More Related Content Similar to Cromatografía (20) 6. DDeessccuubbrriiddoorr
• EEll bboottáánniiccoo rruussoo MMiikkhhaaiill TTsswweetttt ((MMiikkhhaaiill
SSeemmeennoovviicchh TTssvveetttt,, 11887722--11991199))
7. DDeeffiinniicciióónn
• CCrroommaattooggrraaffííaa eess uunn mmééttooddoo ddee
sseeppaarraacciióónn eenn eell qquuee ssee aapprroovveecchhaann llaass
ddiiffeerreenncciiaass eenn eell ccoommppoorrttaammiieennttoo ddee
ppaarrttiicciióónn eennttrree uunnaa ffaassee mmóóvviill yy uunnaa ffaassee
eessttaacciioonnaarriiaa ppaarraa sseeppaarraa llooss ccoommppoonneenntteess
ddee uunnaa mmeezzccllaa.
8. CCrroommaattooggrraaffííaa,, ddeeffiinniicciióónn ((ccoonntt.))
• UUnnaa ccoolluummnnaa uu oottrroo ssooppoorrttee mmaannttiieenneenn aa
llaa ffaassee eessttaacciioonnaarriiaa yy llaa ffaassee mmóóvviill aaccaarrrreeaa
aa llaa mmuueessttrraa.
• LLooss ccoommppoonneenntteess ddee llaa mmuueessttrraa qquuee
ppaarrttiicciioonnaann ffuueerrtteemmeennttee ccoonn llaa ffaassee
eessttaacciioonnaarriiaa eessttaarráánn mmááss ttiieemmppoo ddeennttrroo
ddee llaa ccoolluummnnaa.
9. SSii eess eenn ccoolluummnnaa ::
• CCoonnffoorrmmee llooss ccoommppoonneenntteess ssoonn eelluuiiddooss
ddee llaa ccoolluummnnaa,, ppuueeddeenn sseerr ccuuaannttiiffiiccaaddooss
ppoorr uunn ddeetteeccttoorr yy ccoolleeccttaaddooss ppaarraa aannáálliissiiss
ppoosstteerriioorr
10. MMééttooddooss ccrroommaattooggrrááffiiccooss
• DDee ggaasseess
• EEnn ccaappaa ffiinnaa
• EEnn llííqquuiiddooss iinnmmoovviilliizzaaddooss
• DDee eexxcclluussiióónn mmoolleeccuullaarr
• IInntteerrccaammbbiioo iióónniiccoo
• HHiiddrrooxxiiaappaattiittaa
• HHiiddrrooffóóbbiiccaa
• AAffiinniiddaadd
• HHPPLLCC
11. EExxcclluussiióónn mmoolleeccuullaarr
• FFaassee eessttaacciioonnaarriiaa::
– DDeexxttrráánn ccoonn eennllaacceess ccrruuzzaaddooss
– AAggaarroossaa ccoonn eennllaacceess ccrruuzzaaddoo
– PPoolliiaaccrriillaammiiddaa
• LLaass mmoollééccuullaass ggrraannddeess fflluuyyeenn mmááss
rrááppiiddoo qquuee llaass ppeeqquueeññaass.
12. DDeessaarrrroolllloo ddee uunnaa ccrroommaattooggrraaffííaa
ddee eexxcclluussiióónn mmoolleeccuullaarr
• DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell ttaammaaññoo ddee llaa
ccoolluummnnaa
• HHiiddrraattaacciióónn yy llaavvaaddoo ddee llaa rreessiinnaa
• EEmmppaaqquuee ddee llaa ccoolluummnnaa
• DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell vvoolluummeenn vvaaccííoo
• CCoorrrriimmiieennttoo ddee llaa mmuueessttrraa
16. CCaarraacctteerrííssttiiccaass ddee llaass rreessiinnaass
ddee EEMM cclláássiiccaass
BioGel
Sephadex
P-60
P-100
P-200
P-300
G-50
G-100
G-150
G-200
3-60
5-100
30-200
60-300
2-30
4-150
5-300
5-600
Nombre Código
Rango de
Fraccionamiento
(kDa)
Flujo máximo
(cm/hr)
55435532
18. IInntteerrccaammbbiioo iióónniiccoo
• LLaass pprrootteeíínnaass ddiiffiieerreenn mmuucchhoo eenn ssuu aaffiinniiddaadd
ppoorr mmaatteerriiaalleess ccaarrggaaddooss ppoossiittiivvaa oo
nneeggaattiivvaammeennttee..
• LLooss ssooppoorrtteess ppuueeddeenn sseerr::
– DDeexxttrráánn ccoonn eennllaacceess ccrruuzzaaddooss
– AAggaarroossaa ccoonn eennllaacceess ccrruuzzaaddoo
– PPoolliiaaccrriillaammiiddaa
– CCeelluulloossaa
– PPoolliieessttiirreennoo
– SSíílliiccee
20. PPrriinncciippiiooss ddeell iinntteerrccaammbbiioo
iióónniiccoo
• LLaa aaffiinniiddaadd ddee uunnaa pprrootteeíínnaa eess pprrooppoorrcciioonnaall
aa llaa ccoonncceennttrraacciióónn ddee ssaall rreeqquueerriiddaa ppaarraa
lliibbeerraarrllaa ddeell mmaatteerriiaall..
• UUnnaa ccoolluummnnaa ssee ccaarrggaa ((ddee pprrootteeíínnaass)) ccoonn
uunn aammoorrttiigguuaaddoorr ddee bbaajjaa ffuueerrzzaa iióónniiccaa yy llaa
eelluussiióónn ssee iinniicciiaa ppoorr iinnccrreemmeennttoo ddee llaa
ccoonncceennttrraacciióónn ddeell aammoorrttiigguuaaddoorr ddee eelluussiióónn..
21. DDeessaarrrroolllloo ddee uunnaa ccrroommaattooggrraaffííaa
ddee iinntteerrccaammbbiioo iióónniiccoo
• HHiiddrraattaacciióónn yy LLaavvaaddoo ddee llaa rreessiinnaa
• AAccttiivvaacciióónn ((llaavvaaddoo ccoonn áácciiddoo yy bbaassee
ffuueerrttee ddiilluuiiddooss,, HHCCll 11MM sseegguuiiddoo ddee NNaaOOHH
11MM yy ffiinnaallmmeennttee ccoonn llaa ssaall qquuee ssee uussaarráá
eejj.. NNaaCCll 11MM yy eeqquuiilliibbrraarr ccoonn bbuuffffeerr ssiinn ssaall))
• VVoolluummeenn ddee llaa ccoolluummnnaa yy ccaappaacciiddaadd ddee
rreetteenncciióónn ddee llaa rreessiinnaa..
22. Diferentes ssaalleess ttiieenneenn ddiiffeerreenntteess ffuueerrzzaass
ddee eelluucciióónn ccuuaannddoo ssee uussaann eenn
ccrroommaattooggrraaffííaa ddee iinntteerrccaammbbiioo iióónniiccoo..
• IInntteerrccaammbbiioo ddeell aanniióónn
– cciittrraattoo>>ssuullffaattoo>>ooxxaallaattoo>>II-->>NNOO33
--22>>CCrrOO44
-->>BBrr-- >>
SSCCNN-- >> CCll-- >> FFoorrmmiiaattoo
• IInntteerrccaammbbiioo ddeell ccaattiióónn
– BBaa22++ >> PPbb22++ >> SSrr22++ >> CCaa22++ >> NNii22++ >> CCdd >> CCuu >>
CCoo >> ZZnn>>MMgg>>TTii++>> AAgg >>
RRbb++>>CCss++>>KK++>>NNHH44
++>>NNaa++>>HH++>>LLii++
23. AAmmoorrttiigguuaaddoorreess
• PPaarraa iinntteerrccaammbbiiaaddoorreess aanniióónniiccooss ssee
ddeebbeenn uussaarr aammoorrttiigguuaaddoorreess ccaattiióónniiccooss
oo zzwwiitttteerriioonniiccooss
• NNoo uussaarr aammoorrttiigguuaaddoorreess aanniióónniiccooss ppuueess
ssee uunneenn aa llaa rreessiinnaa..
• UUssaarr ddeetteerrggeenntteess ccaattiióónniiccooss oo nnoo
iióónniiccooss..
25. HHiiddrrooxxiiaappaattiittaa ((HHAA))
• IInnttrroodduucciiddaa ppoorr TTiisseelliiuuss eett aall.. eenn 11995566
• BBeerrnnaarrddii rreeaalliizzóó uunn eessttuuddiioo ssiisstteemmááttiiccoo
((MMeetthh.. IInn EEnnzziimmooll.. VVooll.. 2222 yy 2277))
Tiselius A et al., (1956) Protein chromatography on calcium phosphate
columns, Arch Biochem Biophys 65, 132–155
26. FFóórrmmuullaa
• FFoorrmmaa ccrriissttaalliizzaaddaa ddee ffoossffaattoo ddee ccaallcciioo
((Ca10(PO4)6(OH)2)
Kawasaki T et al., (1985) Hydroxyapatite high-performance liquid chromatography:
column performance for proteins, Eur J Biochem 152, 361–371
27. UUnniióónn sseelleeccttiivvaa ddee pprrootteeíínnaass aa
llaa hhiiddrrooxxiiaappaattiittaa
• AA,, eess uunnaa pprrootteeíínnaa
bbáássiiccaa..
• BB,, eess uunnaa pprrootteeíínnaa
aaccííddiiccaa
• EEll ttrriiáánngguulloo iinnddiiccaa
eennllaacceess ddee ccoooorrddiinnaacciióónn..
• LLooss ddoobblleess ppaarréénntteessiiss
iinnddiiccaann rreeppuullssiióónn..
• LLaass llíínneeaass ppuunntteeaaddaass
iinnddiiccaann eennllaacceess iióónniiccooss..
Los grupos amino son atraídos por los sitios fosfato pero
repelidos por los sitios carboxilo. Esto es al contrario para
los carboxilos.
28. AAddssoorrcciióónn ddee ggrruuppooss aammiinnoo
• SSee ddeebbee aa iinntteerraacccciióónn eelleeccttrroossttááttiiccaa nnoo
eessppeeccííffiiccaa eennttrree ssuu ccaarrggaass ppoossiittiivvaass yy
llaass ccaarrggaass ggeenneerraalleess nneeggaattiivvaass ddee llaa
ccoolluummnnaa ddee HHAA ccuuaannddoo llaa ccoolluummnnaa eess
eeqquuiilliibbrraaddaa ccoonn aammoorrttiigguuaaddoorr ddee
ffoossffaattoo..
29. IInnccrreemmeennttoo ddee llaa uunniióónn ddee aammiinnaass
ppoorr bbllooqquueeoo ddee llaa rreeppuullssiióónn..
• AA,, eess uunnaa pprrootteeíínnaa
bbáássiiccaa..
• BB,, eess uunnaa pprrootteeíínnaa
aaccííddiiccaa
• EEll ttrriiáánngguulloo iinnddiiccaa
eennllaacceess ddee ccoooorrddiinnaacciióónn..
• LLooss ddoobblleess ppaarréénntteessiiss
iinnddiiccaann rreeppuullssiióónn..
• LLaass llíínneeaass ppuunntteeaaddaass
iinnddiiccaann eennllaacceess iióónniiccooss..
Los grupos fosfatos en solución pueden cubrir a calcios que
repelerían a los grupos aminos.
30. DDiissoocciiaacciióónn sseelleeccttiivvaa ddee llaa
hhiiddrrooxxiiaappaattiittaa
• AA,, eess uunnaa pprrootteeíínnaa
bbáássiiccaa..
• BB,, eess uunnaa pprrootteeíínnaa
aaccííddiiccaa
• EEll ttrriiáánngguulloo iinnddiiccaa
eennllaacceess ddee
ccoooorrddiinnaacciióónn.. NNoottaarr
qquuee eessttooss nnoo ssee
aaffeeccttaann..
31. Efecto de llaa ccoonncceennttrraacciióónn ddee
ffoossffaattoo eenn llaa uunniióónn ddee pprrootteeíínnaass
• EEll ppeerrffiill ssuuppeerriioorr ffuuee
ccaarrggaaddoo ccoonn ffoossffaattoo 11
mmMM
• EEll iinnffeerriioorr,, ccoonn ffoossffaattoo
5500 mmMM..
• LLaa ccaappaacciiddaadd ddee uunniióónn
ddee llaass IIggGG ssee mmeejjoorróó
rreedduucciieennddoo llaa
ccoommppeetteenncciiaa ddee
ccoonnttaammiinnaanntteess..
32. BBaarrrriiddoo ccoonn ddooss ggrraaddiieenntteess
• EEll pprriimmeerr ggrraaddiieennttee vvaa
ddee 00 aa 550000 mmMM ddee
cclloorruurroo ddee ssooddiioo..
• EEll sseegguunnddoo,, ddee 00 aa 550000
mmMM ddee ffoossffaattoo ddee
ppoottaassiioo..
• EEll aammoorrttiigguuaaddoorr bbaassee
eess 00..55 MM MMEESS,, 11mmMM
ffoossffaattoo,, ppHH 66..
• LLaa eelluussiióónn ddee llaa IIggGG ssee
oobbsseerrvvaa eenn ggrriiss
34. BBaasseess ddee llaa TTééccnniiccaa
• SSuu sseelleeccttiivviiddaadd nnoo ddeeppeennddee ddee llaa mmaassaa
mmoolleeccuullaarr,, ddeennssiiddaadd ddee ccaarrggaa oo ppuunnttoo
iissooeellééccttrriiccoo..
35. BBaasseess ddee llaa ttééccnniiccaa
• LLaa aaddssoorrcciióónn yy llaa eelluucciióónn ddee llaass pprrootteeíínnaass
nnoo ssoonn pprroocceessooss eenn rreevveerrssaa ddee uunn ssoolloo
eeffeeccttoo..
• LLooss ggrruuppooss aammiinnoo yy ccaarrbbooxxiilloo aaccttúúaann ddee
mmaanneerraa ddiiffeerreennttee eenn llaa aaddssoorrcciióónn ddee llaass
pprrootteeíínnaass aa llaa HHAA..
• LLaa eelluucciióónn ddee pprrootteeíínnaass áácciiddaass yy bbáássiiccaass
ppoorr ddiiffeerreenntteess ssaalleess ttiieennee ddeeffeerreenntteess
mmeeccaanniissmmooss..
36. VVeennttaajjaass
• HHAA ttiieennee ppooccoo ppooddeerr ddee aaddssoorrcciióónn ddee
mmoollééccuullaass ddee mmaassaa mmoolleeccuullaarr bbaajjaa
ccoommoo nnuucclleeóóttiiddooss,, ssaalleess yy aammiinnooáácciiddooss..
• EEss rreellaattiivvaammeennttee iinnccoommpprreessiibbllee..
• EExxiisstteenn vvaarriiaanntteess cceerráámmiiccaass mmááss ffáácciilleess
ddee ttrraabbaajjaarr ppuueess nnoo ssee ccoommppaaccttaann..
38. CCrroommaattooggrraaffííaa HHiiddrrooffóóbbiiccaa
• LLooss ggrruuppooss aaddiicciioonnaaddooss aall ssooppoorrttee ssoonn eell
aallccoohhooll ooccttíílliiccoo,, ggrruuppooss bbeennccéénniiccooss uu oottrrooss
ggrruuppooss hhiiddrróóffoobbooss ccoommoo hhiiddrrooccaarrbbuurrooss
((CC44,, CC88 oo CC1188))..
• LLooss cceennttrrooss hhiiddrróóffoobbooss ddee llaass pprrootteeíínnaass ssoonn
eexxppuueessttooss ppoorr eexxcceessoo ddee ssaalliinniiddaadd yy ssoonn
aattrraappaaddooss ppoorr llaa ccoolluummnnaa..
40. SSeerriieess ccaaoottrróóppiiccaass
• AAnniioonneess
PPOO44
––>>SSOO44
––>>CCHH33CCOOOO––>>CCLL––>>BBrr––>>NNOO33––
>>CCllOO44
––>>II>>SSCCNN––
• CCaattiioonneess
NNHH44
++>>RRbb++>>KK>>NNaa++>>CCss++>>LLii++>>MMgg>>CCaa22++>>BBaa22++
41. CCrroommaattooggrraaffííaa ddee AAffiinniiddaadd
• SSiisstteemmaa mmuuyy ppooddeerroossoo ddee ppuurriiffiiccaacciióónn
• SSiisstteemmaa rreessttrriinnggiiddoo
• SSee bbaassaa eenn llaa iinntteerraacccciióónn eessppeeccííffiiccaa ddee
ddooss ccoommppuueessttooss
–AAnnttííggeennoo -- AAnnttiiccuueerrppoo
–EEnnzziimmaa -- ssuussttrraattoo
–RReecceeppttoorr -- LLiiggaannddoo
44. LLiimmiittaacciioonneess ddee llaa ccrroommaattooggrraaffííaa
aa bbaajjaass pprreessiioonneess
• IImmppoossiibbiilliiddaadd ffííssiiccaa ddee aauummeennttaarr eell fflluujjoo
– RReessiinnaass ccoommpprreessiibblleess
• CCoorrrriiddaass ddee mmuucchhaass hhoorraass
• GGrraannddeess vvoollúúmmeenneess
45. DDeessccuubbrriimmiieennttooss qquuee
ffaacciilliittaarroonn llaa HHPPLLCC
• SSíínntteessiiss ddee rreessiinnaass iinnccoommpprreessiibblleess
• NNuueevvaass ttééccnniiccaass eenn eell eemmppaaqquuee ddee
llaass ccoolluummnnaass
• MMiiccrrooppaarrttiiccuullaacciióónn ddee llaass rreessiinnaass
• AAddeellaannttooss eenn llaa tteeccnnoollooggííaa
eessppeeccttrrooffoottoommeettrriiccaa
46. TTiippooss ddee HHPPLLCC
• DDee eexxcclluussiióónn mmoolleeccuullaarr
• IInntteerrccaammbbiioo iióónniiccoo
• HHiiddrrooffóóbbiiccaa
• AAffiinniiddaadd
• DDee ffaassee rreevveerrssaa
47. IInnssttrruummeennttaacciióónn
• SSiisstteemmaa ddee bboommbbeeoo
– RReessiisstteennttee aa qquuíímmiiccooss
– PPooccaa vvaarriiaabbiilliiddaadd
– PPrreessiioonneess ddee 3300 aass 440000 aattmm
– FFlluujjoo ccoonnssttaannttee ((lliibbrree ddee ppuullssooss))
– BBuueenn mmeezzccllaaddoo ddee llooss ssoollvveenntteess
– RReepprroodduucciibbiilliiddaadd eenn llaa ffoorrmmaacciióónn ddee llooss
ggrraaddiieenntteess
48. TTiippooss ddee bboommbbaass
• JJeerriinnggaa
• PPiissttóónn rreeccíípprrooccoo
• DDiiaaffrraaggmmaa
• PPrreessiióónn ccoonnssttaannttee
49. DDeetteeccttoorreess
• DDeetteeccttoorreess ddee UUVV--VViissiibbllee qquuee ppuueeddaa
lleeeerr 22 oo mmááss lloonnggiittuuddeess ddee oonnddaa aall
mmiissmmoo ttiieemmppoo
• DDeetteeccttoorr ddee aarrrreegglloo ddee ddiiooddooss.. EEssppeeccttrroo
ddee 220000 aa 660000 nnmm eenn mmeennooss ddee 11
sseegguunnddoo..
50. CCrroommaattooggrraaffííaa ddee ffaassee rreevveerrssaa
• SSee bbaassaa eenn llaass pprrooppiieeddaaddeess hhiiddrrooffóóbbiiccaass ddee llaass
pprrootteeíínnaass..
• EEll pprroocceessoo ddee eelluucciióónn eess ddiiffeerreennttee qquuee eenn llaa
ccrroommaattooggrraaffííaa hhiiddrrooffóóbbiiccaa
• LLaa ffaassee mmóóvviill eess uunn ssoollvveennttee oorrggáánniiccoo ((mmeettaannooll,,
22--pprrooppaannooll oo aacceettoonniittrriilloo) aacciiddiiffiiccaaddoo ((TTFFAA,,
áácciiddoo ffoossffóórriiccoo,, aaccééttiiccoo oo hhiiddrrooxxiibbuuttíírriiccoo)..
51. FFaassee eessttaacciioonnaarriiaa
• SSíílliiccaa aaccooppllaaddaa ccoonn uunn ddeerriivvaaddoo
aallqquuiillssiillaannoo..
• LLaa lloonnggiittuudd ddee llaa ccaaddeennaa aallqquuiilloo ppuueeddee
sseerr ddee CC44,, CC88,, CC1188..
• LLaa ppoorroossiiddaadd ddeell ssooppoorrttee eess vvaarriiaabbllee yy
ssee rreeccoommiieennddaa o
qquuee sseeaa eennttrree 330000 aa
11000000 AA
• EEll ttaammaaññoo ddee llaass ppaarrttííccuullaass eess ddee 55 aa
2200 mmm
52. FFaassee mmóóvviill
• LLaa aacciiddeezz ddee llaa ffaassee mmóóvviill::
– IInnfflluueenncciiaa eell eessttaaddoo iióónniiccoo ddee llaa
pprrootteeíínnaa
–CCoonnttrroollaa llaa iioonniizzaacciióónn ddee llaa ssuuppeerrffiicciiee
ssiillaannooll
–FFoorrmmaa ppaarreess iióónniiccooss ccoonn llaa zzoonnaa
ccaattiióónniiccaa ddee llaa pprrootteeíínnaa
–FFaavvoorreeccee llaa eexxppoossiicciióónn ddee zzoonnaass
hhiiddrrooffóóbbiiccaass ddee llaa pprrootteeíínnaa
54. HHPPLLCC ddee FFaassee RReevveerrssaa
• SSeeppaarraacciióónn eeffiicciieennttee aaúúnn ccoonn
ccoonncceennttrraacciioonneess aallttaass ddee pprrootteeíínnaass
• BBaajjoo rruuiiddoo ddee ffoonnddoo
• SSoollvveenntteess vvoollááttiilleess
• FFáácciill ffoorrmmuullaacciióónn ddee llaa ffaassee mmóóvviill
• RReepprroodduucciibbiilliiddaadd ddee ggrraaddiieenntteess..
55. DDiiaaggrraammaa ddeell ssiisstteemmaa HHPPLLCC
MMaanneejjaaddoorr ddee mmuueessttrraass MMaanneejjaaddoorr ddee ssoollvveennttee
CCeellddaa MMiiccrroobboorree
CCeellddaa AAnnaallííttiiccaa
TTeerrmmoossttaattoo ddee llaa ccoolluummnnaa
Columna
CCeellddaa PPrreeppaarraattiivvaa
64. GGaass ddee aaccaarrrreeoo
• Con ciertos tipos de columnas y ddeetteeccttoorreess,, ssee rreeqquuiieerree
eell uussoo ddee uunn ggaass ddee ccoommpplleemmeennttoo eenn eell ddeetteeccttoorr ((““mmaakkee--
uupp””)..
• EEll ““mmaakkee--uupp””,, eess uunn ggaass ddee aarrrraassttrree aaddiicciioonnaaddoo aall
eefflluueennttee ddee llaa ccoolluummnnaa aanntteess ddee qquuee ppaassee aall ddeetteeccttoorr..
• EEll ssiisstteemmaa ddeell ggaass ppoorrttaaddoorr,, ppoorr lloo ggeenneerraall ccoonnttiieennee uunnoo
oo vvaarriiooss ttaammiicceess ccoonn eell oobbjjeettoo ddee eelliimmiinnaarr hhuummeeddaadd,,
hhiiddrrooccaarrbbuurrooss yy ooxxííggeennoo..
• LLooss ccaauuddaalleess uuttiilliizzaaddooss eenn llaass ccoolluummnnaass eemmppaaccaaddaass
oosscciillaa eennttrree 2255 yy 9900 mmLL//mmiinn yy ddee 11 aa 22 mmLL//mmiinn eenn llaass
ccaappiillaarreess..
