Il documento descrive il processo di DNA fingerprinting, utilizzando marcatori STR per analizzare e confrontare profili genetici al fine di determinare relazioni di parentela. Vengono spiegate tecniche come l'elettroforesi e la PCR, evidenziando l'importanza degli enzimi di restrizione e dei primers nella generazione di copie di DNA. La procedura include la preparazione del gel e l'analisi dei risultati per confermare la compatibilità genetica tra il figlio e i potenziali padri.

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RELAZIONE DI LABORATORIO
TITOLO: DNA Fingerprinting (Test di paternità)
OBIETTIVO: Confrontare due o più DNA per confermare o escludere l'esistenza di un rapporto di
parentela
PREMESSA: Il DNA fingerprinting (o impronta genetica o DNA profiling) è una tecnica ampiamente
usata, dall'ambito medico a quello forense, per l'identificazione di un soggetto. Il DNA fingerprinting
si basa sull'analisi di marcatori STR (Short Tandem Repeats o microsatelliti) presenti nel genoma di
ogni individuo. Gli STR consistono in brevi sequenze di DNA (10-50 paia di basi) ripetute in tandem
numerose volte e presenti in diversi cromosomi. Il numero di ripetizioni è altamente variabile nei
diversi individui, ma è costante in ogni profilo e segue un pattern di ereditarietà mendeliana. L'analisi
di sequenze STR può essere effettuata mediante il taglio del DNA con enzimi di restrizione
(particolari proteine capaci di tagliare la molecola del DNA in siti specifici). Si ottengono in questo
modo frammenti di DNA di diversa lunghezza, contenenti sequenze STR, che possono essere separati
tramite elettroforesi su gel di agarosio. L’elettroforesi è una tecnica che permette di separare
frammenti di acido nucleico, in funzione del loro peso molecolare. Frammenti di DNA (carichi
negativamente per la presenza dei gruppi fosfato) in un campo elettrico migrano verso il polo
positivo e migrano tanto più velocemente quanto più sono piccoli. In questo modo dal DNA è
possibile ottenere un profilo genetico specifico per ciascun individuo e quindi confrontare il profilo
genetico tra i possibili padri dell’individuo.
CENNI TEORICI:
• Cosa sono gli STR?
I marcatori microsatelliti STR (Short Tandem Repeat) sono delle sequenze di DNA composte da
quattro nucleotidi ripetuti in tandem, che hanno un elevato grado di polimorfismo nella
popolazione umana. In parole più semplici, nella nostra sequenza di DNA ci sono delle regioni con
una “lunghezza variabile” da individuo a individuo. Andando a identificare molte di queste regioni
possiamo determinare un profilo genetico unico per ogni essere umano.
Essendo discriminanti, misurabili e invariabili nel tempo vengono scelti come marcatori per
distinguere gli individui gli uni dagli altri.
• Cosa sono gli enzimi di restrizione?
Gli enzimi di restrizione sono particolari enzimi in grado di riconoscere delle sequenze specifiche di
nucleotidi lungo un filamento di DNA e di catalizzare un taglio (un'idrolisi) esattamente in

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corrispondenza di esse. La loro scoperta è avvenuta mediante l'osservazione che il DNA proveniente
da un ceppo di Escherichia coli se introdotto (tramite trasformazione batterica) in un ceppo diverso,
veniva letteralmente tagliato in piccoli frammenti. In seguito, si osservò che la stessa cosa
accadeva al DNA virale quando i batteri venivano infettati. Ovvero, il DNA del virus veniva fatto a
pezzettini e questi frammenti erano così resi inattivi. Si disse che la crescita virale era ristretta in un
determinato ceppo batterico, da qui il termine "restrizione" per definire gli enzimi in grado di fare
quanto osservato. In particolare, i batteri possiedono quelle che vengono definite endonucleasi di
restrizione, enzimi che tagliano i legami interni ad una certa sequenza nucleotidica sia essa di un
filamento di DNA o all'interno di DNA circolare.
• Che cos’è l’elettroforesi?
L'elettroforesi è una tecnica utilizzata nell'ambito delle analisi di laboratorio che sfrutta la massa
molecolare e la carica elettrica delle proteine, per valutarne la quantità e la qualità. In particolare,
quest'esame consente di separare le proteine in cinque frazioni: albumina, alfa 1 globuline, alfa 2
globuline, beta globuline e gamma globuline. L'alterazione del rapporto tra questi tipi di proteine è
indicativa di alcune condizioni patologiche. L'elettroforesi può essere eseguita su campioni di siero
sanguigno, urine o altri liquidi biologici, come il liquor (liquido cerebrospinale).

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MATERIALI E STRUMENTI:
1. Strumentazione occorrente
Camera per elettroforesi orizzontale con
vassoio, pettine e gel agarosio
Micropipette da 10-100 µl (per prelevare i
campioni di DNA)
Alimentatore per elettroforesi Puntali adatti alle micropipette
2. Materiali
4 provette (eppendorf) con DNA e loading DYE
(LD):
1. Della madre
2. Del figlio
3. Del possibile padre #1
4. Del possibile padre #2
Fast Blast DNA stain a concentrazione 100x (è il
colorante che permette di visualizzare la corsa
elettroforetica senza aver bisogno del trans
illuminatore);
Pipetta graduata da 10mL
Becker 250mL

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TAE 1X (Tris-Acetato EDTA) (è un buffer con
potere tamponante e che conduce corrente
elettrica)
Acqua distillata
Cilindro graduato
PROCEDURA:
1. Preparazione del gel d'agarosio
• Utilizzando la vaschetta per elettroforesi inserire gli appositi pettini per la formazione dei
pozzetti.
• Sciogliere il gel di agarosio contenuto nel flacone in un forno a microonde o su una piastra
riscaldante, togliere il tappo e mescolare dopo un minuto a 550W.
• Quando la soluzione sarà completamente trasparente, attendere qualche minuto per farla
raffreddare fino a circa 50°.
• Versare il gel nell’apposita vaschetta con pettini, facendo attenzione a non formare bolle
• Aspettare circa 30 minuti perché raffreddandosi il gel polimerizza.
• Una volta che il gel è polimerizzato, togliere il pettine per la formazione dei pozzetti e ricoprire
il gel con il tampone TAE buffer 1x.
Per ottenerlo prelevare 50ml di buffer concentrato 5X in 200ml di acqua distillata.
2. Preparazione dei campioni e corsa elettroforetica

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• Aggiungere 10 μl di ciascun campione nei pozzetti utilizzando una micropipetta.
Pozzetto1- DNA della madre
Pozzetto2- DNA del bambino
Pozzetto3- DNA del possibile padre #1
Pozzetto4- DNA del possibile padre #2
• Chiudere il coperchio dell’alimentatore, accendere l’alimentatore e verificare il passaggio di
corrente attraverso l’emissione di bolle in prossimità degli elettrodi. La corsa elettroforetica
necessita di un voltaggio di circa 12-15 V/cm. Per un gel di 8 cm di lunghezza il voltaggio è di
100 V.
• Quando il fronte di migrazione indicato dal Loading Dye (LD) di colore blu raggiunge la fine del
gel (circa 90 minuti) staccare l’alimentatore e procedere alla colorazione per la visualizzazione
delle bande.
3. Colorazione del gel mediante Fast Blast DNA Stain
• Una volta arrestata la corsa elettroforetica, estrarre il gel e immergerlo in una vaschetta
contenete il colorante del DNA ad una concentrazione di 1x per circa 20-30 minuti, agitando
lentamente
• Trasferire il gel in un nuovo contenitore per la decolorazione
• Decolorare il gel mediante due lavaggi in acqua calda di 5 minuti ciascuno, sempre agitando
lentamente e con cautela
OSSERVAZIONE e CONCLUSIONE:

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Osservare dopo un po’ la comparsa delle bande. Confrontare il profilo genetico del figlio con i due
possibili padri.
Il profilo genetico del figlio è combaciante con il profilo genetico del secondo padre.
Che cos’è la PCR?
La reazione a catena della polimerasi, in inglese Polymerase Chain Reaction o PCR, è una tecnica di
biologia molecolare inventata nel 1983 che permette di replicare in maniera selettiva degli
specifici tratti di DNA. Questo processo, che avviene in natura all'interno di tutte le cellule viventi,
viene riprodotto in vitro in ambiente controllato e applicato in campo medico e diagnostico, forense e
nelle analisi alimentari. La PCR funziona un po' come una fotocopiatrice che, partendo da un
segmento di DNA e conoscendone il punto di inizio e di fine, ne riesce a produrre più copie identiche
in breve tempo. Il primo step per effettuare la PCR è quello di misurare e mixare con un ordine
preciso tutti i reagenti necessari all'interno di una provetta. Questa sarà poi inserita in un
macchinario chiamato termociclatore. Nello specifico gli ingredienti che ci serviranno sono:
• DNA originale/bersaglio: deve essere preventivamente estratto e purificato per essere
utilizzato come stampo;
• DNA polimerasi termostabile: si tratta di un enzima fondamentale, senza il quale non
potrebbe avvenire la replicazione;
• Primers: sono brevi frammenti di DNA sintetici che faranno partire e terminare la reazione di
amplificazione;
• Desossiribonucleotidi trifosfato (dNTP): hanno un nome complicato ma sono
semplicemente i "mattoncini" – a cui però è stato aggiunto uno zucchero e un gruppo fosfato-
che verranno aggiunti, uno per uno e sempre in una direzione specifica, per riformare la catena
complementare di DNA;
• Soluzione buffer: si tratta di una soluzione contenente additivi che mantiene il pH di reazione
stabile;
• Altri additivi: migliorano le prestazioni della reazione;
• Acqua distillata: la si aggiunge per portare il mix al volume desiderato.

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Una volta creato il nostro mix, quindi, le provette vengono inserite nel macchinario e portate a
specifiche temperature per qualche secondo, dando modo alle reazioni di avvenire. Ad ogni ciclo il
numero di filamenti aumenta fino a raggiungere circa 2 miliardi (2.000.000.000) di copie attorno al 31°
ciclo. Per arrivare a questi numeri possono bastare solamente dalle 2 alle 4 ore all'interno del
macchinario!
Ora analizziamo le tre fasi in ordine: denaturazione, appaiamento, estensione.
1. Denaturazione
In questa prima fase si alza la temperatura fino a circa 90°C o più permettendo al doppio filamento
di DNA di separarsi in due, aprendosi come fosse una cerniera lampo. Questo avviene perché si
rompono i legami idrogeno che tengono assieme i filamenti complementari del DNA contenenti la
regione da amplificare.
2. Appaiamento o annealing
Abbassando la temperatura tra i 50 e i 60° C circa, si favorisce l'appaiamento dei primers, due
segmenti formati da oligonucleotidi che definiranno gli estremi della regione bersaglio. Hanno una
lunghezza di circa 15-30 basi e si uniranno in maniera complementare al DNA stampo nella porzione

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di nostro interesse, formando delle porzioni che fungeranno da innesco. In una stessa reazione di
PCR si utilizzano più primer differenti.
3. Estensione
In questa fase la temperatura viene fatta risalire attorno ai 72°C in modo che la polimerasi
(termostabile anche ad alte temperature) sintetizzi i nuovi filamenti complementari nella direzione
corretta, aggiungendo uno dopo l'altro i nucleotidi (i nostri mattoncini) complementari al filamento
stampo. In vitro si usa generalmente la Taq polimerasi, un enzima estratto dal batterio Thermus
aquaticus che resiste alle alte temperature e non si denatura durante i cicli.
In questo modo si ricrea il doppio filamento che sarà quindi formato da una stringa "originale" e una
complementare nuova di zecca.
Ipotizzando di essere partiti da 1 filamento di DNA a doppia elica alla fine del primo ciclo avremo
ottenuto 2 filamenti a doppia elica.
Al termine di questa fase la temperatura torna a salire fino a 90°C, denaturando nuovamente i
filamenti e facendo ricominciare il ciclo.