aminoacids biosyntesis

1. Лекция 4. Биотехнология
первичных метаболитов
Лектор: Сагындыкова Ляззат Жумабековна,
преподаватель кафедры фармацевтических дисциплин,
магистр медицинских наук

2. План лекции
1. Получение аминокислот, ферментов биотехнологическими
методами.
2. Биотехнология вторичных метаболитов.

3. Аминокислоты – это основные
структурные единицы белковых
молекул, в которых одновременно
содержатся карбоксильные и
аминные группы. Аминокислота
является производным
карбоновой кислоты, у которой
замещены один или более атомов
водорода в их радикалах на одну
или более аминогрупп с общей
формулой.
Рис. 1. Структура аминокислоты

4. Заменимые аминокислоты Незаменимые аминокислоты
ГЛИЦИН
АЛАНИН
ЦИСТЕИН (ЦИСТИН)
АСПАРАГИНОВАЯ КИСЛОТА
ТИРОЗИН
АСПАРГИН
СЕРИН
ГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА
ГЛУТАМИН
ПРОЛИН
ВАЛИН
ЛЕЙЦИН
ИЗОЛЕЙЦИН
ТРЕОНИН
МЕТИОНИН
ФЕНИЛАЛАНИН
ТРИПТОФАН
ЛИЗИН
ГИСТИДИН
АРГИНИН
В организме человека синтезируется только 10 из 20 известных
аминокислот. Это так называемые заменимые аминокислоты. Эти
аминокислоты могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и
липидов. Остальные 10 аминокислот не синтезируются в организме,
поэтому они были названы жизненно необходимыми, или незаменимыми
аминокислотами.
Таблица 1 – Перечень заменимых и незаменимых аминокислот

5. Аминокислоты – оптически активные соединения. Физиологически и
терапевтически активны L-формы аминокислот. Все входящие в состав
живых организмов α-аминокислоты, кроме глицина, содержат
асимметричный атом углерода (треонин и изолейцин содержат два
асимметричных атома). Почти все встречающиеся в природе α-аминокислоты
имеют L-форму.
Стереоспецифичны транспорт и метаболизм аминокислот, проницаемость
аминокислот для клеток и другие функции.
Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать
эквимолярную смесь L- и D-аминокислот (рацематы), дальнейшее разделение
которых представляет трудную задачу и экономически неэффективно.
Аминокислоты широко применяют в медицине:
• для терапии послеоперационных больных,
• при лечении заболеваний ЦНС,
• язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, печени
(серотонин, аспарагин, валин, гистидин, глицин, глутамин и глутаминовая
кислота, изолейцин, лейцин, метионин, пролин, тирозин, триптофан,
фенилаланин, цистеин).

6. Коммерческие препараты аминокислот получают, в основном, при помощи
четырех методов:
• биологический – экстракция из белковых гидролизатов (растений,
животных, микроорганизмов);
• микробиологический – биосинтез или очистка продуктов метаболизма
бактерий – Corynebacterium, Brevi bacterium spp, (в частности, Brevibacterium
flavum), Bacillus, Aerobacter, Micobacterium, Eschirichia и др.;
• химико-энзиматический – энзиматическая трансформация химически
синтезированных предшественников аминокислот с образованием активных
L-изомеров (например, синтез аспарагиновой кислоты из фумаровой с
использованием клеток кишечной палочки и синтез L-фенилаланина из
коричной кислоты с использованием клеток дрожжей);
• химический синтез – использование тонкого органического синтеза.
Наиболее часто для получения аминокислот используют
микробиологический и химико-энзиматический методы.

7. Гидролиз природного белоксодержащего сырья
(биологический способ)
Условия гидролиза природного белоксодержащего сырья
достаточно «жесткие». Отходы пищевой и молочной
промышленности выдерживают при 105 °С 24–48 ч в
вакууме в присутствии 20 %-й соляной кислоты. При
кислотном гидролизе полностью разрушаются триптофан
и достаточно значительны потери цистеина, метионина и
тирозина (до 30 %). Белковые гидролизаты сегодня
применяют в животноводстве, пищевой и
микробиологической промышленности.

8. № Штамм-продуцент
аминокислот
Синтезируемые
аминокислоты
1 Brevibacterium flavum Аргинин, Гистидин, Изолейцин, Лизин,
Валин, Фенилаланин, Треонин, Тирозин
2 Corynebacterium glutamicum Аргинин, Гистидин, Изолейцин, Лизин,
Фенилаланин, Серин, Валин, Тирозин
3 Bacillus subtilis Изолейцин, Триптофан
4 Serratia marcescens Аргинин, Гистидин, Изолейцин, Лейцин
5 Micrococcus Триптофан
6 Candida utils Триптофан
7 E. Coli Треонин
Таблица 2 – Штаммы-продуценты аминокислот

9. Химический синтез дает рацемат – продукт, содержащий как L-,
так и D-формы аминокислот. За исключением глицина, который не
имеет оптически активных изомеров, и метионина, который
усваивается организмом в обеих формах. Причем, D-изомеры
обладают токсичностью. Получение оптически активных L-
изомеров аминокислот из продуктов гидролиза природных
материалов растительного и животного происхождения связано с
многоступенчатой и дорогостоящей очисткой.
Разделение D- и L-форм аминокислот – трудная и трудоемкая
задача, первым этапом которой является получение
диастереомеров – производных аминокислот с двумя оптически
активными центрами. Диастереомеры отделяют друг от друга
методами дробной кристаллизации или избирательной экстракции
и т.п.

10. который далее используется в качестве карбонильного компонента
синтеза Штреккера:
CH3SCH2CH2CHO + HCN + NH3 = CH3SCH2CH2CH(NH2)CN
CH3SCH2CH2CH(NH2)CN + H2O = CH3SCH2CH2CH(NH2)COOH
Промышленный синтез DL-метионина (α-амино-γ-
метилтиомасляная кислота) осуществляют исходя из
акролеина, непредельного альдегида
H2C = CH – CHO
На первой стадии присоединением метилмеркаптана к
акролеину синтезируют 3-метилтиопропионовый
альдегид:
CH3SH + H2C = CH – CHO = CH3SCH2CH2CHO

11. Биотехнологическое получение аминокислот включает в себя как прямую
микробную ферментацию, так и микробиологический или ферментативный синтез из
предшественников. Используемые в промышленности микроорганизмы можно
разделить на:
• дикие штаммы,
• ауксотрофные мутанты,
• регуляторные мутанты
• ауксотрофные регуляторные мутанты.
Промышленные штаммы, как правило, несут несколько мутаций, затрагивающих
механизмы регуляции целевой аминокислоты и её предшественников.
Промышленный штамм должен обладать способностью к сверхсинтезу нужной
аминокислоты. Для этой цели выбирают полиауксотрофные мутанты, т.е. те клетки
микроорганизмов, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно
синтезировать необходимые для роста и развития клетки различные аминокислоты, а
с другой – приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты.

12. Биотехнологическое получение аминокислот, основанное на способности
микроорганизмов синтезировать все L-аминокислоты, является сегодня широко
распространенным.
Микробиологическое промышленное производство L-аминокислот можно
осуществлять по двум технологическим схемам (двухступенчатый способ).
Таким путем получают, в частности, L-лизин.
Первая
ступень
• предполагает образование и подготовку предшественника, а
также биосинтез ферментного препарата микробного
происхождения, который будет трансформировать
предшественник в целевую аминокислоту.
Вторая
ступень
• процесс трансформации полученного на 1-й стадии
предшественника в аминокислоту с помощью ферментных
систем микроорганизмов.

13. Схема
двухступенчатого
биосинтеза

14. Пути синтеза большинства аминокислот взаимосвязаны. При этом одни
аминокислоты являются предшественниками для биосинтеза других.
Например,
• L-пируват является предшественником аланина, валина, лейцина;
• 3-фосфо-глицерат является предшественником серина, глицина, цистеина;
• щавелево-уксусная кислота – предшественник аспартата, аспарагина,
метионина, лизина, треонина, изолейцина;
• α-кетоглутаровая кислота – предшественник глутамата, глутамина, аргинина,
пролина;
• фосфоэнолпируват + эритрозо-4-фосфат – предшественник фенилаланина,
тирозина, триптофана;
• 5-фосфорибозил-1-пирофосфат + АТФ – предшественник гистидина.
Одноступенчатый способ синтеза аминокислот с помощью микроорганизмов
основан на культивировании строго определенного штамма-продуцента
целевой аминокислоты на среде определенного состава при соответствующих
параметрах ферментационного процесса.

15. Этапы синтеза аминокислот микроорганизмами:
1. Процесс фиксации азота: Некоторые микроорганизмы способны преобразовывать азот из
атмосферы в аммиак или другие формы, доступные для использования в биологических процессах.
Это особенно важно для синтеза аминокислот, так как азот является ключевым компонентом.
N2​+3H2​→2NH3
2. Транспорт аммиака: После фиксации азота, аммиак транспортируется в клетку. В бактериях,
например, это может происходить через специализированные переносчики аммиака.
3. Синтез аминокислот: Первоначально, общая аминокислотная структура может быть
синтезирована через цикл Кребса и другие метаболические пути. Затем специфичные
ферментативные реакции добавляют аминогруппы и формируют конечные аминокислоты.
Ключевые молекулы, такие как α-кетокислоты, могут быть использованы в различных реакциях,
включая трансаминирование и добавление аминогруппы.
Примерный общий путь для глутамина:
α−Ketoglutarate+ NH4+ + ATP → Glutamate + NADPH + H+ + CO2
Затем, через дополнительные реакции, глутамин может быть синтезирован из глутамата.
4. Регуляция путей синтеза: Синтез аминокислот обычно регулируется фидбек-механизмами (т.е.
по принципу обратной связи). Если уровень определенной аминокислоты в клетке достигает
достаточного уровня, процессы ее синтеза могут замедлиться или приостановиться. Это
обеспечивает баланс и эффективное использование ресурсов.

16. Целью биотехнолога является нарушение этих систем регуляции с
дальнейшим отбором ауксотрофных мутантов на селективных средах с
использованием мутагенов (УФ, рентгеновские лучи, нитрозосоединения и
др.).
Важно, что получение ауксотрофных мутантов-продуцентов аминокислоты
возможно только для микроорганизмов с разветвленной цепью биосинтеза,
т.е. по крайней мере две аминокислоты должны синтезироваться из одного
предшественника.
У таких ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците
другой не приводит к подавлению активности первого фермента. Однако
аминокислота, биосинтез которой нарушен, должна быть добавлена в
ограниченном количестве.
Одним из подходов к получению штаммов с повышенной способностью к
синтезу аминокислот является получение мутантов с нарушенной
регуляцией биосинтеза аминокислот. Отбор таких мутантов проводят in
vitro на средах с повышенным содержанием аминокислот или их аналогов.

17. Синтез
лизина
Одноступенчатого
микробиологического синтез
промышленное культивирование ауксотрофных мутантов бактерий из
рода Corynebacterium
Химико-энзиматический способ
L-ЛИЗИН (LYSIN)
(Алифатическая двухосновная аминокислота)
В фармации используется в виде лизина
гидрохлорида.
Лизин выполняет важнейшие биохимические
функции: способствует секреции пищеварительных
ферментов и транспорт кальция в клетки, улучшает
общий азотный баланс в организме.

18. Одноступенчатый микробиологический синтез лизина
В клетках бактерий лизин синтезируется из аспарагиновой
кислоты через ряд промежуточных этапов, связанных с
образованием альдегида аспарагиновой кислоты. Альдегид
аспарагиновой кислоты является также одним из
предшественников в синтезе аминокислот – треонина, метионина
и изолейцина. Процесс синтеза аминокислоты начинается
фосфорилированием аспарагиновой кислоты с участием
аллостерического фермента аспартаткиназы, активность которого
ингибируется совместным действием двух аминокислот – лизина и
треонина, если они накапливаются в клетках бактерий в
избыточной концентрации (feedback-регуляция). Если понизить
концентрацию одной из этих аминокислот, то синтез другой будет
осуществляться даже при условии, когда она накапливается в
довольно высокой концентрации. Поэтому для снятия регуляции
синтеза лизина необходимо прекратить образование треонина на
стадии превращения альдегида аспарагиновой кислоты в

19. Схема синтеза
лизина

20. Состав питательной среды:
• источника углерода: смесь уксусной кислоты и свекловичную
мелассу, небольшие добавки сахара в среду (около 1 %) -
повышают выход лизина на 30–50 %;
• источника азота: соли аммония, мочевина,:
• источники БАВ: кукурузный экстракт (1,2–1,5 % по содержанию
сухих веществ), гидролизаты дрожжей, для жизнедеятельности
микроорганизмов микро-и макроэлементы, витамины (биотин и
др.).
Среда должна содержать в 1 литре: 200 мг метионина, 800 мг
треонина, 15–20 мкг биотина.
Соотношение углерода и азота в среде оптимально как 11 : 1.
В процессе культивирования микроорганизмов обеспечивается
подача стерильного воздуха с помощью специальных турбинных
мешалок, для предотвращения вспенивания субстрата и клеточной
суспензии в среду культивирования добавляют пеногасители.

21. Технологический процесс:
Посевной материал вначале выращивается в посевных
аппаратах при 28–32°C, рН 7,0–7,2 в течение 18–24 ч,
полученная суспензия клеток подается в производственные
ферментеры, в которых поддерживается постоянный режим
аэрации, избыточное давление 20–30 кПа, непрерывное
перемешивание, контроль за всеми параметрами среды.
Культивирование осуществляется в строго стерильной
глубинной аэробной периодической культуре. Время
ферментации составляет 55–72 ч. Накопление в
культуральной жидкости лизина начинается через 25–30 ч
после начала выращивания промышленной культуры и к
концу ферментации достигает 40-50 г/л.

22. Очистка готового продукта:
Культуральную жидкость отделяют от культуры клеток продуцента
фильтрованием и используют для получения лизина. Для получения
очищенной субстанции лизина культуральную жидкость после
фильтрования подкисляют соляной кислотой до рН 1,6–2.
Образовавшийся в результате взаимодействия с соляной кислотой
раствор монохлоргидрата лизина направляют на колонки с
катионитом, где происходит сорбция аминокислоты и отделение ее от
культуральной жидкости. Затем проводят десорбцию аминокислоты
элюированием 0,5–5 % раствором аммиака.
Элюат выпаривают под вакуумом при 60°C до концентрации 30–50
%, после подкисленный соляной кислотой раствор монохлоргидрата
высушивают.
Путем перекристаллизации полученной соли можно получить
субстанцию с содержанием монохлоргидрата лизина в количестве
97–98 %.

23. Химико-энзиматический способ получения лизина
В ряде стран (Японии, США и др.) для получения лизина применяется химико-
энзиматический метод, позволяющий создать высокоэффективные
технологии, основанные на ферментативной конверсии в лизин α-амино-ε-
капролактама, который получают химическим методом из циклогексана:
Циклогексан ► D-, L-капролактам ► L-лизин
В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь D- и L-
капролактама, направляющаяся в реактор с гидролазой α-амино-ε-
капролактама, который катализирует превращение L-капролактама в L-лизин.
D-изомер капролактама затем превращается в L-изомер с помощью
специфической рацемазы. При такой технологии получения лизина его
содержание в реакционной смеси по завершении рабочего цикла достигает
свыше 150 г/л. Продуценты гидролазы α-амино-ε-капролактама – некоторые
штаммы дрожжей из рода Cryptococcus, Candida, Trichosporon, которые
выращивают в щелочной оптимизированной для синтеза фермента
питательной среде, содержащей активаторы – ионы магния, марганца и
цинка. Для ферментативной реакции превращения капролактама в лизин
может использоваться клеточная суспензия дрожжевых клеток с активным
ферментом, клеточный экстракт (после разрушения и отделения клеток) или
очищенный фермент. Продуценты рацемазы – бактерии Achromobacter,
Flavobacterium и др.

25. Препараты аминокислот
Тетракард
(аргинина гидрохлорид, лизина
гидрохлорид, таурин,
ацетилсалициловая кислота)
в составе комплексной терапии
стабильной стенокардии у
пациентов без перенесенного
инфаркта миокарда.
Аспаркам
(калия и магния аспартат)
применяется при дефиците
калия и магния в организме, в
составе комплексной терапии
ишемической болезни сердца,
аритмии и т.п.
Тавамин
(валин, лейцин,
изолейцин, таурин)
капсулы для лечения
заболеваний печени.

26. Триптофан
применяется для лечения
расстройства сна, в комплексной
терапии для лечения
алкогольной и наркотической
зависимости.
Глицин
регулирует обмен веществ,
способствует нормализации и
активации процессов
защитного замедления в
центральной нервной системе,
снижает психическое и
эмоциональное напряжение,
повышает умственную
работоспособность
Метионин
при заболеваниях печени (гепатиты,
гепатозы, циррозы), протекающие с
жировой инфильтрацией
гепатоцитов; предупреждение
токсических поражений печени
мышьяком, хлороформом,
бензолом, алкоголем; дефицит
белка различного происхождения в
составе комбинированной терапии