HLA tipizacija – metodi i aplikacija u kliničkoj praksi

1. HLA tipizacija – metodi i aplikacija
u kliničkoj praksi
Studijski istraživački rad 2
Univerzitet u Nišu
Prirodno-matematički fakultet
Departman za biologiju i ekologiju
Student: Mentor:
Dimitrije Spasić Prof. dr Perica Vasiljević
Br. indexa 512

2. HLA = HUMANI LEUKOCITNI
ANTIGEN
Istorija
 Gorerov rad (1930) na antigenima odgovornim za alotransplantat
odbacivanje kod miševa dovelo je do otkrića „GLAVNOG KOMPLEKSA
HISTOKOMPATIBILNOSTI (MHC)“.
 Razvoj urođenih i rekombinantnih sojeva miševa od strane Snell–a
omogućilI su detaljnu analizu različitih lokusa ovog kompleksa.

3. HLA = HUMANI LEUKOCITNI
ANTIGEN
 Dausset je započeo studije o HUMANOM LEUKOCITNOM
ANTIGENU GLAVNI KOMPLEKS
HISTOKOMPATIBILNOSTI (MHC) u čoveku
 Benacerraf i kolege uspostavili su genetsku osnovu imunološkog
odgovora
 Za svoj rad na MHC-u i genetskoj kontroli imunološkog odgovora,
Snell, Dausset i Benacerraf su 1980. godine dobili Nobelovu
nagradu za medicinu.

4. HLA = HUMANI LEUKOCITNI
ANTIGEN
 Kompleks humanog leukocitnog antigena (HLA) je lokus gena
koji kodira proteine na površini ćelija odgovornih za regulaciju
imunološkog sistema kod ljudi
 Nalazi se na kratkom kraku hromozoma 6
 Nasleđeni kao haplotipovi (tj. skup alela) po jedan od svakog
roditelja
 Oni su kodominantno izraženi

5. HLA tipizacija ima veoma važnu ulogu u
medicini i medicinskim istraživanjima
 Primarna je meta imunoloških odgovora na alogene transplantacije
 Kritičan je za odgovor na antigene stimulanse
 Upleten je u genetsku osetljivost na autoimune bolesti

6. Metodi HLA tipizacije
 Serološka tipizacija
• Test mikrocitotoksičnosti
 Verifikacija HLA antitela
• Reakcija mešovitih limfocita
 Molekularne metode tipizacije
• Metod tipizacije korišćenjem sekvencno-specifičnih prajmera (PCR-SSP)
• Metod tipizacije korišćenjem sekvencno-specifičnih olegonukleotida (PCR-SSO)
• Metod tipizacije direktnim DNK sekvenciranjem

7. Serološka tipizacija
 Limfociti potencijalnih donatora i primalaca dodaju su u različite
bunariće mikrotitarskih ploča
 Dodaju se antitela specifična za HLA klase I i II
 Nakon inkubacije dodaje se komplement
 Citotoksičnost se procenjuje usvajanjem ili isključivanjem boje.

8. Test mikrocitotoksičnosti
Mikrolimfocitotoksični test: 3 faze
 Održivi limfociti se inkubiraju sa HLA specifičnim antitelima. Ako je
specifičan antigen prisutan na ćeliji, antitelo je vezano
 Dodaje se zečji serum kao izvor komplementa, inkubira. Ako je
antitelo vezano za HLA antigen na ćelijskoj površini, ono aktivira
komplement koji oštećuje ćelijsku membranu čineći je propusnom
za vitalne mrlje
 Rezultati se vizualizuju dodavanjem boje, obično fluorohroma, npr.
Etidijum bromida, iako su u prošlosti korišćeni i Tripan Blue i Eosin I

9. Test mikrocitotoksičnosti

10. Verifikacija HLA antitela
 Uočeno je da se limfociti jednog davaoca, kada se uzgajaju sa
limfocitima od nepovezanog davaoca, stimulišu na proliferaciju
 Utvrđeno je da je ova proliferacija prvenstveno posledica razlike u
antigenima klase II MHC (DR) i T ćelije jedne jedinke u interakciji sa
alogenskim ćelijama koje nose antigen MHC klase II (B ćelije,
dendritične ćelije, langerhansove ćelije itd.
 Ova reaktivnost je nazvana mešana reakcija limfocita (MLR) i
korišćena je za proučavanje stepena histokompatibilnosti

11. Mešana reakcija limfocita (MLR)
 U ovom testu, limfociti (ćelije odgovora) se pomešaju sa ozračenim
ili mitomicinom tretiranim leukocitima primaoca, koji sadrže B-
limfocite i monocite (ćelije stimulatora). Ćelije su kultivisane 4-6
dana
 T ćelije koje reaguju će prepoznati strane antigene klase II koji se
nalaze na donoru i proći će kroz transformaciju (sinteza i povećanje
DNK: blastogeneza) i proliferaciju (mitogeneza)
 T ćelije koje reaguju na strane antigene klase II su tipično ćelije tipa
CD4+ TH-1
 Ove promene se beleže dodavanjem radioaktivnog (tricija, 3H)
timidina u ćelijsku kulturu i praćenjem njegove ugradnje u DNK.

12. Mešana reakcija limfocita (MLR)

13. Molekularne metode tipizacije
(PCR bazirane metode)
 Metodi zasnovani na DNK analizama povećali su tačnost HLA
tipizacije i doveli do identifikacije serološki neotkrivenih alela i
mnogih podtipova seroloških specifičnosti
 Metode zasnovane na DNK analizama za tip HLA alela su se stoga
fokusirale na analizu nukleotidnih varijacija koje se javljaju i u
eksonu 2 i 3 gena klase I i u eksonu-2 gena klase II
 Polimorfizam se identifikuje direktno kao deo procesa PCR-a, iako
postoje koraci nakon amplifikacije, na primer (SSP)
 Proizvod koji sadrži interno locirani polimorfizam koji se može
identifikovati drugom tehnikom, npr. sondiranje oligonukleotida
specifično za sekvencu PCR (SSOP), PCR-RFLP, praćeno
sekvenciranjem i konformacionom analizom

14. Metod tipizacije korišćenjem
sekvencno-specifičnih prajmera
(PCR-SSP)
 SSP je brza metoda tipizacije koja koristi skupove parova prajmera za
pojačavanje specifične regije genomske DNK
 Efikasnost reakcije amplifikacije kontroliše se prajmerima koji pojačavaju
očuvane sekvence izabranog gena

15. Metod tipizacije korišćenjem
sekvencno-specifičnih
olegonukleotida (PCR-SSO)
 SSO: ova metoda uključuje selektivnu amplifikaciju mete praćenu
hibridizacijom na panelu oligonukleotidnih sondi
 Specifičnost za određeni HLA lokus postignuta je odabirom PCR prajmera
specifičnih za sekvencu u očuvanom regionu drugog egzona

16. Metod tipizacije direktnim DNK
sekvenciranjem
 HLA tipizacija zasnovana na sekvenci uključuje određivanje
nukleotidne sekvence amplifikovanog segmenta HLA gena
 Tipizacija direktnim DNK sekvenciranjem predstavlja prednosti u
odnosu na druge procedure zbog relativno brze (24-48) sati, visoke
rezolucije
 Pouzdaniji i specifičniji metod

17. Komparacija HLA tipizacije
molekularnim metodama

18. Klinički značaj HLA tipizacije
 U transplantaciji organa
 U transfuzijskoj terapiji
 U prevenciji bolesti
 Sporno očinstvo
 Antropološke studije

19. Zaključak
 Tipizacija humanog leukocitnog antigena (HLA) igra ključnu ulogu u poboljšanju
alokacije organa, tkiva, matičnih ćelija i koštane srži te omogućava bolje podudarnosti
primaocima
 Mnoge bolesti, poput ankilozantnog spondilitisa, bolesti jetre, abnormalne imunološke
funkcije i neke vrste raka povezane su sa specifičnim alelima HLA
 Uspeh transplantacije ili transfuzije ćelija ili tkiva snažno je povezan sa HLA
sistemima para davalac-primalac
 Postoje dve glavne metode za tipizaciju HLA, tj. otkrivanje HLA antitela i otkrivanje
HLA polimorfizma. Razvojem lančane reakcije polimeraze (PCR), tehnike zasnovane
na DNK dominiraju laboratorijama za tipizaciju zbog svoje preciznosti i ponovljivosti,
kao i povećane osetljivosti i rezolucije
 Razumevanje unakrsnog podudaranja, kao i HLA tipizacije za bilo koji vid
transplantacije i primena u kliničkoj praksi ključni je korak za postizanje uspešnog
ishoda

20. HVALA NA PAŽNJI!