Download to read offline
More Related Content
Similar to Лекция 4. Биотехнология первичных метаболитов.pptx
Лекция 4. Биотехнология первичных метаболитов.pptx
- 1. Лекция 4. Биотехнология первичныхметаболитов Лектор: Сагындыкова Ляззат Жумабековна, преподаватель кафедры фармацевтических дисциплин, магистр медицинских наук
- 2. План лекции 1. Получениеаминокислот, ферментов биотехнологическими методами. 2. Биотехнология вторичных метаболитов.
- 3. Аминокислоты – этоосновные структурные единицы белковых молекул, в которых одновременно содержатся карбоксильные и аминные группы. Аминокислота является производным карбоновой кислоты, у которой замещены один или более атомов водорода в их радикалах на одну или более аминогрупп с общей формулой. Рис. 1. Структура аминокислоты
- 4. Заменимые аминокислоты Незаменимыеаминокислоты ГЛИЦИН АЛАНИН ЦИСТЕИН (ЦИСТИН) АСПАРАГИНОВАЯ КИСЛОТА ТИРОЗИН АСПАРГИН СЕРИН ГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА ГЛУТАМИН ПРОЛИН ВАЛИН ЛЕЙЦИН ИЗОЛЕЙЦИН ТРЕОНИН МЕТИОНИН ФЕНИЛАЛАНИН ТРИПТОФАН ЛИЗИН ГИСТИДИН АРГИНИН В организме человека синтезируется только 10 из 20 известных аминокислот. Это так называемые заменимые аминокислоты. Эти аминокислоты могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и липидов. Остальные 10 аминокислот не синтезируются в организме, поэтому они были названы жизненно необходимыми, или незаменимыми аминокислотами. Таблица 1 – Перечень заменимых и незаменимых аминокислот
- 5. Аминокислоты – оптическиактивные соединения. Физиологически и терапевтически активны L-формы аминокислот. Все входящие в состав живых организмов α-аминокислоты, кроме глицина, содержат асимметричный атом углерода (треонин и изолейцин содержат два асимметричных атома). Почти все встречающиеся в природе α-аминокислоты имеют L-форму. Стереоспецифичны транспорт и метаболизм аминокислот, проницаемость аминокислот для клеток и другие функции. Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать эквимолярную смесь L- и D-аминокислот (рацематы), дальнейшее разделение которых представляет трудную задачу и экономически неэффективно. Аминокислоты широко применяют в медицине: • для терапии послеоперационных больных, • при лечении заболеваний ЦНС, • язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, печени (серотонин, аспарагин, валин, гистидин, глицин, глутамин и глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, метионин, пролин, тирозин, триптофан, фенилаланин, цистеин).
- 6. Коммерческие препараты аминокислотполучают, в основном, при помощи четырех методов: • биологический – экстракция из белковых гидролизатов (растений, животных, микроорганизмов); • микробиологический – биосинтез или очистка продуктов метаболизма бактерий – Corynebacterium, Brevi bacterium spp, (в частности, Brevibacterium flavum), Bacillus, Aerobacter, Micobacterium, Eschirichia и др.; • химико-энзиматический – энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот с образованием активных L-изомеров (например, синтез аспарагиновой кислоты из фумаровой с использованием клеток кишечной палочки и синтез L-фенилаланина из коричной кислоты с использованием клеток дрожжей); • химический синтез – использование тонкого органического синтеза. Наиболее часто для получения аминокислот используют микробиологический и химико-энзиматический методы.
- 7. Гидролиз природного белоксодержащегосырья (биологический способ) Условия гидролиза природного белоксодержащего сырья достаточно «жесткие». Отходы пищевой и молочной промышленности выдерживают при 105 °С 24–48 ч в вакууме в присутствии 20 %-й соляной кислоты. При кислотном гидролизе полностью разрушаются триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (до 30 %). Белковые гидролизаты сегодня применяют в животноводстве, пищевой и микробиологической промышленности.
- 8. № Штамм-продуцент аминокислот Синтезируемые аминокислоты 1 Brevibacteriumflavum Аргинин, Гистидин, Изолейцин, Лизин, Валин, Фенилаланин, Треонин, Тирозин 2 Corynebacterium glutamicum Аргинин, Гистидин, Изолейцин, Лизин, Фенилаланин, Серин, Валин, Тирозин 3 Bacillus subtilis Изолейцин, Триптофан 4 Serratia marcescens Аргинин, Гистидин, Изолейцин, Лейцин 5 Micrococcus Триптофан 6 Candida utils Триптофан 7 E. Coli Треонин Таблица 2 – Штаммы-продуценты аминокислот
- 9. Химический синтез даетрацемат – продукт, содержащий как L-, так и D-формы аминокислот. За исключением глицина, который не имеет оптически активных изомеров, и метионина, который усваивается организмом в обеих формах. Причем, D-изомеры обладают токсичностью. Получение оптически активных L- изомеров аминокислот из продуктов гидролиза природных материалов растительного и животного происхождения связано с многоступенчатой и дорогостоящей очисткой. Разделение D- и L-форм аминокислот – трудная и трудоемкая задача, первым этапом которой является получение диастереомеров – производных аминокислот с двумя оптически активными центрами. Диастереомеры отделяют друг от друга методами дробной кристаллизации или избирательной экстракции и т.п.
- 10. который далее используетсяв качестве карбонильного компонента синтеза Штреккера: CH3SCH2CH2CHO + HCN + NH3 = CH3SCH2CH2CH(NH2)CN CH3SCH2CH2CH(NH2)CN + H2O = CH3SCH2CH2CH(NH2)COOH Промышленный синтез DL-метионина (α-амино-γ- метилтиомасляная кислота) осуществляют исходя из акролеина, непредельного альдегида H2C = CH – CHO На первой стадии присоединением метилмеркаптана к акролеину синтезируют 3-метилтиопропионовый альдегид: CH3SH + H2C = CH – CHO = CH3SCH2CH2CHO
- 11. Биотехнологическое получение аминокислотвключает в себя как прямую микробную ферментацию, так и микробиологический или ферментативный синтез из предшественников. Используемые в промышленности микроорганизмы можно разделить на: • дикие штаммы, • ауксотрофные мутанты, • регуляторные мутанты • ауксотрофные регуляторные мутанты. Промышленные штаммы, как правило, несут несколько мутаций, затрагивающих механизмы регуляции целевой аминокислоты и её предшественников. Промышленный штамм должен обладать способностью к сверхсинтезу нужной аминокислоты. Для этой цели выбирают полиауксотрофные мутанты, т.е. те клетки микроорганизмов, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для роста и развития клетки различные аминокислоты, а с другой – приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты.
- 12. Биотехнологическое получение аминокислот,основанное на способности микроорганизмов синтезировать все L-аминокислоты, является сегодня широко распространенным. Микробиологическое промышленное производство L-аминокислот можно осуществлять по двум технологическим схемам (двухступенчатый способ). Таким путем получают, в частности, L-лизин. Первая ступень • предполагает образование и подготовку предшественника, а также биосинтез ферментного препарата микробного происхождения, который будет трансформировать предшественник в целевую аминокислоту. Вторая ступень • процесс трансформации полученного на 1-й стадии предшественника в аминокислоту с помощью ферментных систем микроорганизмов.
- 13.
- 14. Пути синтеза большинствааминокислот взаимосвязаны. При этом одни аминокислоты являются предшественниками для биосинтеза других. Например, • L-пируват является предшественником аланина, валина, лейцина; • 3-фосфо-глицерат является предшественником серина, глицина, цистеина; • щавелево-уксусная кислота – предшественник аспартата, аспарагина, метионина, лизина, треонина, изолейцина; • α-кетоглутаровая кислота – предшественник глутамата, глутамина, аргинина, пролина; • фосфоэнолпируват + эритрозо-4-фосфат – предшественник фенилаланина, тирозина, триптофана; • 5-фосфорибозил-1-пирофосфат + АТФ – предшественник гистидина. Одноступенчатый способ синтеза аминокислот с помощью микроорганизмов основан на культивировании строго определенного штамма-продуцента целевой аминокислоты на среде определенного состава при соответствующих параметрах ферментационного процесса.
- 15. Этапы синтеза аминокислотмикроорганизмами: 1. Процесс фиксации азота: Некоторые микроорганизмы способны преобразовывать азот из атмосферы в аммиак или другие формы, доступные для использования в биологических процессах. Это особенно важно для синтеза аминокислот, так как азот является ключевым компонентом. N2+3H2→2NH3 2. Транспорт аммиака: После фиксации азота, аммиак транспортируется в клетку. В бактериях, например, это может происходить через специализированные переносчики аммиака. 3. Синтез аминокислот: Первоначально, общая аминокислотная структура может быть синтезирована через цикл Кребса и другие метаболические пути. Затем специфичные ферментативные реакции добавляют аминогруппы и формируют конечные аминокислоты. Ключевые молекулы, такие как α-кетокислоты, могут быть использованы в различных реакциях, включая трансаминирование и добавление аминогруппы. Примерный общий путь для глутамина: α−Ketoglutarate+ NH4+ + ATP → Glutamate + NADPH + H+ + CO2 Затем, через дополнительные реакции, глутамин может быть синтезирован из глутамата. 4. Регуляция путей синтеза: Синтез аминокислот обычно регулируется фидбек-механизмами (т.е. по принципу обратной связи). Если уровень определенной аминокислоты в клетке достигает достаточного уровня, процессы ее синтеза могут замедлиться или приостановиться. Это обеспечивает баланс и эффективное использование ресурсов.
- 16. Целью биотехнолога являетсянарушение этих систем регуляции с дальнейшим отбором ауксотрофных мутантов на селективных средах с использованием мутагенов (УФ, рентгеновские лучи, нитрозосоединения и др.). Важно, что получение ауксотрофных мутантов-продуцентов аминокислоты возможно только для микроорганизмов с разветвленной цепью биосинтеза, т.е. по крайней мере две аминокислоты должны синтезироваться из одного предшественника. У таких ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците другой не приводит к подавлению активности первого фермента. Однако аминокислота, биосинтез которой нарушен, должна быть добавлена в ограниченном количестве. Одним из подходов к получению штаммов с повышенной способностью к синтезу аминокислот является получение мутантов с нарушенной регуляцией биосинтеза аминокислот. Отбор таких мутантов проводят in vitro на средах с повышенным содержанием аминокислот или их аналогов.
- 17. Синтез лизина Одноступенчатого микробиологического синтез промышленное культивированиеауксотрофных мутантов бактерий из рода Corynebacterium Химико-энзиматический способ L-ЛИЗИН (LYSIN) (Алифатическая двухосновная аминокислота) В фармации используется в виде лизина гидрохлорида. Лизин выполняет важнейшие биохимические функции: способствует секреции пищеварительных ферментов и транспорт кальция в клетки, улучшает общий азотный баланс в организме.
- 18. Одноступенчатый микробиологический синтезлизина В клетках бактерий лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты через ряд промежуточных этапов, связанных с образованием альдегида аспарагиновой кислоты. Альдегид аспарагиновой кислоты является также одним из предшественников в синтезе аминокислот – треонина, метионина и изолейцина. Процесс синтеза аминокислоты начинается фосфорилированием аспарагиновой кислоты с участием аллостерического фермента аспартаткиназы, активность которого ингибируется совместным действием двух аминокислот – лизина и треонина, если они накапливаются в клетках бактерий в избыточной концентрации (feedback-регуляция). Если понизить концентрацию одной из этих аминокислот, то синтез другой будет осуществляться даже при условии, когда она накапливается в довольно высокой концентрации. Поэтому для снятия регуляции синтеза лизина необходимо прекратить образование треонина на стадии превращения альдегида аспарагиновой кислоты в
- 19.
- 20. Состав питательной среды: •источника углерода: смесь уксусной кислоты и свекловичную мелассу, небольшие добавки сахара в среду (около 1 %) - повышают выход лизина на 30–50 %; • источника азота: соли аммония, мочевина,: • источники БАВ: кукурузный экстракт (1,2–1,5 % по содержанию сухих веществ), гидролизаты дрожжей, для жизнедеятельности микроорганизмов микро-и макроэлементы, витамины (биотин и др.). Среда должна содержать в 1 литре: 200 мг метионина, 800 мг треонина, 15–20 мкг биотина. Соотношение углерода и азота в среде оптимально как 11 : 1. В процессе культивирования микроорганизмов обеспечивается подача стерильного воздуха с помощью специальных турбинных мешалок, для предотвращения вспенивания субстрата и клеточной суспензии в среду культивирования добавляют пеногасители.
- 21. Технологический процесс: Посевной материалвначале выращивается в посевных аппаратах при 28–32°C, рН 7,0–7,2 в течение 18–24 ч, полученная суспензия клеток подается в производственные ферментеры, в которых поддерживается постоянный режим аэрации, избыточное давление 20–30 кПа, непрерывное перемешивание, контроль за всеми параметрами среды. Культивирование осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре. Время ферментации составляет 55–72 ч. Накопление в культуральной жидкости лизина начинается через 25–30 ч после начала выращивания промышленной культуры и к концу ферментации достигает 40-50 г/л.
- 22. Очистка готового продукта: Культуральнуюжидкость отделяют от культуры клеток продуцента фильтрованием и используют для получения лизина. Для получения очищенной субстанции лизина культуральную жидкость после фильтрования подкисляют соляной кислотой до рН 1,6–2. Образовавшийся в результате взаимодействия с соляной кислотой раствор монохлоргидрата лизина направляют на колонки с катионитом, где происходит сорбция аминокислоты и отделение ее от культуральной жидкости. Затем проводят десорбцию аминокислоты элюированием 0,5–5 % раствором аммиака. Элюат выпаривают под вакуумом при 60°C до концентрации 30–50 %, после подкисленный соляной кислотой раствор монохлоргидрата высушивают. Путем перекристаллизации полученной соли можно получить субстанцию с содержанием монохлоргидрата лизина в количестве 97–98 %.
- 23. Химико-энзиматический способ получениялизина В ряде стран (Японии, США и др.) для получения лизина применяется химико- энзиматический метод, позволяющий создать высокоэффективные технологии, основанные на ферментативной конверсии в лизин α-амино-ε- капролактама, который получают химическим методом из циклогексана: Циклогексан ► D-, L-капролактам ► L-лизин В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь D- и L- капролактама, направляющаяся в реактор с гидролазой α-амино-ε- капролактама, который катализирует превращение L-капролактама в L-лизин. D-изомер капролактама затем превращается в L-изомер с помощью специфической рацемазы. При такой технологии получения лизина его содержание в реакционной смеси по завершении рабочего цикла достигает свыше 150 г/л. Продуценты гидролазы α-амино-ε-капролактама – некоторые штаммы дрожжей из рода Cryptococcus, Candida, Trichosporon, которые выращивают в щелочной оптимизированной для синтеза фермента питательной среде, содержащей активаторы – ионы магния, марганца и цинка. Для ферментативной реакции превращения капролактама в лизин может использоваться клеточная суспензия дрожжевых клеток с активным ферментом, клеточный экстракт (после разрушения и отделения клеток) или очищенный фермент. Продуценты рацемазы – бактерии Achromobacter, Flavobacterium и др.
- 25. Препараты аминокислот Тетракард (аргинина гидрохлорид,лизина гидрохлорид, таурин, ацетилсалициловая кислота) в составе комплексной терапии стабильной стенокардии у пациентов без перенесенного инфаркта миокарда. Аспаркам (калия и магния аспартат) применяется при дефиците калия и магния в организме, в составе комплексной терапии ишемической болезни сердца, аритмии и т.п. Тавамин (валин, лейцин, изолейцин, таурин) капсулы для лечения заболеваний печени.
- 26. Триптофан применяется для лечения расстройствасна, в комплексной терапии для лечения алкогольной и наркотической зависимости. Глицин регулирует обмен веществ, способствует нормализации и активации процессов защитного замедления в центральной нервной системе, снижает психическое и эмоциональное напряжение, повышает умственную работоспособность Метионин при заболеваниях печени (гепатиты, гепатозы, циррозы), протекающие с жировой инфильтрацией гепатоцитов; предупреждение токсических поражений печени мышьяком, хлороформом, бензолом, алкоголем; дефицит белка различного происхождения в составе комбинированной терапии
Editor's Notes
- #18 В промышленном производстве L-лизина используются штаммы Corynebacterium glutamicum. L-Лизин образуется из диаминопимелиновой кислоты, которая в свою очередь получается из оксалоацетата в результате многоступенчатой реакции конденсации аспарагиновой кислоты и пирувата. В диких штаммах в качестве побочных продуктов этой многостадийной реакции образуются предшественники L-треонина и L-метионина, что снижает выход L-лизина. В штаммах-суперпродуцентах этот побочный путь блокирован благодаря мутациям в генах соответствующих ферментов (используют также ауксотрофные мутантные штаммы, для метаболизма которых необходимо присутствие специфических веществ, например гомосерина).
- #24 Еще одна технология получения L-лизина основана на использовании клеток Cryptococcus laurentii. В настоящее время эта технология практически не реализуется, так как не может конкурировать с технологией с использованием C. glutamicum. Технология заключается в производстве L-лизина и D,L-α-амино-ε-капролактама в биореакторе, в который добавлены высушенные ацетоном клетки Cryptococcus laurentii. Дешевым сырьем в данном случае являются отходы производства нейлона, селективный гидролиз которых приводит к образованию D,L-α-амино-ε-капролактама, который в свою очередь подвергается рацемизации ферментом D-аминокапролактамрацемазой, выделенной из штамма Achromobacterobae.
- #25 В настоящее время клонированы гены почти всех ферментов, участвующих в биосинтезе L-лизина и его регуляции, поэтому методы генетической инженерии играют решающую роль в получении штаммов, характеризующихся высоким уровнем синтеза L-лизина. В современном производстве используются штаммы, в которых выход продукта достигает 120 г/л через 60 ч роста. Как правило, применяют воздушно-проточную ферментацию в реакторах объемом до 500 м3. В среду роста C. glutamicum в качестве источника углерода добавляют растворы сахаров. Уровень биотина в среде поддерживают на постоянном уровне – около 30 мкг/л. После окончания синтеза и удаления клеток L-лизин выделяют на ионообменной колонке или путем распылительной сушки.
- #27 Алкогро (треонин и пиридоксин) – для улучшения работоспособности и внимания, для лечения абстинентного синдрома. Лейаргунал (лейцин, аргинина гидрохлорид, инозин) – в составе комплексной терапии хронического периодонтита, у пациентов с клиникой затяжных пневмоний и хронических бронхитов. Аспаргит (аргинина гидрохлорид и ацетилсаициловая кислота) – антиагрегантная терапия и повышение толерантности к физической нагрузке у пациентов со стабильной стенокардией. Лейцин – таблетки, применяется в качестве корректора аминокислотного дисбаланса у пациентов с онкологическими заболеваниями при проведении специфического лечения. Громецин – таблетки, применяется в составе комплексной терапии функциональных и органических заболеваний нервной систем