo’s omdat het een meer
intense lichtemissie geeft.

5.5.2 Golflengteselectoren
Een golflengteselector of monochromator bestaat uit een smalle opening (slit of spleet) waardoor het licht binnenkomt, een systeem om het licht te
scheiden in verschillende golflengten en een andere smalle spleet waardoorheen een gedeelte van het licht kan worden doorgelaten om doorheen
het staal te kunnen gaan. In spectrofotometers wordt er hoofdzakelijk gebruik gemaakt van een prisma of een rooster om het licht te scheiden in
verschillende golflengten.
Prisma
Prisma's die gebruikt worden in het zichtbare gebied zijn gemaakt van glas. De
brekingsindex van een stof is in het algemeen afhankelijk van de golflengte λ
van de lichtstraal. In het zichtbare gebied van het elektromagnetisch spectrum
is de brekingsindex bijgevolg afhankelijk van de kleur van het licht. Omdat de
verschillende kleuren onder een andere hoek gebroken worden, zal het verschil
in de brekingsindex van glas in functie van de golflengte ervoor zorgen dat er
een scheiding van het licht in zijn verschillende kleuren kan optreden.
Schematische weergave voor het gebruik van een prisma om zichtbaar licht te
breken in zijn verschillende kleuren.
Het rode licht (λ1) zal het minst worden afgebogen en het violet licht (λ2) het
meest.

5.5.2 Golflengteselectoren
Roosters
In een transmissierooster wordt de breking van licht veroorzaakt doordat het licht doorheen een rooster gaat dat bestaat uit smalle spleten en die
constructieve of destructieve interferentie van het licht veroorzaken. Verschillende golflengten van licht zullen verschillende hoeken hebben
waarbij ze constructieve interferentie produceren waardoor het mogelijk is om deze golflengten te selecteren.
Een reflectierooster is het meest gebruikt in hedendaagse spectrofotometers.
Dit type van rooster bestaat uit een gepolijst en reflecterend oppervlak met een
reeks van parallelle en dicht op elkaar liggende inkepingen.
Wanneer een lichtstraal wordt gereflecteerd aan dit oppervlak, wordt opnieuw
constructieve en destructieve interferentie gecreëerd. Voor welbepaalde
hoeken kan er een constructieve interferentie optreden voor specifieke
golflengten van licht.
Het veranderen van de oriëntatie en de hoek van een transmissie- of een reflectierooster zal de gekozen golflengte met constructieve
interferentie doorlaten doorheen de uitgangspleet.

5.5.3 Detectoren
De fotobuis (of foto-elektrische cel of vacuüm cel)
fotonen
draadvormige anode
glazen of kwarts
huls onder vacuüm
DC-versterker en uitlezing
90 V
+–
kathode
elektronen
In een luchtledige glazen buis (eventueel met een
kwartsvenster om UV-licht door te laten) zijn twee
elektroden aangebracht: een kathode in de vorm van een
halve cilinder en een staafvormige anode.
Schematische weergave van een fotobuis (Bron: Dr. Liesbet Weckhuysen).
Het oppervlak van de kathode is bedekt met een
alkalimetaal (vb. cesium) of een metaaloxide zodat
elektronen worden vrijgesteld wanneer
elektromagnetische straling invalt op de kathode.
Wanneer over de kathode en anode een spanning wordt
aangelegd, zullen deze elektronen worden aangetrokken
door de staafvormige anode. Hierdoor ontstaat een
zwakke elektrische stroom, evenredig met
de ingevallen lichtintensiteit.

kathode
anodevacuüm
tube
dynodes-3000V
-2400V
-1800V
-1200V
-600V
-2700V
-2100V
-1500V
-900V
-300V
foton
De bundel elektronen groeit na
iedere inslag op een dynode.
0 V
elektronen
stroomI
5.5.3 Detectoren
De foto-vermenigvuldigingsbuis
Dit detectiesysteem is een uitbreiding van de gewone fotobuis.
Tussen de kathode en de anode worden meerdere elektroden, dynoden,
geplaatst worden die progressief op een hogere potentiaal worden
gehouden.
Schematische weergave van een foto-vermenigvuldigingsbuis (Bron: Dr. Liesbet Weckhuysen).

5.5.4 Enkelstraal en dubbelstraal spectrofotometers
Enkelstraal spectrofotometers
Een enkelstraal spectrofotometer betekent dat het licht één pad volgt doorheen het instrument.
Het licht in dit instrument komt van een lichtbron. De golflengte wordt geselecteerd door gebruik te maken van een monochromator.
Vervolgens gaat dit licht doorheen het staal in een cuvet en de intensiteit van het overblijvende licht wordt gemeten door een detector. Doordat
transmissie of absorbantie worden gedefinieerd in termen van de verhouding van de lichtintensiteit die doorheen het staal gaat, moet er een
manier zijn om beide grootheden in dit apparaat te kunnen meten.
Het toestel wordt eerst aangepast zodat het een output geeft
van 0 % transmissie wanneer een luik wordt gesloten en er
geen licht het staal kan bereiken (in het Engels dark current).
Het instrument wordt dan ingesteld op 100 % transmissie (of A
= 0) wanneer een blanco-oplossing dat geen analyt bevat in het
apparaat wordt gebracht. Vervolgens wordt het staal in het
apparaat gebracht en wordt haar %T of A gemeten.

5.5.4 Enkelstraal en dubbelstraal spectrofotometers
Dubbelstraal spectrofotometers
In een dubbelstraal spectrofotometer wordt de originele lichtbundel gesplitst zodat de helft van het licht doorheen een referentie (of blanco)
oplossing gaat terwijl de andere helft van het licht doorheen het staal passeert.
Dubbelstraal spectrofotometers verminderen de fouten die kunnen
veroorzaakt worden door plotselinge afwijkingen in de lampintensiteiten of
afwijkingen van signalen op de detector.
Wanneer de intensiteit van de lamp of de signalen op de detector
veranderen, zullen deze veranderingen een effect hebben op zowel het
signaal van het staal als op de blanco terwijl de verhouding van deze
signalen onveranderd zal blijven.

5.6 Kwalitatieve UV/Vis-metingen
5.6.1 Chromoforen
Het UV/Vis-spectrum van een stof kan heel vaak worden gebruikt om de aanwezigheid in een staal te identificeren. Vele stoffen, en zeker de
stoffen die gekleurd zijn, absorberen straling die karakteristiek is over een welbepaald golflengtegebied. Verschillende moleculaire groepen
kunnen aanleiding geven tot het absorberen van licht bij karakteristieke golflengten en staan gekend als chromoforen. Chromoforen zijn
functionele moleculaire groepen die de reden zijn waarom stoffen gekleurd kunnen zijn of waarom er straling bij een welbepaalde golflengte wordt
geabsorbeerd.
Chromoforen bezitten elektronen die in staat zijn om te worden geëxciteerd door de absorptie van UV- of zichtbaar licht. Veel sterk gekleurde
verbindingen bezitten ofwel een transitiemetaalion of een uitgebreid geconjugeerd systeem met afwisselend enkelvoudige en dubbele bindingen.
Zeer kleine veranderingen in de structuur van de stoffen, kunnen aanleiding geven tot extreem verschillende absorptiefenomenen. Dergelijke
veranderingen vormen de basis van vele pH-gevoelige indicatoren zoals fenolftaleïne.

5.6.2 Kwalitatieve toepassingen van UV/Vis-spectroscopie Het vergelijken van de UV/Vis-spectra van de twee structuren van
fenoltaleïne kunnen ons gemakkelijk doen afleiden of het molecule zich
in de geprotoneerde of in de gedeprotoneerde vorm bevindt.

5.6.2 Kwalitatieve toepassingen van UV/Vis-spectroscopie
UV/Vis-spectroscopie stelt ons in staat om zowel een specifiek moleculair deeltje te identificeren, maar dient bovendien als een
analytische vingerafdruktechniek.
Voorbeeld
Bron: Jacobs, M., Meynaerts, B., Chiaverini, N., Mortier, T. (2017). Recovering Bulk Gold
From Scrap Electronics to Synthesize Gold Colloids. The Chemical Educator (18), 135−136.
Het absorbantiespectrum van een goudzout ([AuCl4]–)
opgelost in methanol. De specifieke absorptiebanden werden
gebruikt als karakterisatie om effectief de goudzouten aan te
tonen tijdens een studentenonderzoeksproject.

5.6.3 Het effect van verschillende organische chromoforen
Organische stoffen die optreden als chromoforen bezitten elektronen die eenvoudig kunnen worden geëxciteerd en bijgevolg gepromoveerd naar
hogere energieniveaus door de absorptie van licht in het UV- of zichtbare gebied van het elektromagnetische spectrum. Organische chromoforen
bezitten vaak één of meerdere dubbele of drievoudige bindingen en/of aromatische structuren.

5.6.4 UV/Vis-absorptie door anorganische stoffen
De meeste anorganische stoffen absorberen UV- en/of zichtbare straling en vertonen absorptiespectra met meestal brede alsook
overlappende absorptiegebieden.
Stoffen van de eerste twee transitiereeksen behoren tot de meest gekleurde anorganische verbindingen. Absorptie door deze stoffen
houdt de transities in van elektronen tussen halfgevulde en gevulde d-orbitalen en bijgevolg zal de golflengte waarbij de
absorptie voorkomt afhankelijk zijn van het atoomnummer, de oxidatietoestand van het metaal alsook het ligand aan welke dit is gebonden.
Een gedetailleerde behandeling van de kleurenchemie van anorganische stoffen is echter buiten het bereik van deze cursus en behoort tot het
domein van de gevorderde anorganische chemie.

5.6.5 UV/Vis-absorptieprocessen voor Charge-transfer complexen
Vele anorganische en organische stoffen absorberen UV- of zichtbaar licht en kunnen ladingsov erdrachten ondergaan → charge-transfer
complexen
εmax ≈ 10 000 l mol-1 cm-1 of meer → deze verbindingen zijn zeer gekleurd zijn en zelfs bij zeer lage concentraties te kwantificeren.
Een `charge-transfer complex' bezit een elektronengevende groep
tezamen met een acceptorgroep. Wanneer de absorptie van licht
voorkomt, wordt een elektron overgedragen naar een orbitaal die
grotendeels geassocieerd wordt met de donerende groep naar een orbitaal
die grotendeels wordt geassocieerd met de accepterende groep. Dit
gedrag contrasteert met de absorptie van een organisch chromofoor
waarbij elektronen worden geassocieerd met gedeelde moleculaire
orbitalen.
In vele voorbeelden zal een metaalion optreden als de
elektronenacceptor.
Voorbeelden
KMnO4 = paars
K2Cr2O7 = oranje
[Cu(NH3)4]2+ = diepblauw

5.7 Kwantitatieve UV/Vis-spectroscopie
De meest voorkomende toepassing is de rechtstreekse meting van de analyten door colorimetrie. Dit is het gebruik van de spectrofotometer in het
zichtbare gebied van het elektromagnetisch spectrum waarbij iemand op het zicht de kleur van een staal kan observeren. Deze aanpak kan op een
analoge manier gebruikt worden onder de vorm van rechtstreekse metingen gemaakt door het instrument in het ultraviolette gebied. Met deze
techniek zal de concentratie van een analyt worden bepaald door de absorbantie van een onbekende concentratie van een stof te bepalen en te
vergelijken met de absorbantie van een gekende concentratie van hetzelfde materiaal.
Wanneer de molaire absorptiviteit van het analyt gekend is en een staal heeft een gekende of een te verwaarlozen achtergrondabsorbantie, kan de
concentratie van een analyt rechtstreeks worden bepaald gebruik makende van de wet van Lambert-Beer.
Deze eenpuntsmethode is eenvoudig om te doen, maar geeft vaak fouten wanneer het staal en de standaard niet dezelfde lineariteit vertonen in het
gebied volgens de wet van Lambert-Beer of als er verschillen zijn in voorwaarden die werden gebruikt om deze oplossingen te onderzoeken zoals
de pH van de oplossing of kleine veranderingen in de detectie van de golflengte.
Stel dat de molaire absorptiviteit van een analyt gelijk is aan 5,34 × 103 l mol–1 cm–1 bij een bepaalde golflengte. Hetzelfde analyt geeft een
absorbantie van 0,573 in een staal geplaatst in een 2,00 cm staalhouder waarbij een blanco werd gebruikt om de achtergrondabsorbantie van het
staal te corrigeren. Eén manier om de concentratie van het analyt in het staal te schatten is door het herschikken van de wet van Lambert-Beer
zodat

Betere benadering: meerdere standaarden met verschillende concentraties gebruiken, plot uittekenen volgens de wet van Lambert-Beer waarbij er
eerst standaarden worden gemeten onder dezelfde voorwaarden als die zullen worden gebruikt voor de stalen waaronder hetzelfde solvent en
dezelfde gebruikte golflengte.
Opgenomen spectra van verschillende concentraties aan kaliumpermanganaat opgelost in water die werden genomen met een Shimadzu UV/Vis
1800 spectrofotometer in een cuvet met een weglengte van één cm. De concentraties zijn respectievelijk 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 en 0,4 mM
aan kaliumpermanganaat in water.
525
Voorbeeld
De absorbanties bij 525 nm uitgezet in functie van de verschillende
concentraties aan kaliumpermanganaat.

Lineair verband tussen A en c.
De golflengte van 525 nm werd gekozen omdat bij deze golflengte kaliumpermanganaat maximaal absorbeert.
De golflengte waar een stof maximaal absorbeert wordt geschreven als λmax.
Met behulp van een regressie-analyse doorheen de datapunten wordt een vergelijking van een rechte bekomen.
De helling van deze rechte geeft ons een waarde voor de molaire
absorptiviteit van kaliumpermangnaat en werd in dit geval experimenteel
bepaald als
De absorbanties bij 525 nm uitgezet in functie van de verschillende
concentraties aan kaliumpermanganaat.

Voorbeeld 6.6
Bij een golflengte van 525 nm is experimenteel bepaald dat de molaire absorptiviteit van KMnO4 glijk is aan 2245 l mol-1cm-1. Een onbekend staal
KMnO4 werd 200 maal verdund en gepipetteerd in een cuvet met 1,00 cm weglengte. Een absorbantie van 0,363 werd met een UV/Vis-
spectrofotometer gemeten bij 525 nm. Bereken de concentratie aan KMnO4 in het onverdunde staal in mol/l.
De concentratie van het verdunde staal kan worden berekend uit

Hoofdstuk 5 - Spectrofotometrie

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Hoofdstuk 5 - Spectrofotometrie

Similar to Hoofdstuk 5 - Spectrofotometrie (15)

More from Tom Mortier

More from Tom Mortier (10)

Hoofdstuk 5 - Spectrofotometrie