ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования» Современные возможности генотипирования Chlamydia trachomatis Полуян О.С. м.н.с. группы ПЦР- диагностики ЦНИЛ БелМАПО

1. ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного
образования»
СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ
ГЕНОТИПИРОВАНИЯ
CHLAMYDIA TRACHOMATIS
Полуян О.С.
м.н.с. группы ПЦР- диагностики ЦНИЛ
БелМАПО

2. КЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОТИПОВ CHL.TRACHOMATIS
У Chl.trachomatis выделяют 18 антигенных
вариантов (серотипов), объединенных в 3 группы:
Первая группа - возбудители трахомы (серотипы
переносчиками являются
A, B, Ba, C),
насекомые, основной путь заражения - попадание
инфекционного агента посредством втирания в
область слизистой оболочки глаза.
Вторая группа (встречается только у человека) -
возбудители урогенитального хламидиоза (серотипы
D, E, F, G, H, I, J, K). Заражение при урогенитальном
хламидиозе (УГХ) происходит половым путем.
Третья группа (серотипы L1, L2, L3) - возбудители
тропической венерической лимфогранулемы.
Серотипы венерического лимфогранулематоза
распространяются через
Chl.trachomatis
лимфатическую систему, инфицируют макрофаги и
эпителиальные клетки.

3. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ответа организма
Вариабельность
пациента с воспалительными
заболеваниями урогенитального
тракта, вызванными инфицированием
Chl.trachomatis;
Разнообразие клинических проявлений
хламидийной инфекции;
Различия в эффективности проводимой
антибактериальной терапии.

4. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Установить частоту выявления серотипов
Chl.trachomatis при моно- и микст-
инфекциях урогенитального тракта;
2. Оценить наличие мутаций в структуре
гена различных серотипов
omp1
Chl.trachomatis.

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Группа обследуемых - 60 женщин с воспалительными
заболеваниями урогенитального тракта (средний возраст
обследуемых 32±4 года):
1 подгруппа - 30 пациенток, у которых была диагностирована моно-
инфекция Chl.trachomatis (ПЦР, КК, РИФ);
2 подгруппа - 30 пациенток, у которых была диагностирована микст-
инфекция в сочетании с
(Chl.trachomatis Trichomonas
vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma
genitalium) (ПЦР, КК, РИФ).
Материал для исследования – соскобы эпителиальных
клеток из цервикального канала и уретры.
Методы исследования образцов ДНК:
Постановка реакции амплификации;
1.
Очистка ПЦР-амплификонов с использованием Сentricon-100
2.
колонок (США);
Проведение секвенирующей ПЦР;
3.
Детекция результатов с использованием генетического
4.

6. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ ПОДБОРА ПРАЙМЕРОВ
 P1/OMP2 – позволяющие детектировать фрагмент
длиной 1130 п.н. omp1 гена Chl.trachomatis, содержащий
все 4 вариабельных домена (VDI-VDIV);
 P1/CT6R – позволяющие детектировать фрагмент длиной
675 п.н. omp1 гена Chl.trachomatis, содержащий 2
вариабельных домена (VDI,VDII);
 CT6F/OMP2 – позволяющие детектировать фрагмент
длиной 481 п.н. omp1 гена Chl.trachomatis, содержащий 2
вариабельных домена (VDIII,VDIV);
 NL-F/NL-R – позволяющие детектировать фрагмент
длиной 481 п.н. omp1 гена Chl.trachomatis, содержащий 2
вариабельных домена (VDII,VDIII).

7. МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ПРОВЕДЕНИЯ ЭТАПА АМПЛИФИКАЦИИ
Из положительных в отношении
60
Chl.trachomatis образцов все 60 проб были
успешно амплифицированы с применением 4
видов подобранных праймеров.
Программа амплификации :
 94С – 10 мин (инициация реакции);
 94С – 30 сек (денатурация);
 50С – 30 сек (отжиг); 40 циклов
 72С – 2 мин (элонгация);
 72С – 7 мин (дополнительное время элонгации в
конце реакции).

8. ДЕТЕКЦИЯ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
М К- P1/OMP2 P1/CT6R CT6F/OMP2 NL-F/NL-R P1/OMP2 P1/CT6R CT6F/OMP2 NL-F/NL-R
1200
800
600
500
280
200
п.н.
Для каждого из 60 образцов было характерно наличие на
электрофореграмме 4 специфических фрагментов
(P1/OMP2, P1/CT6R, CT6F/OMP2 и NL-F/NL-R).

9. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЦР АНАЛИЗА
ДЛИНА ФРАГМЕНТА (ПАРЫ НУКЛЕОТИДОВ,
ПАРЫ ПРАЙМЕРОВ п.н.)
OMP1 ГЕНА CHL.TRACHOMATIS
1130 п.н. (n=60)
P1/OMP2
675 п.н. (n=60)
P1/CT6R
481 п.н. (n=60)
CT6F/OMP2
481 п.н. (n=60)
NL-F/NL-R

10. 25 мкл амплификата + 500 мкл
500 мкл 6М 75 мкл 6М NaClO4 + промывочного
NaClO4 25 мкл изопропанола буфера
30 с при мах оборотах 30 с при мах оборотах удаление
удаление
элюата
элюата
500 мкл
ЕВ-буфера
2 мин
комн t
2 мин при мах оборотах
30 с при мах оборотах 30 с при мах оборотах
удаление
элюата
ПЦР-
амплификоны
V~20 мкл

11. ОПТИМИЗАЦИЯ СЕКВЕНИРУЮЩЕЙ ПЦР
1. ПЦР-амплификоны подвергались секвенированию с
использованием BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kit и следующего режима амплификации:
 96С – 20 сек – 30 циклов (денатурация);
 50С – 20 сек (отжиг); 40 циклов
 60С – 4 мин (элонгация);
 4С (инкубация).
2. Очистка продуктов секвенирования
проводилось с использованием
BigDye X-Terminator Purification kit.
Проведение электрофореза
3.
осуществлялось на
генетическом анализаторе
ABI Prism 310.

12. ОПТИМИЗАЦИИ СЕКВЕНИРУЮЩЕЙ ПЦР
Амплификоны секвенировались в двух
направлениях для повышения достоверности
реакции.
Общая реакционная смесь включала:
 8,0 мкл BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Kit (Applied Biosystems, USA),
 3 мкл образца ДНК,
 1 мкл соответствующего праймера (3,2 пмоль),
 8,0 мкл деионизированной воды.
 Конечный объем смеси составил 20 мкл.
В качестве контроля проведения секвенирующей ПЦР
осуществлялся сиквенс-анализ pGEM®
двухцепочечной ДНК матрицы (Applied Biosystems,
USA).

14. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ СЕКВЕНИРУЮЩЕЙ ПЦР
Данные о нуклеотидной
последовательности образцов
рассматривались с использованием
нуклеотид-нуклеотид BLAST поисковой
системы
(www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.
для идентификации
html)
принадлежности той или иной
последовательности к определенному
серотипу.

15. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ СЕКВЕНИРУЮЩЕЙ ПЦР
Нуклеотидные последовательности omp1 генов
cтандартных образцов всех 15 серотипов (А-L3), были
получены из GeneBank базы данных:
A/Har-13 (J03813), A/Sa1/OT(M58938),B/Alpha-
95(U80075),B-Jali-20(M33636), B/TW-5/OT
(M17342), BaApache-2 (AF063194), C/TW3
(AF202455), C/TW3/OT (M17343), C/TW-3/OT
(AF352789), D/B120 (X62918), D/B185 (X62919), D/IC-
Cal8 (X62920), E/Bour-1990 (X52557), E/Bour-1997
(U78763), F/IC-Cal (X52080), G/UW57/Cx
(AF063199), H/Wash (X16007), I/UW-12
(AF063200), J/UW36/Cx (AF063202), K/UW31/Cx
(AF063204), L1/440-Bu (M36533), L2/434-Bu
(M14738), L3/404-Bu (X55700), MoPn (M64171).
Для анализа данных по секвенированию ДНК
использовался программный модуль Sequencing

16. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СИКВЕНС-АНАЛИЗА
РЕГИОНА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО VDI-VDIV
Среди серотипов Сhl.trachomatis были выявлены
следующие:
серотип K геновариант K/UW31/Cx (AF063204)

(95% соответствие) в 29 случаях (48,3%±12,5%);
серотип D геновариант D/B185 (X62919)

(95% соответствие) в 19 случаях (31,7%±10,8%);
серотип D геновариант D/B185 (X62919)

(94% соответствие) в 20 случаях (33,3%±11,0%);
серотип D геновариант D/B120 (X62918)

(95% соответствие) в 18 случаях (30,0%±10,6%);
серотип С геновариант C/TW-3/OT (AF352789)

(95% соответствие) в 22 случаях (36,7%±11,4%).

17. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

18. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Вид Кол-во Серотипный статус Chl.trachomatis
инфицирования обследованных
9 (30,0%±14,5%) моно-серотип K
13 (43,3%±17,6%) моно-серотип D
2 (6,7%±2,4%) серотип D/B185 + D/B120
Моно-инфекция
2 (6,7%±2,4%) моно-серотип C
n=30
Chl.trachomatis
1 (3,3%±1,5%) микст-серотип K+D
1 (3,3%±1,5%) микст-серотип D+C
2 (6,7%±2,4%) микст-серотип K+C
5 (16,7%±6,3%) серотип D/B185 + D/B120
Микст-инфекция 8 (26,7%±8,4%) микст-серотип K+D
8 (26,7%±8,4%) микст-серотип D+C
Chl.trachomatis n=30
7 (23,3%±7,3%) микст-серотип K+C
2 (6,7%±2,4%) микст-серотип K+D+C

19. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

20. ЗАВИСИМОСТЬ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН
ОТ СЕРОТИПА CHL.TRACHOMATIS
Серовар Нуклеотид
Моно- или микст- Omp1
тип Изменение
% N
серотип позиция
1 при моно-серотипе G→A 972 (VDIV)
C 36,7 7
6 при микст-серотипе G→T 1003 (VDIV)
3 при моно-серотипе
T→G
17 843(VDIII)
14 при микст-серотипе
D 66,7
0 при моно-серотипе T→G 843(VDIII)
5
5 при микст-серотипе A→G 1042(VDIV)
2 при моно-серотипе
С→T
K 48,3 10 503(VDII)
8 при микст-серотипе

21. ВЫВОДЫ
Установлено преимущественное
1.
распространение сероваров D (66,7%), К
(48,3%) и С (36,7%) Chl.trachomatis в
биологическом материале пациентов с
воспалительными заболеваниями
урогенитального тракта. При этом в 94-95%
отмечается гомология генотипа выявленного
возбудителя со стандартными штаммами
D/B120 (X62918), D/B185
(X62919), K/UW31/Cx
(AF063204), полученными из GeneBank базы
данных.

22. ВЫВОДЫ
2. Серотипы Сhl.trachomatis находятся в моно-
и микст-состоянии у пациентов с различными
формами хламидийной инфекции, при этом
при моно- хламидийной инфекции
преобладает моно-серотипный статус
(86,7%), тогда как для микст-хламидийной
инфекции более распространен микст-
серотипный статус (83,3% случаев).

23. ВЫВОДЫ
3. Мутации вариабельных доменов omp1 гена
Сhl.trachomatis формируются преимущественно
при микст-серотипном статусе на фоне микст-
хламидийной инфекции, что сопровождается
увеличением вариабельности генома
возбудителя и подтверждает возможность
формирования серотипов Сhl.trachomatis с
новыми биологическими свойствами в одном
биотопе при ассоциациях с различными
видами инфекционных агентов.

24. БЛАГОДАРЮ
ЗА
ВНИМАНИЕ !!!