Đề tài độc lực chủng và LD50 của chủng E. ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG
------------------------------
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CÁC CHỦNG
Edwardsiella ictaluri HOANG DẠI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NGÂM TRÊN CÁ TRA
SINH VIÊN THỰC HIỆN
LÊ HỒNG NGUYÊN
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
ThS. BÙI THỊ THANH TỊNH
ThS. TRẦN QUỐC HUY
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2016

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG
------------------------------
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CÁC CHỦNG
Edwardsiella ictaluri HOANG DẠI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NGÂM TRÊN CÁ TRA
Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
ThS. Bùi Thị Thanh Tịnh LÊ HỒNG NGUYÊN
ThS. Trần Quốc Huy Mã số SV: 2008120017
Lớp: 03DHSH1
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2016

Báo cáo thực tập tốt nghiệp
Trang i
LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian thực tập tại phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản của Trung tâm Công nghệ
Sinh học TP. Hồ Chí Minh, tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và lãnh đạo
phòng Công Nghệ Sinh học Thủy sản đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho em tham gia thực tập và
hoàn thành bài báo cáo này.
Chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Thanh Tịnh và các anh chị trong Trung tâm Công nghệ
Sinh học đã hết lòng tận tình giúp đỡ, hướng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo
điều kiện cho em trong suốt quá trình thực tập.
Em xin cảm ơn nhà trường, thầy Trần Quốc Huy và các thầy cô trong khoa Công nghệ
Sinh học và Kỹ thuật Môi trường đã tạo điều kiện, dạy dỗ em tạo cho em một nền kiến thức
tốt để em có cơ hội áp dụng thực tiễn và hoàn thành khóa thực tập này.
Trong quá trình thực tập, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh khỏi sai
sót, rất mong các thầy, cô bỏ qua. Đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực
tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận
được ý kiến đóng góp thầy, cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và sẽ hoàn thành tốt
hơn bài báo cáo tốt nghiệp sắp tới.
Tp. HCM, tháng 04 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Hồng Nguyên

Trang ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan rằng bài báo cáo này là do chính tôi thực hiện. Các số liệu thu thập và kết
quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa
học nào.
Tp.HCM, tháng 04 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Hồng Nguyên

Trang iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................................................ii
MỤC LỤC...........................................................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG...........................................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ.............................................................................................................vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT............................................................................................................viii
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................................................1
PHẦN 1: TỔNG QUAN......................................................................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NƠI THỰC TẬP........................................................................................3
1.1.1. Lịch sử phát triển..................................................................................................................3
1.1.2. Cơ cấu tổ chức ......................................................................................................................3
1.1.3. Chức năng – nhiệm vụ..........................................................................................................4
1.1.4. Chiến lược phát triển [19].....................................................................................................4
1.2. GIỚI THIỆU VỀ VẤN ĐỀ THỰC TẬP................................................................................6
1.2.1. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ...........................................6
1.2.1.1. Tổng quan về Edwardsiella ictaluri.........................................................................................................................6
1.2.1.2. Con đường xâm nhiễmcủa E. Ictaluri.....................................................................................................................7
1.2.2. Giới thiệu về bệnh gan thận mủ ............................................................................................7
1.2.2.1. Bệnh gan thân mủ ........................................................................................................................................................7
1.2.2.2. Triệu chứng của bệnh trên cá.....................................................................................................................................7
1.2.2.3. Bệnh tích của bệnh ......................................................................................................................................................8
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về vaccine cho cá tra ..........................................8
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước..............................................................................................................................8
1.2.3.2. Tình hình nghiên cứu nước ngoài.............................................................................................................................9
PHẦN 2: NỘI DUNG THỰC TẬP...................................................................................................11
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU......................................................................11

Trang iv
2.2. VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU........................................................................11
2.2.1. Nguyên liệu......................................................................................................................... 11
2.2.2. Hóa chất.............................................................................................................................. 12
2.2.2.1. Môi trường .................................................................................................................................................................12
2.2.2.2. Hóa chất dùng cho điện di DNA ............................................................................................................................12
2.2.2.3. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR.........................................................................................................................12
2.2.3. Dụng cụ - Thiết bị............................................................................................................... 12
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................................13
2.3.1. Thí nghiệm 1: Thử nghiệm độc lực sơ bộ các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri hoang dại
bằng phương pháp ngâm trên cá tra............................................................................................... 13
2.3.1.1. Chuẩn bị cá ................................................................................................................................................................13
2.3.1.2. Chuẩn bị các chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại............................................................................................14
2.3.1.3. Bố trí thí nghiệm.......................................................................................................................................................14
2.3.1.4. Kiểm tra vi khuẩn E. ictaluri trong mẫu cá chết .................................................................................................15
2.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định LD50 của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp
ngâm cá tra..................................................................................................................................... 17
2.3.2.1. Chuẩn bị cá ................................................................................................................................................................17
2.3.2.2. Chuẩn bị các chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại............................................................................................18
2.3.2.3. Bố trí thí nghiệm.......................................................................................................................................................18
2.3.2.4. Kiểm tra vi khuẩn E. ictaluri trong mẫu cá chết .................................................................................................19
2.3.2.5. Xác định LD50 (Reed và Muench, 1938) của vi khuẩn gây bệnh thực nghiệmtrên cá.................................19
2.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................................................20
2.4.1. THÍ NGHIỆM 1: THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰCSƠ BỘ CÁC CHỦNG VI KHUẨNEdwardsiella
ictaluri HOANG DẠIBẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM TRÊN CÁ TRA........................................ 20
2.4.2. THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NGÂM CÁ TRA................................................................................................. 25
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................29
4.1. NHẬN XÉT VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP.................................................................................29
4.2. BÀI HỌC KINH NGHIỆM ..................................................................................................29
3.3. KIẾN NGHỊ...........................................................................................................................29
PHẦN 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................30
PHỤ LỤC..........................................................................................................................................32

Trang v

Trang vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách tên các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và nguồn phân lập....... 11
Bảng 2.2.Thành phần của phản ứng PCR.................................................................................... 12
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................................... 14
Bảng 2.4. Thành phần Mix PCR................................................................................................... 16
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................................... 18
Bảng 2.6. Kết quả OD600 dịch vi khuẩn....................................................................................... 20
Bảng 2.7. Kết quả pha loãng trải đĩa các chủng vi khuẩn ......................................................... 21
Bảng 2.8. Tổng số cá chế và tỷ lệ cá chết trong thử nghiệm độc lực sơ bộ các chủng
Edwardsiella ictaluri hoang dại nồng độ 106 bằng phương pháp ngâm.................................. 22
Bảng 2.9.Kết quả OD600 dịch vi khuẩn ........................................................................................ 25
Bảng 2.10. Kết quả pha loãng trải đĩa các chủng vi khuẩn ....................................................... 25
Bảng 2.11. Tỷ lệ cá chết trong thử nghiệm đánh giá độc lực chủng hoang dại E.ictaluri 5H
bằng phương pháp ngâm................................................................................................................ 26

Trang vii
DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Dự án xây dựng Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM. (Nguồn: TT CHSH
TP.HCM) ............................................................................................................................................3
Hình 1.2. Sơ đồ cơ cấu tổ chức Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM (Nguồn: TT CHSH
TP.HCM) ............................................................................................................................................4
Hình 1.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ......................................................................................6
Hình 1.4. Cá tra bị bệnh gan thận mủ – chứa đốm trắng ở nội tạng............................................8
Sơ đồ 2.1. Quy trình thử nghiệm độc lực trên cá tra……………………………………….. 13
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ quy trình xác định vi khuẩn E.ictaluri trong mẫu cá chết ........................... 15
Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm độc lực trên cá tra .................................................................. 17
Sơ đồ 2.4. Sơ đồ quy trình xác định vi khuẩn E.ictaluri trong mẫu cá chết ........................... 19
Hình 2.1. Thang DNA 1kb…………………………………………………………………. 12
Hình 2.2. Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri 5H cấy trải trên môi trường BHI............................ 22
Hình 2.3. Biểu đồ so sánh tỉ lệ cá chết ở các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở các nồng độ 106
trong phương pháp ngâm ............................................................................................................... 23
Hình 2.4. Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri 5H phân lập trên mẩu cá chết ................................. 24
Hình 2.5. Kết quả điện di khuẩn lạc trên gel agarose 1,2% ...................................................... 24
Hình 2.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ cá chết ở các nồng độ vi khuẩn E.ictaluri 5H ở các nồng độ
khác nhau trong phương pháp ngâm ............................................................................................ 26
Hình 2.7. Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri 5H106 phân lập trên mẩu cá chết ........................... 27
Hình 2.8. Kết quả điện di khuẩn lạc trên gel agarose 1,2% ...................................................... 27

Trang viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
E.ictaluri: Edwardsiella ictaluri.
BHI: Brain Heart Infusion.
LB: Luria Bertami.
Col: colistin.
CNSH: Công nghệ Sinh học.
DNA: Deoxyribonucleic acid.
dNTP: Deoxynucleotide triphosphate.
OD: Optical density.
PCR: Polymerase chain reaction.
RNA: Ribonucleic acid.

Trang 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở Việt Nam, đặc biệt là vùng nuôi cá tra ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, nghề
nuôi trồng và xuất khẩu cá tra đang mang lại những lợi ích kinh tế lớn và có xu
hướng không ngừng phát triển. Theo Tổng cục Thủy sản, xuất khẩu thủy sản của cả
nước đạt 5,912 tỷ USD, trong đó, xuất khẩu cá tra đạt 1,522 tỷ USD, chiếm 25,70%.
[20].
Trong vài năm trở lại đây, mô hình nuôi cá tra xuất khẩu ở đồng bằng sông Cửu
Long nhân rộng rất nhanh, đem về một nguồn ngoại tệ rất lớn cho quốc gia. Thế
nhưng, do việc tăng trưởng một cách nhanh chóng của các vùng nuôi nhưng không
theo quy hoạch và về Thực hành nông nghiệp tốt (GAP), nuôi mật độ cao để gia
tăng sản lượng dẫn đến môi trường nước bị ô nhiễm, dịch bệnh xảy ra. Trong đó tỉ
lệ xuất hiện bệnh gan thận mủ trên cá tra chiếm khoảng (61%), không cao hơn
nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (68,3%), bệnh phù đầu (51,2%)
nhưng tỷ lệ chết là cao nhất (60 - 80%) làm giảm năng suất đáng kể trong các hệ
thống nuôi [16].
Cho đến nay, kháng sinh vẫn là biện pháp được áp dụng nhiều nhất ở Việt Nam
để điều trị bệnh do vi khuẩn.
Tuy nhiên, bên cạnh những thuận lợi về điều trị và phòng chống dịch bệnh của
kháng sinh thì điều trị bằng kháng sinh cũng gặp những hạn chế như là sự kháng
thuốc và dư lượng hóa chất cao.
Nhiều giải pháp để quản lý dịch bệnh đã và đang được áp dụng như cải tạo ao kỹ,
chọn giống tốt sạch bệnh, quản lý tốt môi trường, quan tâm đến dinh dưỡng, thuốc
và hóa chất nhưng hiệu quả vẫn chưa cao. Nên việc sản xuất và sử dụng vaccine để
quản lý dịch bệnh có ý nghĩa rất lớn, là một bước tiến vượt bậc trong việc nâng cao
thương hiệu cá tra Việt Nam trên thị trường thế giới.
Bước đầu tiên, trong việc sản xuất vaccine nhược độc là nghiên cứu thử nghiệm
tìm ra chủng vi khuẩn hoang dại có động lực cao, để tiến hành gây đột biến và tạo
ra các loại vaccine nhược độc phù hợp cho các cơ thể vật chủ khác nhau. Đây là
bước tiền đề, quyết định cho sự thành công của việc sản xuất vaccine.
Từ những nhận định trên, tôi đã thực hiện đề tài “Thử nghiệm độc lực các chủng
Edwardsiella ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm trên cá tra”.
Mục tiêu đề tài:
Mục tiêu tổng quát:
Đánh giá độc lực các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri hoang dại trên cá tra
bằng phương pháp ngâm nhằm làm nguồn để tạo vaccine sống nhược độc phòng
bệnh gan thận mủ cho cá tra.
Mục tiêu cụ thể:
Chọn ra một dòng vi khuẩn có độc lực cao, gây chết cá nhanh dùng để làm nguồn
tạo vaccine sống nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra.

Trang 2
Nội dung đề tài:
- Thử nghiệm độc lực sơ bộ các chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại bằng
phương pháp ngâm trên cá tra.
- Xác định LD50 của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp
ngâm cá tra.

Trang 3
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NƠI THỰC TẬP
1.1.1. Lịch sử phát triển
Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh.
Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP.HCM, Việt
Nam.
Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh (HCMBIOTECH) được
thành lập theo Quyết định số 161/2004/QĐ-UB ngày 02 tháng 07 năm 2004 của Ủy
ban Nhân dân TP. Hồ Chí Minh.
Trung tâm chính thức đi vào hoạt động tháng 01/2005.
Cơ quan chủ quản: Sở Nông nghiệp và PTNT Thành phố Hồ Chí Minh.
Trụ sở Trung tâm được xây dựng trên diện tích 23 ha tại phường Trung Mỹ Tây,
Quốc lộ 1A, quận 12, cách trung tâm TP. Hồ Chí Minh 12 km.[19]
Hình 1.1. Dự án xây dựng Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.
(Nguồn: TT CHSH TP.HCM)
1.1.2. Cơ cấu tổ chức
Cơ cấu tổ chức của trung tâm gồm ban giám đốc điều hành và quản lý ba khối
chính là: khối văn phòng, khối nghiên cứu và khối sản xuất thử nghiệm.
Khối nghiên cứu bao gồm nhiều phòng ban. Mỗi phòng nghiên cứu về một lĩnh
vực nhất định về sinh học.
Phòng công nghệ sinh học thủy sản nghiên cứu ứng dụng về các vấn đề về thủy
sản như: nghiên cứu vaccine phòng bệnh trên cá tra, nghiên cứu tạo cá phát sáng
phục vụ cho chương trình phát triển cá cảnh, nghiên cứu tạo các chủng probiotic
cho cá,…[19]

Trang 4
1.1.3. Chức năng – nhiệm vụ
Xây dựng Trung tâm Công nghệ Sinh học trở thành một trung tâm nghiên cứu và
ứng dụng CNSH hiện đại có tầm cỡ khu vực:
- Nghiên cứu, ứng dụng, chuyển giao CNSH phục vụ trong lĩnh vực nông nghiệp,
xử lý môi trường, công nghiệp thực phẩm và y dược học.
- Tiếp nhận, triển khai các quy trình, kỹ thuật hiện đại về CNSH (công nghệ gene,
công nghệ tế bào động thực vật, công nghệ vi sinh, công nghệ lên men...) phục vụ
sản xuất, bảo quản, chế biến các sản phẩm nông nghiệp và xử lý môi trường.
- Đào tạo huấn luyện các kỹ thuật viên về CNSH.
- Sản xuất, thương mại hóa các sản phẩm CNSH.
1.1.4. Chiến lược phát triển[19]
- Nghiên cứu ứng dụng: Các hoạt động nghiên cứu ứng dụng trong nước gồm hợp
tác với các trường, viện trong nước để hoàn thiện các đề tài có tiềm năng ứng dụng
lớn đã có kết quả tốt ở mức độ phòng thí nghiệm; tiến tới thử nghiệm ở quy mô sản
xuất thử các kết quả nghiên cứu về y tế, nông nghiệp và môi trường. Hợp tác với
các nước trên thế giới gồm hợp tác với các nước có ưu thế về CNSH, nhất là trong
lĩnh vực y học để hoàn thiện các đề tài ở mức độ thử nghiệm cuối cùng hay tiền lâm
sàng.
- Đào tạo và hợp tác quốc tế: Nhiệm vụ đào tạo một lực lượng đội ngũ có chuyên
môn cao về CNSH được đặt lên hàng đầu. Trung tâm phải là nơi tập trung các
chuyên gia, cán bộ khoa học giỏi trong lĩnh vực CNSH ứng dụng. Việc đào tạo đội
ngũ sẽ được gắn liền với nghiên cứu ứng dụng, với sản xuất tại chỗ, phục vụ cho
từng công đoạn sản xuất. Mục tiêu đề ra sau năm 2010 trở đi, khi Trung tâm đã định
Hình 1.2. Sơ đồ cơ cấu tổ chức Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM
(Nguồn: TT CHSH TP.HCM)

Trang 5
hình và đi vào hoạt động hiệu quả, hàng năm có thể tiếp nhận sinh viên, học viên
cao học và nghiên cứu sinh đến nghiên cứu.
- Sản xuất: Đối với các sản phẩm dược sinh học, Trung tâm sẽ đầu tư xây dựng
nhà máy sản xuất và đóng gói theo tiêu chuẩn GMP, từ công nghệ do Trung tâm
nghiên cứu hoặc nhận chuyển giao từ nước ngoài hay các cơ quan nghiên cứu khác
trong nước. Nhà máy sẽ xây dựng trên tiêu chuẩn GMP với độ an toàn cấp 2. Dây
chuyền hoàn chỉnh để sản xuất từ khâu giữ giống, nhân giống, lên men, chuẩn bị
môi trường, thu hoạch, chiết tách, tinh chế các sản phẩm protein có hoạt tính. Ngoài
ra, sẽ xây dựng các xưởng sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ cho sản xuất
nông nghiệp. Về cây trồng, sẽ có một bộ phận trồng thử nghiệm cây chuyển gene,
sản xuất cây giống sạch bệnh ở quy mô lớn.
- Kinh doanh: Mô hình phát triển Trung tâm dự kiến sẽ phát triển theo mô hình
một công ty đa quốc gia về CNSH. Do vậy, bộ phận kinh doanh của Trung tâm sẽ là
bộ phận mạnh, gồm các chuyên viên về CNSH, kinh tế, quản trị kinh doanh nhằm
đưa nhanh sản phẩm ra thị trường trong nước và xuất khẩu. Lợi nhuận thu được từ
việc kinh doanh sẽ phục vụ cho việc mở rộng nghiên cứu, chuyển giao công nghệ
và sản xuất.
Cụ thể trên các lĩnh vực
 Công nghệ Sinh học phục vụ nông nghiệp
Công nghệ Sinh học thực vật:
Chọn tạo giống cây trồng biến đổi di truyền có các đặc tính và phẩm chất tốt
phục vụ sản xuất nông nghiệp. Nghiên cứu sinh lý bệnh thực vật, phát triển kit chẩn
đoán bệnh ở cây trồng. Nghiên cứu nuôi cấy mô cây dược liệu thu nhận các hoạt
chất thứ cấp.
Công nghệ Sinh học thủy sản:
Phát triển vaccine phòng ngừa các bệnh nghiêm trọng ở thủy sản. Phát triển các
bộ kit phát hiện bệnh, các chế phẩm sinh học- probiotic phục vụ nuôi trồng thủy
sản. Cải thiện chất lượng con giống thủy sản bằng công nghệ gene.
 Công nghệ sinh học tế bào động vật:
Phát triển và ứng dụng công nghệ hỗ trợ sinh sản kết hợp kỹ thuật di truyền để tạo
động vật chuyển gene phục vụ nghiên cứu hay tạo giống vật nuôi mới.
 Công nghệ Sinh học phục vụ môi trường và năng lượng sinh học
Phát triển các chế phẩm sinh học phòng trừ dịch bệnh, kích thích tăng trưởng cho
cây trồng. Tuyển chọn, cải biến các chủng vi sinh vật bằng công nghệ gene để xử lý
chất thải gây ô nhiễm môi trường. Nghiên cứu quy trình sản xuất cồn sinh học và
các dạng nhiên liệu sinh học khác từ nguồn phế phụ liệu nông nghiệp.
 Công nghệ sinh học phục vụ y dược
Nghiên cứu, thử nghiệm và sản xuất các hoạt chất tự nhiên hay các protein tái tổ
hợp có dược tính ứng dụng trong điều trị bệnh. Nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, các
phương pháp chẩn đoán và điều trị nhiều bệnh khác nhau ở người và vật nuôi. Phát

Trang 6
triển vaccine cho người và vật nuôi phòng ngừa các bệnh phổ biến. Nghiên cứu và
ứng dụng tế bào gốc trong y học tái tạo.
1.2. GIỚI THIỆU VỀ VẤN ĐỀ THỰC TẬP
1.2.1. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ
1.2.1.1. Tổng quan về Edwardsiella ictaluri
Giới (domain) : Bacteria
Ngành (phylum) : Proteobacteria
Lớp (class) : Gamma Proteobacteria
Bộ(ordo) : Enterobacteriales
Họ (familia) : Enterobacteruaceae
Chi (genus) : Edwardsiella
Loài : Edwardsiella ictaluri
Chúng có đặc điểm gram âm, hình que, phần lớn ở dạng đơn, đôi và một ít ở
dạng chuỗi, kích thước 1x 2-3µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ tiêm mao.
Kị khí tùy tiện, catalase dương tính, cytocrom oxidase âm.
E. ictaluri được phân lập từ cá nhiễm lâm sàn trên môi trường thạch BHI hoặc
TSA. Chúng phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần 36-48 h để hình thành
những khuẩn lạc nhỏ li ti trên thạch BHI ở 280C đến 300C, phát triển yếu hoặc
không phát triển ở 370C. Trên môi trường EIM giúp tăng cường sự phân lập và định
danh E. ictaluri, môi trường này ức chế vi khuẩn gram dương và hầu hết gram âm.
Sau 48 giờ, trên môi trường EIM, khuẩn lạc E. ictaluri và E. tarda có đường kính
0,5-1,0 mm, màu xanh mờ.[13]
Vi khuẩn E. ictaluri được tìm thấy ở các loài cá da trơn như cá trê sông
(Ictalurus spp), cá tra (pangasius spp), gây bệnh xuất huyết đường ruột ở cá da trơn.
Ở Việt Nam, E. ictaluri phân lập từ cá tra giống và cá tra thịt.
Hình 1.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Trang 7
1.2.1.2. Con đường xâm nhiễm của E. Ictaluri
Bằng nguồn nước vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác, thông qua
mũi cá chúng di chuyển vào bên trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não.
Sự truyền nhiễm lan rộng từ màng não đến sọ và da cá, vì thế đã tạo nên những lỗ
thủng trên đầu cá (thường gọi là bệnh “hole-in-the-head”).
E. ictaluri có thể theo đường tiêu hóa và đi vào trong máu xuyên qua ruột dẫn
đến bệnh nhiễm trùng máu. Bằng con đường này vi khuẩn xâm chiếm mạnh đến
những mạch mao quản bên trong da, đây là nguyên nhân dẫn đến hoại tử và làm mất
sắc tố của da cá.[12]
Theo thống kê hiện nay, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri kháng với các kháng sinh
như sau: Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Florphenicol (42,5%), Amoxicilin
(40,4%), Tetracyclin (31,9%), Doxycyclin (27,7%).
1.2.2. Giới thiệuvề bệnh gan thận mủ
1.2.2.1. Bệnh gan thân mủ
Bệnh gan thận mủ (hay còn gọi là bệnh đốm trắng trên gan, thận) trên cá tra do vi
khuẩn E. ictaluri và được ghi nhận lần đầu tiên ở đồng bằng sông Cửu Long vào
cuối năm 1998. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10 – 90% tùy thuộc vào
cách quản lý và cỡ cá nuôi, đồng thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm
trắng đường kình từ 1 – 3 mm bên trong có chứa dịch màu trắng đục.[4]
Cá Tra thường bị nhiễm bệnh vào các tháng cuối năm khi nhiệt độ nước hạ thấp
(khoảng tháng 9 đến tháng 1 năm sau). Tuy nhiên ngày nay bệnh này còn xảy ra ở
những thời điểm khác trong năm do việc tăng diện tích và tăng mức độ thâm canh,
cũng như việc không sát trùng nguồn nước của những ao nuôi bị nhiễm bệnh trước
khi thải ra môi trường.
E.ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng 2 đường khác nhau:
Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu
giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não. Từ đó, bệnh lan
rộng từ màng não đến sọ và da.
Cá da trơn còn lây nhiễm qua đường tiêu hóa, thức ăn qua đường miệng gây
nhiễm khuẩn ruột hoặc qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu. Bằng
đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây họai tử và mất sắc tố của
da.
Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau
khi nhiễm khuẩn. Tóm lại vi khuẩn E. ictaluri có thể xâm nhập vào cơ thể cá từ môi
trường nước qua da, qua mang cá và qua miệng bằng đường thức ăn gây bệnh mủ
gan cá.
1.2.2.2. Triệu chứng của bệnh trên cá
Tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh của cá mà chúng có những biểu hiện khác
nhau.

Trang 8
Mức độ nhẹ: Bên ngoài thân cá bình thường không biểu hiện xuất huyết, mắt hơi
lồi nhưng khi tiến hành giải phẫu, gan thận và tỳ tạng có nhiều đốm trắng (như đốm
mủ) biểu hiện bệnh lý đặc trưng nhất của bệnh mủ gan.
Chú thích: Th: là thận; G: gan; Tt : tỳ tạng.
Mức độ nặng: Cá bệnh bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, cá thường nhào lộn và
xoay tròn. Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động. Một số cá xuất huyết
tất cả các vi hoặc xuất huyết toàn thân. Có khi cá xuất huyết trầm trọng, khi nhấc
lên khỏi mặt nước máu sẽ chảy ra từ da và mang cá.
Một số cá bệnh còn biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều bệch lớn, nhỏ trên da. Số
lượng cá chết hằng ngày khá cao với tỷ lệ tăng dần.[1], [17]
1.2.2.3. Bệnh tíchcủa bệnh
Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, tỳ tạng sưng ít hơn. Trên
gan, thận, tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng tròn, đường kính khoảng 1- 3 mm khắp
bề mặt và cả bên trong cơ quan. Những đốm trắng này có chứa dịch hơi đặc. Khi
cấy những đốm trắng này lên môi trường thạch sau 24 giờ thấy xuất hiện các khuẩn
lạc thuần nhất.
Các đốm trắng của bệnh mủ gan nổi rõ lên nội tạng hoàn toàn khác với các đốm
trắng do ký sinh trùng gây nên. Đốm trắng gây ra bởi ký sinh trùng xuất hiện chủ
yếu trên tỳ tạng không rõ đồng thời khi quan sát dưới kính hiển vi, bên trong chứa
dịch màu trắng sữa.
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về vaccine cho cá tra
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu và sản xuất vaccine ứng dụng trong nuôi
trồng thủy sản vẫn đang ở giai đoạn bước đầu. Trong những năm gần đây, đã có một
số công trình nghiên cứu và phát triển vaccine tại Việt Nam tuy nhiên vẫn chưa thu
nhận được sản phẩm phù hợp với yêu cầu.
G
Tt
Th
Hình 1.4. Cá tra bị bệnh gan thận mủ – chứa đốm trắng ở nội tạng

Trang 9
Năm 2007, giáo sư Peter Coloe – trưởng khoa ngành Ứng dụng, đại học RMIT
và cô Phan Ngọc Thủy tiến hành nghiên cứu sản xuất vaccine có thể cấy vào cá
nhằm làm tăng khả năng miễn dịch nhưng không gây bệnh cho chúng.
Năm 2006, viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II kết hợp với công ty thuốc thú
ý trung ương (navetco) thực hiện đề tài “nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm
khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công nghiệp”. Sau ba năm
thực hiện việc nghiên cứu sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá tra đã thu nhận được
một số kết quả khả quan và có triển vọng áp dụng vào thực tế. Nghiên cứu xác định
được nồng độ kháng nguyên (vi khuẩn giết chết bằng formalin 0,4%) thích hợp với
sử dụng chất bổ trợ Aluminum bằng phương pháp tiêm lần đầu vào ngày thứ nhất
và lần thứ hai vào ngày thứ 14.
Tác giả Nguyễn Hữu Thịnh và các cộng sự (2009) đã tiến hành thử nghiệm
vaccine kết hợp các phương pháp sử dụng vaccine trên đối tượng cá tra điều trị bệnh
do vi khuẩn E. ictaluri gây ra. Kết quả cho thấy việc ngâm cá với vi khuẩn bất hoạt
đồng thời sử dụng thức ăn có bổ sung vaccine sau đó giúp hình thành kháng
nguyên, có hiệu quả trong việc kiểm soát tỷ lệ cá chết sau 4 tuần.[15]
Ngày 12/10/2011, Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) đã cho
phép công ty PHARMAQ tiêm thử nghiệm vaccine ALPHA JECT Panga® 1 cho cá
tra trên diện rộng tại một số ao nuôi trong khu vực đồng bằng sông Cửu Long.
Vaccine dạng nhũ dầu dùng để tiêm, có chứa vi khuẩn Edwardsiella bất hoạt, chất
nhũ hóa ALPHA JECT Panga1 được sản xuất từ Na Uy theo tiêu chuẩn GMP và
không chứa các chất biến đổi gen giúp chống lại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây
bệnh gan thận mủ trên cá Tra. Những kết quả từ phòng thí nghiệm cho thấy ALPHA
JECT Panga1 không gây sốc hay chết cá sau khi tiêm và không ảnh hưởng đến tốc
độ tăng trưởng của cá tra trong suốt thời gian nuôi. Kết quả ứng dụng thực nghiệm
trên cá tra nuôi thương phẩm tại một số trại nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long cho
thấy, cá tiêm ALPHA JECT Panga1 có kháng thể cao trong suốt chu kỳ nuôi, tỉ lệ
chết rất thấp cho thấy vaccine bảo hộ được cá chống lại vi khuẩn E.ictaluri ngay
trong thời kỳ bùng phát bệnh trong khu vực.[18]
1.2.3.2. Tình hình nghiên cứu nước ngoài
Vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản được bắt đầu nghiên cứu và phát
triển từ năm 1973 nhưng đến cuối năm 1987 mới được đưa vào sử dụng. Đến nay có
khoảng 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh cho virus
được đăng ký bản quyền và sử dụng trên thế giới.[3]
Hiện nay chủng Edwardsiella ictaluri kháng Rif (RE – 33) đã được đăng ký bản
quyền (US patent No. 6019981) và sử dụng là vaccine sống nhược độc ở dạng
thương mại với tên gọi AQUAVAC – ESC™, với hiệu ứng bảo vệ là 64,6%.
Bên cạnh đó nhóm tác giả này cũng sử dụng chủng Edwardsiella ictaluri ATCC
202058 kháng rifampicin được phân lập từ cá có tên gọi walking catfish Clarius
batrachus có nguồn gốc từ Thái Lan ngâm với trứng cá, sau 30 đến 36 ngày ngâm

Trang 10
với chủng E.I độc và cho thấy tỉ lệ sống sót (RPS) của cá là 87,9%, phương pháp
này cũng đã được đăng ký bản quyền (US patent No. 6153202).
Đồng thời khi so sánh giữa chủng E. ictaluri (EILO) hoang dại và chủng kháng
Rif (RE – 33) cho thấy một số điểm khác biệt nhất định về lipopolysarcharides,
outer membrance proteins, acids béo.[7]
Bên cạnh đó qua nghiên cứu “Phân lập chủng Flavobacterium psychrophilum
kháng Rifampicin và hiệu lực của vaccine sống nhược độc” đã chứng minh chủng
Flavobacterium psychrophilum 259-93B.17 kháng Rifampicin có thể đáp ứng như
một vaccine sống nhược độc cho việc ngăn chặn việc nhiễm Flavobacterium
psychrophilum gây bệnh Vi khuẩn nước lạnh (CWD) ở họ cá hồi.[8]
Dựa vào những thành công ban đầu trong việc điều trị bệnh bằng vaccine chết
trên đối tượng cá hồi, nhóm tác giả Plumb và các cộng sự (1995) đã sử dụng chủng
E. ictaluri bất hoạt bằng formalin cấp cho cá tra bằng phương pháp ngâm với số lần
tăng dần (một, hai và ngâm kết hợp cấp ba lần) với tỷ lệ sống của cá tăng dần theo
thứ tự 56,7%, 64,2%, 68,8% so với chủng đối chứng không sử dụng vaccine (tỷ lệ
sống là 43,6%). Hiện nay loại vaccine này được sản xuất và thương mại hóa dưới
giấy phép tạm thời của công ty Biomed (Mỹ) điều trị bệnh nhiễm trùng ruột bằng
phương pháp ngâm cho cá nheo Mỹ.[10]
Năm 1997, Mark L. Lawrence cùng các cộng sự đã nghiên cứu tạo chủng E.
ictaluri nhược độc bị đột biến gen purA, sử dụng làm vaccine theo phương pháp
ngâm một lần cho cá nheo sạch bệnh tại Mỹ với mật độ vi khuẩn nhược độc là 3,65
x 107 CFU/ml cho tỷ lệ cá sống sót là 66,3%.[9]

Trang 11
PHẦN 2: NỘI DUNG THỰC TẬP
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian: 8/2015- 1/2016
Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản. Trung tâm Công nghệ sinh học
thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, Q.12,
TP.HCM, Việt Nam.
2.2. VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ Sinh
học Thành phố Hồ Chí Minh
- Cá tra (giai đoạn sau 1 tháng tuổi).
- Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.
Bảng 2.1. Danh sách tên các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và nguồn
phân lập
Tên chủng vi
khuẩn
Nguồn phân lập
Tên chủng vi
khuẩn
Nguồn phân lập
1H
Thốt Nốt, Cần Thơ,
22/10/2015
1
Cồn Linh, Bến Tre,
05/04/2014
3H
Cồn Tròn, Tiền Giang,
22/10/2015
10
Cái Bè, Tiền Giang,
20/04/2014
5H
22/10/2015
13
Đồng Tháp,
07/02/2014
7H
22/10/2015
19
Vĩnh Long,
21/08/2014
9H
Hồng Ngự, Đồng Tháp,
22/10/2015
20
Vĩnh Long,
21/08/2014
11H
22/10/2015
21
Cồn Sơn, Cần Thơ,
21/08/2014
14H
22/10/2015
23
Cồn Sơn, Cần Thơ,
21/08/2014
17H
22/10/2015
25
Đồng Tháp,
05/09/2014
22H
22/10/2015
26
Đồng Tháp,
05/09/2014
26H
22/10/2015
28
Cần Thơ,
06/08/2014
ĐN1
Tân Vạn, Đồng Nai,
2013

Trang 12
2.2.2. Hóa chất
2.2.2.1. Môi trường
Môi trường LB (Luria Bertami).
Môi trường BHI (Brain Heart Infusion).
2.2.2.2. Hóa chất dùng cho điện di DNA
- Agarose (BioLad)
- Ethidium Bromide (Merck)
- TAE 0,5X
2.2.2.3. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi Fermentas: Taq
DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X. Thành phần phản ứng PCR được
liệt kê trong Bảng
Bảng 2.2.Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích cho 1 phản ứng
(V = 25µl)
Dream Taq MM 12,5µl
Mồi xuôi 0,2µl
Mồi ngược 0,2µl
H2O 11,1µl
2.2.3. Dụng cụ - Thiết bị
- Dụng cụ - Thiết bị thực nghiệm ở phòng nuôi cá: Bể composite; Máy sục khí;
Hệ thống sục khí; Xô nhựa; Vợt;…
Hình 2.1. Thang DNA 1kb

Trang 13
- Dụng cụ - Thiết bị trong phòng phân tích: Máy gel doc (Biorad); Máy ly tâm
lạnh; Máy PCR (Eppendorf); Vortex; Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad); Máy
đo quang phổ; Tủ ủ 370C; Tủ ủ lắc 280C; Tủ đông sâu - 800C; Tủ lạnh - 200C; Tủ
mát 40C; Eppendorf 1,5 ml; 0,2 ml; Cuvette 2 ml; Các dụng cụ chuyên dùng khác.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thí nghiệm 1: Thử nghiệm độc lực sơ bộ các chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm trên cá tra
Thử nghiệm được tiến hành trên quy mô bể bằng phương pháp ngâm với
chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại. Quá trình thí nghiệm được tiến hành
theo các bước sau:
2.3.1.1. Chuẩn bị cá
Cá được nuôi từ giai đoạn cá bột lên được 1 tháng tuổi, khỏe mạnh, linh hoạt.
Chuyển cá vào bể composite thử nghiệm mỗi bể 10con/50 lít nước/ bể trước một
tuần nhằm giúp cá ổn định và làm quen với bể trước khi thử nghiệm.
Chuẩn bị cá tra 1
tháng tuổi sạch bệnh
Chuẩn bị giống vi
khuẩn hoang dại
Ngâm cá với vi khuẩn trong 30
phút với nồng độ 106CFU/ml,
nhiệt độ 24 -26OC
Theo dõi cá chết ở từng bể trên
từng nồng độ
Kiểm tra sự hiện diện
của vi khuẩn E.ictaluri
trong mẫu cá chếtmặt
Sơ đồ 2.1. Quy trình thử nghiệm độc lực trên cá tra

Trang 14
Phương pháp chăm sóc và quản lý
- Thức ăn: Trùn chỉ và thức ăn bột Tomboy và thức ăn công nghiệp dạng miễng
- Lượng thức ăn: Tùy theo tình trạng của cá mà cung cấp lượng thức ăn cho phù
hợp tránh làm dơ môi trường nuôi.
- Thời gian cho ăn: 3 – 4 lần/ ngày
- Thay nước tuần hoàn mỗi ngày
- Thường xuyên si phông loại bỏ cặn bả (phân) có trong bể
- Các bể nuôi được bố trí hệ thống sục khí hoạt động 24/24 giờ.
2.3.1.2. Chuẩn bị các chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại
Các chủng vi khuẩn E. ictaluri tiến hành thử nghiệm: 1H; 3H; 5H; 7H; 9H; 11H;
14H; 17H; 22H; 26H; 1; 10; 13; 19; 20; 21; 23; 25; 26; 28; ĐN1.
- Bắt 1 khuẩn lạc đơn vi khuẩn E. ictaluri và 5ml BHI lỏng bổ sung kháng sinh
Colistin (nồng độ cuối là 20µg/ml) nuôi cấy qua đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút
ở 280C, trong 24giờ.
- Cấy chuyền tiếp 2,5ml dịch nuôi cấy vào 250ml BHI lỏng chứa kháng sinh
Colistin (nồng độ cuối là 20µg/ml). Nuôi cấy lắc qua đêm 250 vòng/phút ở 280C,
trong 24 giờ.
- Hút 1 ml dịch nuôi cấy đo OD600.
- Sinh khối vi khuẩn được ly tâm ở 2000 g/10 phút ở 40C, được huyền phù và pha
loãng trong NaCl 0,65%. Để đạt được nồng độ OD600 từ 1- 1,2.[16]
- Pha loãng, hút 100µl trải đĩa trên môi trường BHI bổ sung kháng sinh Colistin
(nồng độ cuối là 20 µg/ml), tính mật độ tế bào bào.
- Dịch vi khuẩn thí nghiệm được pha loãng ngâm cá ở nồng độ 106 CFU/ml.
2.3.1.3. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm 22 nghiệm thức, trong đó 21 nghiệm thức cá được ngâm với
chủng vi khuẩn E. ictaluri và 1 nghiệm thức đối chứng cá không ngâm với chủng vi
khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm
Chủng
Nồng độ ngâm
(CFU/ml)
Thể tích ngâm
(lít)
Số lượng cá
(con/bể)
Số lần lặp lại
1H 106 20 10 1
3H 106 20 10 1
5H 106
20 10 1
7H 106
20 10 1
9H 106
20 10 1
11H 106
20 10 1
14H 106
20 10 1
17H 106
20 10 1
22H 106
20 10 1
26H 106
20 10 1

Trang 15
1 106
20 10 1
10 106
20 10 1
13 106
20 10 1
19 106
20 10 1
20 106
20 10 1
21 106
20 10 1
23 106
20 10 1
25 106
20 10 1
26 106
20 10 1
28 106
20 10 1
ĐN1 106
20 10 1
ĐC (-) - - 10 1
Phương pháp ngâm: Cá từ các bể được vớt ra xô với thể tích 2 lít được ngâm vi
khuẩn ở nồng độ 106 CFU/ml trong thời gian 30 phút, nhiệt độ 24 – 26OC. Cá ở
nghiệm thức đối chứng được ngâm trong nước. Khi đủ thời gian ngâm, cá được vớt
ra khỏi xô và thả trở lại vào bể nuôi. Cá được theo dõi trong 14 ngày, ghi nhận tỷ lệ
chết và các biểu hiện triệu chứng bệnh tích.
2.3.1.4. Kiểm tra vi khuẩn E. ictaluri trong mẫu cá chết
a. Thu mẫu cá chết
Cá chết hằng ngày sẽ được thu theo từng bể riêng. Chọn những mẫu cá tiêu biểu
của từng bể trong ngày có đặc điểm như trên thân cá xuất hiện các vết bị lở loét,
hoặc xuất huyết ở vây và cơ, để tiến hành mổ bụng và cấy phân lập.
Thu nhận mẫu cá chết
Mổ bụng cá lấy dịch gan và
thận cấy ria trên BHI
Colistin 20%
Chọn khuẩn lạc
đặc trưng, để chạy
PCR kiểm tra.
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ quy trình xác định vi
khuẩn E.ictaluri trong mẫu cá chết

Trang 16
b. Cấy phân lập trên môi trường BHI bổ sung kháng sinh Colistin 20%
Cá được khử trùng bên ngoài bằng cồn 700 và lau sạch. Sau đó, dùng dao kéo đã
khử trùng để mổ cá. Khi mổ ta tiến hành cắt ngang phần bụng và cắt chéo lên phần
mang sau đó mở xoang bụng cá vừa cắt để thấy được nội tạng bên trong.
Dùng que cấy vòng chấm lên nội tạng cá, sau đó tiến hành cấy ria trên đĩa môi
trường BHI có bổ sung Colistin (nồng độ cuối là 20µg/ml). Sau 3 đến 5 ngày trong
280C tiến hành quan sát khuẩn lạc.
c. Tách DNA và tiến hành PCR
Bước 1: Bắt khuẩn lạc đơn trên đĩa đã được phân lập vào eppendorf, trộn đều với
10µl nước cất vô trùng, đưa mẫu vào lò vi sóng 600w/4phút (1 phút lấy ra đảo trộn),
bảo quản - 200C, DNA vi khuẩn được sử dụng cho phản ứng PCR.
Bước 2: Chuẩn bị Mix PCR. Chuẩn bị một lần cho tất cả các mẫu trong phản ứng
với thứ tự các thành phần như sau.
Thành phần PCR (V = 25 µl) (thao tác đều trên đá)
Bảng 2.4. Thành phần Mix PCR
Thành phần
Thể tích cho 1 phản ứng
(V = 25 µl)
Dream Taq MM 12,5µl
Mồi xuôi 0,2µl
Mồi ngược 0,2µl
H2O 11,1µl
DNA 1µl
Bước 3: Tiến hành PCR
Chu trình nhiệt: (1) Biến tính DNA ở nhiệt độ 950C trong 5 phút. (2) Khuếch
đại đoạn gen trong 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước.
 Giai đoạn 1: Biến tính sợi khuôn DNA ở 950C trong 30 giây.
 Giai đoạn 2: Mồi bắt cặp bổ sung với đoạn gen tương đồng trên sợi
khuôn ở 520C trong 30 giây.
 Giai đoạn 3: Tổng hợp kéo dài chuỗi ở 720C trong 1 phút 30 giây.
Phản ứng kết thúc ở 720C trong 7 phút để tạo sợi DNA hoàn chỉnh và ủ mẫu ở 40C.
Chương trình PCR.
T1 = 950C . 5 phút . 1 chu kỳ.
T2 = 950C . 30 giây.
T3 = 520C. 30 giây. 30 chu kỳ.
T4 = 720C. 30 giây.
T5 = 720C. 7 phút. 1 chu kỳ.
Giữ ở 40C.
Điện di kiểm tra trên gel 1,2% agarose để xác định sản phẩm PCR.

Trang 17
2.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định LD50 của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
bằng phương pháp ngâm cá tra
Chọn ra 1 chủng vi khuẩn có độc lực cao thử nghiệm độc lực xác định
LD50. Thử nghiệm tiến hành trên quy mô bể bằng phương pháp ngâm trên cá
hương. Quá trình thí nghiệm được tiến hành theo các bước sau
2.3.2.1. Chuẩn bị cá
Cá được nuôi từ giai đoạn cá bột lên được 1 tháng tuổi, khỏe mạnh, linh hoạt.
Chuyển cá vào bể composite thử nghiệm mỗi bể 30con/50 lít nước/bể trước một
tuần nhằm giúp cá ổn định và làm quen với bể thí nghiệm trước khi thử nghiệm.
Phương pháp chăm sóc và quản lý
Chuẩn bị cá tra 1
tháng tuổi sạch bệnh
Chuẩn bị giống vi khuẩn
hoang dại được tuyển
chọn ở thí nghiệm 1
Ngâm cá với vi khuẩn trong 30 phút
với nồng độ 105, 106, 107 CFU/ml,
nhiệt độ 24 -26oC
Theo dõi tỷ lệ cá chết và triệu
chứng bệnh tích,
xác định LD50
Kiểm tra sự có mặt của
vi khuẩn E.ictaluri trong
mẫu cá chết
Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm độc lực trên cá tra

Trang 18
- Thức ăn: Trùn chỉ và thức ăn bột Tomboy và thức ăn công nghiệp dạng miễng
- Lượng thức ăn: Tùy theo tình trạng của cá mà cung cấp lượng thức ăn cho phù
hợp tránh làm dơ môi trường nuôi.
- Thời gian cho ăn: 3 – 4 lần/ ngày
- Thay nước tuần hoàn mỗi ngày
- Thường xuyên si phông loại bỏ cặn bả (phân) có trong bể
- Các bể nuôi được bố trí hệ thống sục khí hoạt động 24/24 giờ.
2.3.2.2. Chuẩn bị các chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại
Chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại được thử nghiệm được tuyển chọn ở thí
nghiệm 1: 5H.
- Bắt 1 khuẩn lạc đơn vi khuẩn E. ictaluri vào 5 ml BHI lỏng bổ sung kháng sinh
Colistin (nồng độ cuối là 20µg/ml) nuôi cấy qua đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút
ở 280C, trong 24giờ.
- Cấy chuyền tiếp 2,5 ml dịch nuôi cấy vào 250ml BHI lỏng chứa kháng sinh
Colsitin (nồng độ cuối là 20µg/ml). Nuôi cấy lắc qua đêm 250 vòng/phút ở 280C,
trong 24giờ.
- Hút 1 ml dịch nuôi cấy đo OD600.
- Sinh khối vi khuẩn được ly tâm ở 2000 G/10 phút ở 40C, được huyền phù và pha
loãng trong NaCl 0,65%. Để đạt được nồng độ OD600 từ 1- 1,2
- Pha loãng, hút 100µl trải đĩa trên môi trường BHI bổ sung kháng sinh Colistin
(nồng độ cuối là 20µg/ml), tính mật độ tế bào.
- Dịch vi khuẩn thí nghiệm được pha loãng ngâm cá ở nồng độ 105, 106, 107
CFU/ml.
2.3.2.3. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, trong đó 3 nghiệm thức cá được ngâm với chủng
vi khuẩn E. ictaluri ở các nồng độ 105, 106, 107CFU/ml và 1 nghiệm thức đối chứng
cá không ngâm với chủng vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại ít nhất 3 lần.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm
Chủng
Nồng độ ngâm
(CFU/ml)
Thể tích ngâm
(lít)
Số lượng cá
(con/bể)
Số lần lặp lại
5H 105; 106; 107 2 30 3
ĐC (-) - - 30 3
Phương pháp ngâm: Cá từ các bể được vớt ra xô với thể tích 2 lít được ngâm vi
khuẩn ở nồng độ 105, 106, 107 CFU/ml trong thời gian 30 phút, nhiệt độ 24 – 26oC.
Cá ở nghiệm thức đối chứng được ngâm trong nước. Khi đủ thời gian ngâm, cá
được vớt ra khỏi xô và thả trở lại vào bể nuôi. Cá được theo dõi trong 14 ngày, ghi
nhận tỷ lệ chết và các biểu hiện triệu chứng bệnh tích.

Trang 19
2.3.2.4. Kiểm tra vi khuẩn E. ictaluri trong mẫu cá chết
d. Thu mẫu cá chết
Cách thu mẫu cá chết xem ở thí nghiệm 1 (mục a của 2.3.1.4).
e. Cấy phân lập trên môi trường BHI bổ sung kháng sinh Colistin20%
Quy trình phân lập trên môi trường BHI bổ sung kháng sinh Colistin 20% xem ở
thí nghiệm 1 (mục b của 2.3.1.4).
f. Tách DNA và tiến hành PCR
Quy trình tách DNA và tiến hành PCR xem ở thí nghiệm 1 (mục c của 2.3.1.4)
2.3.2.5. Xác định LD50 (Reed và Muench, 1938) của vi khuẩn gây bệnh thực
nghiệm trên cá
Xác định liều gây chết 50% số cá gây cảm nhiễm bằng Edwardsiella ictaluri
trong các nghiệm thức.
Công thức:
logLD50 = [log(>50%)] + [log(10-1)  pd] = y
 LD50 = 10y
 Liều gây chết 50% cá thí nghiệm = (nồng độ vi khuẩn huyền phù ban đầu)  10y
Trong đó: log(>50%): nồng độ gây chết trên 50%
Pd = [(>50%) – 50%] / [(>50%) – (<50%)]
Thu nhận mẫu cá chết
Mổ bụng cá lấy dịch gan và
thận cấy ria trên BHI
Colistin 20%
Chọn khuẩn lạc
đặc trưng, để chạy
PCR kiểm tra.
Sơ đồ 2.4. Sơ đồ quy trình xác định vi
khuẩn E.ictaluri trong mẫu cá chết

Trang 20
2.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
2.4.1. THÍ NGHIỆM 1: THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC SƠ BỘ CÁC CHỦNG VI
KHUẨN Edwardsiella ictaluri HOANG DẠI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NGÂM TRÊN CÁ TRA
Qua quá trình thử nghiệm độc lực sơ bộ với các chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm trên cá tra, ta được
kết quả như sau:
Kết quả đo OD600 của dịch vi khuẩn trước và sau ly tâm.
Bảng 2.6. Kết quả OD600 dịch vi khuẩn
Trước ly tâm Sau ly tâm
1H 0,416 0,897
3H 0,456 0,456
5H 0,459 0,914
7H 0,449 0,956
9H 0,439 1,059
11H 0,373 0,803
14H 0,456 0,930
17H 0,393 0,858
22H 0,376 0,874
26H 0,392 0,901
1 0,519 0,987
10 0,551 1,047
13 0,765 1,006
19 0,477 0,937
20 0,41 0,836
21 0,618 1,096
23 0,515 0,988
25 0,604 0,972
26 0,422 0,937
28 0,794 1,045
ĐN1 0,53 0,936
Kết quả đo OD của dịch vi khuẩn trước ly tâm là OD600 có giá trị thấp hơn mong
đợi OD600 = 1,20. Ta tiến hành ly tâm cô đặc, để cho kết quả đo gần bằng
OD600=1,20.
OD
Chủng

Trang 21
Kết quả đếm khuẩn lạc và mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn sau khi ủ:
Bảng 2.7. Kết quả pha loãng trải đĩa các chủng vi khuẩn
Đĩa 1 Đĩa 2
Số khuẩn lạc
Mật độ tế bào
(tb)
Số khuẩn lạc
(tb)
1H 0 0 0 0
3H 378 3,78.109 354 3,54.109
5H 67 0,67.109 70 0,7.109
7H 0 0 0 0
9H 0 0 0 0
11H 0 0 0 0
14H 0 0 0 0
17H 0 0 0 0
22H 0 0 0 0
26H 0 0 0 0
1 2 0,02.109 2 0,02.109
10 34 0,34.109 20 0,2.109
13 0 0 0 0
19 63 0,63.109 30 0,3.109
20 12 0,12.109 8 0,08.109
21 10 0,1.109 61 0,61.109
23 14 0,14.109 9 0,09.109
25 2 0,02.109 1 0,01.109
26 0 0 0 0
28 5 0,05.109 9 0,09.109
ĐN1 158 1,58.109 161 1,61.109
Nồng
độ
Chủng

Trang 22
Sau 48 giờ nuôi cấy, ta thấy các đĩa 3H, 5H, 1, 10, 19, 20, 21, 23, 25, 28, ĐN1
xuất hiện khuẩn lạc và số lượng khuẩn lạc ở các đĩa cũng khác nhau. Các đĩa còn lại
không mọc khuẩn lạc.
Giải thích: Những đĩa không mọc khuẩn lạc do thao tác thí nghiệm còn nhiều
thiếu xót, cấy trải khi que cấy còn nóng làm chết vi khuẩn trong mẫu cần cấy.
Dịch vi khuẩn sau khi cô lại đạt giá trị OD600 ~ 1,2 và mật độ tế bào đạt 109 thì
tiến hành pha loãng ngâm cá ở nồng độ 106 CFU/ml. Kết quả thể hiện ở bảng 2.8.
Bảng 2.8. Tổng số cá chế và tỷ lệ cá chết trong thử nghiệm độc lực sơ bộ các
chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại nồng độ 106 bằng phương pháp ngâm
Chủng vi khuẩn
Tổng số cá chết/10
con ban đầu
Tỷ lệ cá chết (%)
1H 7 70
3H 5 50
5H 6 60
7H 3 30
9H 4 40
11H 7 70
14H 6 60
17H 8 80
22H 4 40
26H 5 50
1 0 0
10 0 0
13 0 0
Hình 2.2. Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri 5H
cấy trải trên môi trường BHI

Trang 23
19 0 0
20 8 80
21 0 0
23 0 0
25 0 0
26 0 0
28 0 0
ĐN1 0 0
ĐC (-) 0 0
Ta tiến hành so sánh độc lực của chủng E.ictaluri hoang dại trên cá tra ở giai
đoạn cá hương với phương pháp ngâm và được ngâm trong 30 phút, ở nồng độ106
CFU/ml. Kết quả thể hiện qua biều đồ 3.2.
Sau 14 ngày theo dõi, tỉ lệ chết cá chết ngâm ở các chủng vi khuẩn có sự khác
biệt. Trong đó, các chủng vi khuẩn 1H, 5H, 11H, 17H, 20 có tỉ lệ các chết cao so
với các chuẩn còn lại. Do những chủng này mới được phân lập gần đây, nên khả
năng gây độc cao. Và các chủng vi khuẩn ĐN1, 1, 10, 13, 19, 21, 23, 25, 26, 28
không gây cá chết.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1H
3H
5H
7H
9H
11H
14H
17H
22H
26H
ĐN1
1
10
13
19
20
21
23
25
26
28
ĐC
Tỷlệcáchết(%)
Tỷ lệcá
chết (%)
Chủng vi khuẩn ngâm cá
Hình 2.3. Biểu đồ so sánh tỉ lệ cá chết ở các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở các nồng
độ 106 trong phương pháp ngâm

Trang 24
Kết quả phân lập vi khuẩn E.ictaluri trên mẫu cá chết
Kết quả điện di của mẫu cá chết nghi nhiễm E.ictaluri.
Trong đó:
- Giếng số 1: Thang DNA chuẩn 1kb.
- Giếng số 2: Mẫu khuẩn lạc ở đĩa cá ngâm chủng E. ictaluri 1H.
- Giếng số 7: Mẫu khuẩn lạc ở đĩa cá ngâm chủng E. ictaluri 1.
Hình 2.4. Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri
5H phân lập trên mẩu cá chết
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14
200bp
Hình 2.5. Kết quả điện di khuẩn lạc trên gel agarose 1,2%

Trang 25
- Giếng số 11: Mẫu khuẩn lạc ở đĩa cá ngâm chủng E. ictaluri 21
- Giếng số 12: Mẫu khuẩn lạc ở đĩa cá ngâm chủng E. ictaluri 23
- Giếng số 13: Mẫu đối chứng dương chứa DNA của E. ictaluri.
- Giếng số 14: Mẫu đối chứng âm không chứa DNA.
Từ các khuẩn lạc trắng đục và có rìa răng cưa được chọn trên môi trường BHI agar
của mẫu gan của cá chết trong bể, từ giếng số 2 đến giếng số 12. Kết quả cho thấy
các vạch đều có sản phẩm khuếch đại khoảng 200bp, chứng tỏ chủng vi khuẩn phân
lập là E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Nguyên nhân gây chết cá là do vi
khuẩn E.ictaluri gây ra
2.4.2. THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CHỦNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM CÁ TRA
Qua quá trình thử nghiệm xác định LD50 của chủng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm trên cá tra, ta được kết quả như sau:
Kết quả đo OD600 của dịch vi khuẩn trước và sau ly tâm:
Bảng 2.9.Kết quả OD600 dịch vi khuẩn
Trước ly tâm Sau ly tâm
5H 0,693 1,151
Kết quả đo OD của dịch vi khuẩn trước ly tâm OD600 = 0,693 thấp hơn mong đợi
OD600 = 1,20. Ta tiến hành ly tâm cô đặc kết quả cho OD600 = 1,151 gần bằng
OD600= 1,20.
Kết quả đếm khuẩn lạc và mật độ tế bào trên trường nồng độ của chủng vi
khuẩn sau khi ủ:
Bảng 2.10. Kết quả pha loãng trải đĩa các chủng vi khuẩn
Đĩa 1 Đĩa 2
Số khuẩn lạc
(tb)
Số khuẩn lạc
(tb)
5H 0 0 0 0
Sau khi nuôi cấy ta thấy các đĩa không xuất hiện khuẩn lac.
Giải thích :Những đĩa không mọc khuẩn lạc do thao tác thí nghiệm còn nhiều thiếu
xót, cấy trải khi que cấy còn nóng làm chết vi khuẩn trong mẫu cần cấy
Dịch vi khuẩn sau khi cô lại đạt giá trị OD600 ~ 1,2 và mật độ tế bào đạt 109 thì
tiến hành pha loãng ngâm cá ở nồng độ 105, 106, 107 CFU/ml. Kết quả thể hiện ở
bảng 2.8.
OD
Chủng
Nồng
độ
Chủng

Trang 26
Bảng 2.11. Tỷ lệ cá chết trong thử nghiệm đánh giá độc lực chủng hoang dại
E.ictaluri 5H bằng phương pháp ngâm
Nghiệm
thức
Tổng cá
chết/30 con
ban đầu
Tỷ lệ cá chết
(%)
Tỷ lệ cá chết
cộng dồn
(%)
Tỷ lệ trung bình cá
chết ở các nồng độ
(%)
5H 105 (1) 23 77
56,522 57,667  0,130b
5H 105 (2) 19 63
5H 105 (3) 10 33
5H 106 (1) 29 97
98 98,000  0,010c5H 106 (2) 29 97
5H 106 (3) 30 100
5H 107 (1) 30 100
100 100  0,000c5H 107 (2) 30 100
5H 107 (3) 30 100
ĐC (-) (1) 0 0
0 0  0aĐC (-) (2) 0 0
ĐC (-) (3) 0 0
Các chữ cái a,b,c,…. Khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) giữa
các giá trị thống kê được sử lý bằng phần mềm sử lý số liệu stagraphics.
Ta tiến hành so sánh khả năng độc lực của chủng E.ictaluri 5H hoang dại trên cá
Tra ở giai đoạn cá hương với phương pháp ngâm và được ngâm trong 30 phút, ở 4
nồng độ 105 CFU/ml, 106 CFU/ml, 107 CFU/ml
Sau 14 ngày theo dõi, nồng độ 107 CFU/ml là có lượng cá chết đạt cao nhất (100
± 0,000c), tiếp đó là nồng độ 106 CFU/ml (98,000  0,010c), nồng độ 105 CFU/ml
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
ĐC (-) 5H 10^5 5H 10^6 5H 10^7
Tỉlệcáchết(%)
Nghiệm thức
Hình 2.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ cá chết ở các nồng độ vi khuẩn E.ictaluri 5H
ở các nồng độ khác nhau trong phương pháp ngâm

Trang 27
(57,667  0,130b) và ĐC (0 ± 0a). Ở các nồng độ khác nhau, tỉ lệ chết của cá chết thí
nghiệm có sự khác nhau rõ rệt, tỉ lệ chết tỉ lệ thuận với nồng độ ngâm vi khuẩn. So
sánh với hệ số khác biệt và giá trị phân hạn thì ở nồng độ 105 CFU/ml đạt được kết
quả có ý nghĩa nhất (57,667  0,130b).
Kết quả LD50 của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri hoang dại 5H
Từ kết quả trên:
Độ pha loãng có tỷ lệ cá chết >50% là 5H 105
Độ pha loãng có tỷ lệ cá chết <50% là không có.
 Pd = 13/113
 Log LD50 = - 464/113
 Liều gây chết cá 50% = 9,4.104 CFU/ml
Kết quả phân lập vi khuẩn E.ictaluri trên mẫu cá chết
Kết quả điện di của mẫu cá chết nghi nhiễm E.ictaluri
Hình 2.7. Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri 5H106
phân lập trên mẩu cá chết
1 2 3 4 5 6 7 8
200bp
Hình 2.8. Kết quả điện di khuẩn lạc trên gel agarose 1,2%

Trang 28
Trong đó
- Giếng số 1: Thang DNA chuẩn 1kb.
- Giếng số 2: Mẫu khuẩn lạc ở đĩa 105 cá ngâm chủng E. ictaluri 5H.
- Giếng số 7: Mẫu đối chứng dương chứa DNA của E. ictaluri ĐN1.
- Giếng số 8: Mẫu đối chứng âm không chứa DNA.
Từ các khuẩn lạc trắng đục và có rìa răng cưa được chọn trên môi trường BHI
agar của mẫu gan của cá chết trong bể, từ giếng số 2 đến giếng số 6. Kết quả cho
thấy các vạch đều có sản phẩm khuếch đại khoảng 200bp, chứng tỏ chủng vi khuẩn
phân lập là E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Nguyên nhân gây chết cá là
do vi khuẩn E.ictaluri gây ra

Trang 29
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. NHẬN XÉT VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP
Trong thời gian thực tập tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM tôi đã
được trung tâm tạo điều kiện tốt, trung tâm được trang bị đầy đủ các thiết bị, hóa
chất hỗ trợ tốt cho việc thực hiện đề tài thực tập, trong công việc, làm việc cùng các
anh chị hướng dẫn rất tận tình, giúp đỡ chỉ bảo nhiều điều cả về kiến thức và kinh
nghiệm làm việc. Được làm việc với Ths. Bùi Thị Thanh Tịnh, chị đã hướng dẫn từ
cách bố trí thí nghiệm, giải thích rõ ràng từng vấn đề, làm quen với thao tác phòng
thí nghiệm từ cơ bản đến phức tạp
4.2. BÀI HỌC KINH NGHIỆM
- Giúp tôi có thêm kỹ năng làm việc trong một môi trường làm việc khoa học.
- Học hỏi được nhiều kiến thức chuyên ngành.
- Biết cách bố trí thí nghiệm hợp lý.
- Học hỏi kinh nghiệm làm việc từ các anh, chị tại trung tâm CNSH Tp.HCM.
- Biết cách sắp xếp thí nghiệm logic và lên kế hoạch cụ thể cho từng công đoạn thí
nghiệm. Qua đó giúp em có thể hệ thống lại những kiến thức và nguyên tắc đã được
học.
- Bên cạnh đó em còn học được phương pháp làm việc nhóm lẫn làm việc cá nhân,
cần có tinh thần trách nhiệm trong mọi việc mình làm vì bất cứ thí nghiệm nào dù ở
giai đoạn nào cũng vô cùng quan trọng đòi hỏi tính chính xác cao.
3.3. KIẾN NGHỊ
Nên tiến hành thử nghiệm độc lực của các chủng E.ictaluri đã được phân lập ở
mẫu cá chết ở các tỉnh khác nhau như Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long,…
Thử nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ của vaccine nhược độc với chủng
E.ictaluri DN hoang dại.

Trang 30
PHẦN 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Trọng Bình, Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến bằng phương
pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh gan thận mủ cho cá tra.
2008. Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.
2. Bùi Quang Tề. Bệnh học Thủy sản. 2006. Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản
I.
3. Phạm Văn Thư. Sử dụng vaccine trong nuôi trồng Thủy sản. 2006. Viện nghiên
cứu nuôi trồng Thủy sản I.
4. Dung, T.T, N.T.N. Ngọc, N.Q. Thịnh, D.T.M.Thy, M. Crumlish, H.W.
Ferguson, Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên gan cá Tra (Pangasius
hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. 2003. Đại học
Cần Thơ và Viện Thủy Sản, Đại học Stirling, trang 413-415.
Tài liệutiếng anh
5. Akinbowale, L.O, H. Peng and D.M. Barton, 2007. Antimicrobial resistance in
bacteria isolated from aquaculture sources in Australia. Journal of Applied
Microbiology. 103: 1364-5072.
6. Aoki, T. and A. Takahashi, 1987. Class D tetracycline resistance determinants
of R-plasmids from fish pathogens Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda
and Pasteurella piscisida. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 31: 1270-
1280.
7. Arias, C.R., C.A. Shoemaker, J.J. Evans, P.H. Klesius, A comparative study of
Edwardsiella ictaluri parent (EILO) and E. ictaluri Rifampicin – mutant (RE –
33) isolates using lipopolysarcharides, outer membrane proteins, fatty acids,
Biolog, API 20E and genomic analyses. Journal of Fish Diseases., 2003. 26: p.
415-421.
8. Lafrentz, B. R., S.E. Lapatra, D.R. Call, K.D. Cain, Isolation of Rifampicin
resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential as live
attenuated vaccine candidate. Vaccine., 2008. 26: p. 5582-5589.
9. Lawrence, M.L., R.K. Cooper, R.L. Thune, Attenuation, persistence and vaccine
potential of an Edwardsiell ictaluri purA mutant. Inflection and Immunity.,
1997. 65(11): p. 4642-4651.
10.Plumb, J.A., S. Vinitnantharat, W.D. Paterson, K. Salonius, Prevention of
enteric of septicemia in catfish by vaccination. In Diseases in Asian aquaculture
II., 1995. p. 393-403.
11.Prescott, J.F., J.D. Baggot and R.D. Walker, 2000. Antimicrobial therapy in
veterinary medicine. Lowa State University press/Ame: 796 pp.
12.Shoemaker, C.A., P.H. Klesius, J.M. Bricker, Efficacy of a modified live
Edwardsiella ictaluri vaccine in channel catfish as young as seven days post
hatch. Aquaculture., 1999. 176: p. 189-193.

Trang 31
13.Shotts, E. B. and W. D. Waltman (1990),A medium for the selective isolation of
Edwardsiella ictaluri, Journal of Wildlife Diseases, pp. 214-218
14.Shotts, E. B., et all (1996),Chondroitinase attenuated Edwardsiella ictaluri and
a vaccine for prevention of enteric septicemia (es) in fish, United State Patent.
15.Thinh, N.H., T.Y. Kuo, L.T. Hung, T.H. Loc, S.C. Chen, Ø. Evensen, H.J.
Schuurman, Combine immersion and oral vaccination of Vietnamese catfish
(Pangasianodn hypophthalmus) confers protection against mortality caused by
Edwarsiella ictalui. Fish & Shellfish Immunology., 2009. 27: p. 773-776.
16.Thune, R.L., D.H. Fernandez, and J.R. Battista, An aroA Mutant of Edwardsiella
ictaluri Is Safe and Efficacious as a Live, Attenuated Vaccine.Journal of Aquatic
Animal Health, 1999. 11(4): p. 358-372.
Tài liệu Internet
17.Bệnh gan thận mủ ở cá Tra và cá Ba sa, http://www.vemedim.vn/chitiettt.
php?id=44
18.Thử nghiệm tiêm vắc xin cá tra trên diện rộng _http://www.vasep.com.vn/Tin-
Tuc/53_36/.
19.http://www.hcmbiotech.com.vn/home.php
20.http://www.fistenet.gov.vn/

Trang 32
PHỤ LỤC
Bảng theo dõi cá thử nghiệm độc lực các chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri hoang
dại
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tỷ lệ cá
chết
1H 4 1 1 1 70%
3H 1 4 50%
5H 2 3 1 60%
7H 1 1 1 30%
9H 1 2 1 40%
11H 2 2 2 1 70%
14H 2 3 1 60%
17H 7 1 80%
22H 4 40%
26H 3 1 1 50%
1 0%
10 0%
13 0%
19 0%
20 1 5 2 80%
21 0%
23 0%
25 0%
26 0%
28 0%
ĐN1 0%
Bảng theo dõi số liệu cá chết khi ngâm chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri hoang
dại 5H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14  cá chết
Tỷ lệ
(%)
5H 10^5 (1) 4 6 7 1 1 3 1 23 76,66
5H 10^5 (2) 2 9 8 19 63,33
5H 10^5 (3) 4 4 2 10 33,33
5H 10^6 (1) 2 18 3 1 5 29 96,66
5H 10^6 (2) 1 11 13 2 2 29 96,66
5H 10^6 (3) 6 14 5 4 1 30 100
5H 10^7 (1) 1 23 6 30 100
5H 10^7 (2) 2 20 7 1 30 100
5H 10^7 (3) 1 22 7 30 100
ĐC (-) (1) 0 0
ĐC (-) (2) 0 0
ĐC (-) (3) 1 0 0
Chủng E.ictaluri 5 H hoang dại.
Summary Statistics forti le ca chet
Nong do Count Average Standard deviation Coeff. of variation Standard error Minimum Maximum Range
0 0 ,0 ,0 % ,0 ,0 ,0 ,0
5H 105 3 57,6667 22,4796 38,982% 12,9786 33,0 77,0 44,0
5H 106 3 98,0 1,73205 1,7674% 1,0 97,0 100,0 3,0
5H 107 3 100,0 ,0 ,0% ,0 100,0 100,0 ,0
Total 9 85,2222 23,5573 27,6422% 7,85242 33,0 100,0 67,0
Method:95,0 percent LSD
Nong do Count Mean Homogeneous Groups
0 3 ,0 X
5H 105 3 57,6667 X
5H 106 3 98,0 X
Chủng
Ngày
Chủng

Trang 33
5H 107 3 100,0 X
Bảng xử lý số liệu xác định LD50
Nồng
độ
(tb/ml)
Nồng độ
pha
loãng
(tb/ml)
Số cá thí
nghiệm
(con)
Số cá chết
(con)
Số cá sống
(con)
Số cá chết
cộng dồn
(con)
Số cá sống
cộng dồn
(con)
Tỉ lệ
chết
(%)
Tỉ lệ
chết
cộng
dồn
(%)
5H 107 10-2 30 30 0 76,666666 0 100 100
5H 106 10-3 30 29,333333 0,666667 46,666666 0,666667 98 98,6
5H 105 10-4
30 17,333333 12,666667 17,333333 13,333334 57,7 56,5
ĐC (-) 0 30 0 30 0 43.333.334 0 0

Đề tài độc lực chủng và LD50 của chủng E. ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Đề tài độc lực chủng và LD50 của chủng E. ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm

Similar to Đề tài độc lực chủng và LD50 của chủng E. ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm (20)

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (18)

Đề tài độc lực chủng và LD50 của chủng E. ictaluri hoang dại bằng phương pháp ngâm